Name: Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Lernen Sie die Tandem-Affinitätsreinigung zur Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer Interaktoren und post-translationaler Modifikationen.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) des NIH unter der Fördernummer R01AI114362 und dem Welch Foundation Grant I-1782 an Iván D'Orso unterstützt.

1. Plating Cells <ol><li> Einen Tag vor der Transfektion Platte 3,5 x 10 6 HEK293T - Zellen in 10 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml Lager) pro 100 mm Schale. Platte 3 bis 5 100 mm-Schalen pro Versuch / Zustand ausreichend Protein Erholung zu gewährleisten. HINWEIS: Die Anzahl der Platten hat für jedes Experiment / Bedingung bestimmt werden, die auf den Expressionsspiegel und die Löslichkeit des Proteinkomplex von Interesse verlassen wird. Alternativ, falls in größerem Maßstab Reinigung benötigt wird, können Zelllinien angepasst werden in Suspensionen in spinner flasks 2 zu wachsen, aber dieses Verfahren nicht für transiente Transfektionen arbeiten. </li></ol> 2. Transfektion von Zellen oder Induzierende stabilen Zelllinien <ol><li> Am folgenden Tag, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. 80% konfluent vor proce - Zellen müssen 70 seineding. </li><li> Transfizieren der Zellen mit einer Gesamtmischung von 7 &amp; mgr; g Plasmid-DNA und 21 &amp; mgr; l Transfektionsreagenz pro 100 mm-Schale. Transfizieren Zellen mit einem Vektor die GFP exprimieren (Tabelle 1) als Kontrolle für die Transfektionseffizienz. HINWEIS: Bei Verwendung eines HEK293-T-REx oder ähnliche stabile Zelllinie, die die Expression von zwei oder komplexeres Untereinheiten in Reaktion auf Doxycyclin 14, 15 induziert wird der Induktor haben zu den Zellen hinzugefügt werden und für 48 Stunden inkubiert. Ähnlich wird eine stabile Zelllinie, die die Expression von GFP bei der Zugabe des Induktors auch zu Validierungszwecken erforderlich wäre induziert. Gehen 2.7 zu treten. </li><li> Bereiten Sie die Transfektionsgemischs pro 100 mm Schale. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 7 ug Gesamt-Plasmid-DNA (entsprechend zwei oder mehreren Plasmiden) 500 ul DMEM unsupplementierten mischen. In einem separaten Reaktionsgefäß, mischen 500 ul unsupplementierten DMEM with 21 ul des Transfektionsreagenz. Wiederholen Sie für jede Transfektionsreaktion. </li><li> Pipette, um die Transfektionsreagenz Lösung in die Plasmid-DNA-Lösung (nicht zu verwechseln Lösungen in umgekehrter Reihenfolge). Mischen von mindestens 4 mal Pipettieren. </li><li> Inkubieren dieser Mischung bei Raumtemperatur für 10 bis 15 min, aber nicht länger als 15 min. </li><li> Neigen die Platte einen Medienspeicher zu schaffen und Pipetten sorgfältig das Transfektionsgemisch tropfenweise auf die innere Seite der Platte, ohne die Zellen zu stören. Bringen Sie das Gericht auf seine ursprüngliche flache Position und vorsichtig schwenken die Mischung zu verteilen. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2 (dieser Zustand im folgenden als &quot;Gewebekultur - Inkubator&quot; bezeichnet wird). Ersetzen Sie die Medien 5 Stunden nach der Transfektion (optional). </li></ol> 3. Prüfung Transfection oder Induction Efficiency <ol><li> Bei 24 Stunden nach der Transfektion visualisieren die Zellen unter einer Grippeorescent Mikroskop für die Transfektionseffizienz (oder Induktion von Steuer HEK293T-REx stabile Zelllinie GFP-exprimierenden) zu überprüfen. Inkubieren für weitere 24 Stunden. </li></ol> 4. STREP Affinitätsreinigung (STREP AP) <ol><li> Das Sammeln der Zellen <ol><li> Bei 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien und 8 ml kaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Pipette nach oben und unten Zellen von der Platte zu lösen. </li><li> Sammeln Sie und übertragen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Röhrchen und drehen Sie die Zellen bei 800 · g unten für 4 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den PBS Überstand. Wiederholen Sie den Spin-Down (800 × g für 1 min bei 4 ° C) restliche PBS zu beseitigen. Lagern Sie das Zellpellet bei -80 ° C für eine spätere Verwendung oder das Verfahren folgen unterhalb der Proteinreinigung fortzusetzen. </li></ol></li><li> Lyse der Zellen <ol><li> Resuspendieren der Pellets Zelle 5 × Zellpellet Volumen mit (~ 250 &amp; mgr; l pro Platte) Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, Protease - Inhibitor - Cocktail - Tablette, 5% v / v Glycerin und 1,0% NP-40) und übertragen die Zellsuspension auf eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> verwirbeln kurz die Suspension und Nutation für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Drehen, um die Zellsuspension bei 10000 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die löslichen Lysate in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Zellpellets. Sparen Sie 10% des endgültigen Volumens des löslichen Lysat als &quot;STREP AP Input&quot;. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Äquilibrieren der STREP Perlen HINWEIS: Verwenden Sie STREP Perlen zum ersten AP Schritt! Komplexe nach unten gezogen mit STREP Perlen als die deutlich mehr Protein erholen mit FLAG Perlen nach unten gezogen. <ol><li> Nehmen Sie (n 40 &amp; mgr; l ×) + n ul der 50% STREP Kügelchenaufschlämmung (n = Anzahl der Proben) und Spin-down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. HINWEIS: Verwenden Sie Weit mouthed Tipps Pipette Perlen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen 500 ul PLB an die Kügelchen. Nutiert die Perlen Gemisch 5 min bei 4 ° C. