Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Die allgemeinen Ziele dieser Verfahren bestehen darin, Zebrafische als Influenza-Modell zu verwenden, um die Immunantwort des Wirts auf eine Virusinfektion zu untersuchen und antivirale Wirkstoffe zu screenen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Influenza zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Phagozyten bei der Immunität und Entzündung während einer Infektion spielen, sowie die Wirksamkeit potenzieller antiviraler Therapien zu ermitteln. Ein Zebrafisch-Modell der Influenza ermöglicht es, zuvor unbeantwortete Fragen zu klären, da die entwicklungsbedingte optische Transparenz der Zebrafische sowie die Möglichkeit, mittel- bis hochdurchsatzfähige Assays durchzuführen, genutzt werden können.

Nach der Zubereitung der Reagenzien und der Aufzucht der Embryonen bis zum gewünschten Entwicklungsstadium gemäß dem schriftlichen Protokoll, entchorionieren Sie am Tag des Experiments die Embryonen mit Pinzette Nummer fünf. Wenn die Viren APR-8 oder X31 verwendet werden, verdünnen Sie die Viren in einer laminaren Luftströmungshaube auf drei Komma drei mal 10 hoch sechs eifektiöse Dosis 50 Prozent in steriler, eiskalter PBS-Lösung, die mit null Komma zwei fünf Prozent Phenolrot ergänzt wurde. Bei Verwendung des NS1-GFP-Stamms verdünnen Sie das Virus auf etwa ein Komma fünf mal 10 hoch zwei PFU pro Nanoliter.

Gleichzeitig wird eine Kontrolle mit Allantoisflüssigkeit aus nicht infizierten Hühnereiern eingerichtet, die ähnlich wie das Virus verdünnt wird. Anschließend pipettieren Sie mit Mikrolader-Spitzen die Viruslösung in Mikroinjektionsnadeln und setzen die Mikroinjektionsnadel in den entsprechenden Halter des Injektionsgeräts ein. Nachdem die Nadel gemäß dem Textprotokoll abgeschnitten wurde, stellen Sie den Druck und die Zeitparameter am Druckinjektor ein und/oder schneiden Sie die Nadelspitze erneut zu, bis das gewünschte Injektionsvolumen erreicht ist.

Nach der Anästhesierung der Embryonen überführen Sie mithilfe einer Plastikpipette 10 bis 20 Embryonen auf eine zweiprozentige Agaroseplatte und pipettieren Sie die überschüssige Flüssigkeit ab. Richten Sie unter dem Stereomikroskop die Embryonen vorsichtig aus und orientieren Sie sie mit einer angeschmolzenen und verschlossenen Borosilikatglas-Kapillare, sodass der Ductus Cuvieri oder die hintere Kardinalvene mit der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist. Führen Sie zur Durchführung der Mikroinjektion von IAV die Mikroinjektionsnadel vorsichtig in den Ductus Cuvieri oder die hintere Kardinalvene ein.

Drücken Sie dann das Fußpedal, um das gewünschte Volumen von IAV in das Kreislaufsystem des Embryos zu injizieren. Um eine systemische Infektion zu erzielen, ist es entscheidend, dass der Injektionsbolus in den Kreislauf aufgenommen und im gesamten Körper verteilt wird. Sammelt sich der Bolus am Injektionsort, nehmen Sie den Embryo aus dem Experiment heraus und setzen ihn euthanasiert.

Fünf Tage nach der Befruchtung bereiten Sie die Nadeln wie zuvor in diesem Video beschrieben vor. Richten Sie die TG MPX mCherry-Larven mit aufgeblähten Schwimmblasen wie gerade gezeigt aus, platzieren Sie die Larven jedoch so, dass die Nadel die Schwimmblase durchdringen und das Virus in den hinteren Teil der Schwimmblase abgegeben werden kann. Führen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig in die Schwimmblase ein und injizieren Sie das gewünschte Volumen in den hinteren Bereich des Organs.

Die Injektionslösung sollte sich im hinteren Bereich sammeln und die Luftblase der Schwimmblase nach vorne verdrängen. Um eine Infektion der Schwimmblase zu erzielen, ist es entscheidend, dass sich der Injektionsbolus im hinteren Bereich der Schwimmblase sammelt und dadurch die Luftblase nach vorne verdrängt wird. Die GFP-Expression sollte bereits drei Stunden nach der Injektion sichtbar werden.