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. <ol><li> Wiederholen für insgesamt 3 Waschungen. Resuspendieren der Kügelchen in PLB auf ein Endvolumen von n × 40 &amp; mgr; l. </li></ol></li><li> Werden 40 ul 50% STREP Kügelchenaufschlämmung zu jedem Zelllysat Probe und nutiert für 2 h bei 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Spin down-Lösung bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und speichern als &quot;STREP AP Durchfluss (FT)&quot; bei 4 ° C. </li><li> Hinzufügen 500 ul von Strep AP Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 5% Glycerin und 0,2% NP-40) an die Kügelchen. Nutiert die Perlen Gemisch 5 min bei 4 ° C und Zentrifugation bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. <ol><li> Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Wäschen. <br/&gt; Hinweis: Vor der vierten Wäsche, übertragen Sie die Perlen-Lösung in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Protein Hintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist wichtig. </li></ol></li><li> Hinzufügen, 500 &amp; mgr; l Waschpuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA) und die Kügelchen äquilibrieren durch die Rohre zu invertieren. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Eluieren des Proteins von Interesse mit 50 ul von Strep Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 2,5 mM Desthiobiotin). Vortex bei 800 Upm für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Spin down die Perlen bei 1.500 × g für 1 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand. Dieser Anteil entspricht dem &quot;STREP AP Elution&quot; Probe. </li><li> Speichern Sie die Perlen Fraktion bei 4 ° C für eine zweite Elution, die auf die Hälfte der Menge an Protein mit der ersten Elution erhalten ergeben könnte. Aliquot 10% des Strep AP Elution zur Silberfärbung und / oder Western-Blotting16. </li></ol></li><li> Äquilibrieren der FLAG - Perlen <ol><li> Nehmen Sie (nx 16 &amp; mgr; l) + n ul FLAG Perlen-Lösung (n = Anzahl der Proben) und Spin-down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. HINWEIS: Verwenden Sie Weithals Tipps Pipette Perlen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen 500 ul FLAG Waschpuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1% NP-40) an die Kügelchen. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Wiederholen für insgesamt 3 Waschungen. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in FLAG Waschpuffer auf ein Endvolumen von 16 &amp; mgr; l nx. </li><li> Format 16 ul der FLAG Kügelchenaufschlämmung zum verbleibenden STREP AP Elution und nutiert über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Spin down die FLAG Perlen Suspension bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C. Speichern Sie den Überstand und speichern als &quot;FLAG IP Flow-through&quot; (FT) bei 4 ° C. </li><li> In 50081; l von FLAG Waschpuffer zur Lösung. Nutiert für 5 min bei 4 ° C und Zentrifugation bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Waschungen und entfernen Sie den Überstand nach jeder Wäsche. HINWEIS: Vor der vierten Wäsche, übertragen Sie die Protein-Kügelchen-Lösung in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Hintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist wichtig. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus dem letzten Spin und fügen Sie 30 ul Waschpuffer FLAG, die 200 ng / ul FLAG-Peptid in die Kügelchen. Vortex bei 800 Upm für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Spin down die Suspension bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C. Ernten Sie den Überstand und lagern bei 4 ° C als &quot;FLAG IP Elution.&quot; HINWEIS: Die Elution Proben kann durch Silberfärbung und / oder Western - Blot unter Verwendung von Standardprotokollen 16, und sind bereit für die weitere Proteintests bestätigt werden. Wenn eine Western-Blot-Einrichtung, mit allen folgenden Proben durchgeführt: (1) STREP AP Eingang, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiauf, (4) FLAG IP FT, und (5) FLAG IP Elution. Volumes geladen wird für jedes Experiment ermittelt werden. Alle gesammelten Proben und Perlen können Kurzzeitspeicher gespeichert werden und bei -80 ° C zur Langzeitlagerung bei 4ºC. TAP Proben konnten durch Massenspektrometrie analysiert werden , um die Identität ihrer Komponenten zu überprüfen, neuartige posttranslationale Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, und / oder jede neue Protein - Wechselwirkung zu entdecken , mit dem gereinigten Komplex 2, 17. Zu diesem Zweck wird nach einer Coomassie-Gel oder Silberfärbung ausgeführt wird, können Bänder aus dem Gel ausgeschnitten werden, um einen sauberen Skalpell. Mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die Massenspektrometrie Methoden diskutieren wurden bisher 18 veröffentlicht, 19. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll für die Expression und Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen ist nicht auf die biochemische Charakterisierung solcher molekularen Anordnungen beschränkt, sondern kann auch für die Identifizierung von neuen Interaktoren und post-translationalen Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren könnte. Die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ist nicht beschränkt auf das, was in diesem Protokoll genannt wird; aber unsere Erfahrung legt nahe, dass STREP als e...