Nach Abschluss der Injektionen, einschließlich der Kontrolllösungen, überführen Sie die Larven in Petrischalen mit steriler Ei-Wasser-Lösung und inkubieren die Fische bei 33 Grad Celsius. Zur Durchführung der antiviralen Behandlung ersetzen Sie drei Stunden nach der Infektion das Ei-Wasser der mit NS1-GFP und Kontrollinfektion behandelten Fische durch steriles Wasser, das 0, 16,7 oder 33,3 Nanogramm pro Milliliter Zanamivir enthält. Beginnen Sie 24 bis 48 Stunden nach der Injektion mit der Aufzeichnung von Beobachtungen zur Infektionsdynamik im Zusammenhang mit der Krankheitspathologie, einschließlich Anzeichen von Lethargie und Ödemen, Unterschieden in der Pigmentierung, okulären und kraniofazialen Fehlbildungen sowie Lordose.

Notieren Sie alle 24 Stunden über einen Zeitraum von fünf Tagen nach der Infektion die Anzahl der toten, kranken und gesunden Larven. Tragen Sie die Daten als gestapeltes Balkendiagramm auf, wobei die Prozentanteile gesunder, kranker oder toter Fische auf der Y-Achse und die Behandlungsgruppe auf der X-Achse abgetragen werden. Um Zebrafische zur Bildgebung vorzubereiten, überführen Sie eine einzelne transgene MPX mCherry-Larve, die mit NS1-GFP infiziert wurde, in eine Vertiefung einer 24-Loch-Glasbodenplatte und geben einen kleinen Tropfen Ei-Wasser hinzu.

Wiederholen Sie den Vorgang mit anderen mit IAV infizierten und Kontrollfischen. Geben Sie langsam einprozentiges Agarose-Embryomontagemedium in jede Vertiefung, wobei darauf geachtet werden sollte, keine großen Blasen einzuführen. Korrigieren Sie vorsichtig die Position der Larve, sodass jede seitlich montiert ist.

Nachdem das Agarose erstarrt ist, füllen Sie vorsichtig die einzelnen Vertiefungen mit Ei-Wasser, das 200 Mikrogramm pro Liter Tricain enthält. Erfassen Sie mit einem konfokalen Mikroskop und einem 20-fachen Objektiv, das auf die Schwimmblase fokussiert ist, eine z-Stapel-Reihe von Hellfeld- und Fluoreszenzbildern. Quantifizieren und vergleichen Sie die Anzahl der MPX-mCherry-positiven Neutrophilen in den Schwimmblasen von mit IAV infizierten und kontrollinjizierten Zebrabärblingen.

Hier gezeigte Daten veranschaulichen, wie eine systemische IAV-Infektion bei Zebrafischen zur Prüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen genutzt werden kann. Embryonen im Alter von 48 Stunden post Befruchtung (HPF) wurden über den Ductus Cuvieri mit APR8, X31 oder NS1-GFP injiziert, um eine virale Infektion auszulösen. Als Kontrollen für die virale Infektion diente Embryonen, die ebenfalls im Alter von 48 HPF injiziert wurden.

48 Stunden nach der Infektion zeigten Zebrafische, die mit IAV injiziert worden waren, Anzeichen von Perikarderguss und Kreislaufstillstand mit Erythrozyten im gesamten Perikardium. Infizierte Fische, die Zanamivir nicht ausgesetzt waren, wiesen Merkmale eines Ödems bei systemischer GFP-Expression auf. Bei NS1-GFP-infizierten Larven, die Zanamivir ausgesetzt waren, wurde eine verminderte makroskopische Pathologie in der GFP-Fluoreszenz beobachtet.

In diesem Experiment mit einem lokalisierten Infektionsmodell des Zebrabärblingschwimmblasen wurde das NS1-GFP-Virus in die Schwimmblasen von transgenen MPX mCherry-Larven fünf Tage nach der Befruchtung injiziert, und die Rekrutierung von mCherry-markierten Neutrophilen in die Schwimmblase wurde verfolgt. Zwanzig Stunden nach der Infektion wurde im Vergleich zu den mit PBS behandelten Kontrollen eine beträchtliche Migration von Neutrophilen in die Schwimmblasen der mit IAV infizierten Fische beobachtet, was darauf hindeutet, dass IAV Neutrophile in die Schwimmblase rekrutieren kann, ähnlich wie es Neutrophile in die menschliche Lunge rekrutiert. Die Bedeutung dieser Methoden erstreckt sich auf antivirale Therapien, da sie entscheidende Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Influenza-A-Virus oder IAV liefern können, die letztendlich klinische Anwendungen finden könnten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Influenza äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie eine Impfung sowie das Tragen der geeigneten PSA, während Sie dieses Verfahren durchführen.