<html> Protein-Protein - Wechselwirkungen (PPIs) sind entscheidend für die genaue Regulierung der biologischen Prozesse 1, und weitere Studien auf diesen PPIs kann 2 um ihre Funktion zu informieren. Mehrere Ansätze wurden für die Untersuchung und Charakterisierung von EPI sowie für die de novo - Identifizierung neuer regulatorischer Proteinkomponenten entwickelt. Stanley Felder und Kollegen 1989, berichtete die Hefe - Zwei-Hybrid (Y2H) Test 3. Dieser Ansatz ermöglicht die unvoreingenommene und umfassende Identifizierung von Interaktoren (Beuten) für ein definiertes Protein von Interesse (Köder) in Saccharomyces cerevisiae. Neben der bemerkenswerten Nutzen für die Entdeckung PPIs kann der Y2H Assay zur Charakterisierung von Protein-Paare in Hefezellen verwendet werden, definieren eine minimale Interaktion Domänen und Identifizierung Mutationen, die derartige Wechselwirkungen aufheben. Durch Modifizieren der Y2H Assay kann PPIs auch in Säugerzellen untersucht werden,class = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variationen des Y2H Assay (zB Hefe Drei-Hybrid - System) kann auch zu studieren Protein-RNA und Protein-small organischen Liganden - Wechselwirkungen in Zellen angewendet werden. Ein weiteres häufig verwendetes Werkzeug PPIs in einem homologen System zu studieren , ist die Co-Immunopräzipitation (Co-IP) Assay 5. Durch die Verwendung eines Antikörpers für ein Protein von Interesse zu immunpräzipitieren, erlaubt die Co-IP-Assay Forscher PPIs in Zellen für die verschiedenen Umgebungsbedingungen und experimentelle Situationen zu überwachen. Die Verwendung von Epitop-markierten Proteinen (zB FLAG, Myc, Strep, und HA, ua) in der Affinitätsreinigung (AP) Verfahren , um die Isolierung von Proteinen aus komplexen Proteingemischen für mehrere Downstream - Assays erleichtert hat, einschließlich Western - Blot, silver stain und enzymatische Analyse. Jedoch keiner dieser früheren Ansätze ermöglichen die Isolierung von großen Mengen an Protein - Komplexe zur weiteren Charakterisierung einschließlich in vitro assays, Entdeckung der regulatorischen Untereinheiten durch Massenspektrometrie, und Identifizierung von post-translationalen Modifikationen. Eine verbesserte Version des AP Methode Tandem AP (TAP) bezeichnet, die EPI für die Untersuchung durch die Schaffung eines Fusionsproteins mit zwei Epitope ein Reinigungsverfahren, das 6 bis zwei aufeinanderfolgende APs gereinigt wird, 7. In diesem Artikel stellen wir eine Variation des TAP Verfahren zur Reinigung von Protein-Komplexe, in denen zwei Untereinheiten mit unterschiedlichen Epitopen markiert werden und dann durch zwei aufeinanderfolgende APs (STREP AP gefolgt von einer FLAG IP) gereinigt. Wir bieten zunächst eine minimalistische Übersicht über TAP (Abbildung 1) und dann eine detaillierte Beschreibung aller experimentellen Schritte (Abbildung 2), so dass die Forscher sie auf ihre Proteinkomplex von Interesse anwenden können. Um die Anwendbarkeit des TAP-Methode zu demonstrieren, haben wir uns für eine gut charakterisierte Cyclin-CDK-Komplex (bezeichnet als PTEFB - kinase), die aus der regulatorischen Untereinheit Cyclin T1 (CycT1) und eine kinase (CDK9) zusammengesetzt ist, und ist an der Regulation der Transkription durch RNA - Polymerase II (Pol II) 8, 9 beteiligt sind , 10. P-TEFb phosphoryliert die C-terminale Domäne von Pol II und den damit verbundenen negativen Elongationsfaktoren, die an der transkriptionalen Promotor Pausieren entlastet und erleichtert dadurch Transkriptionselongation 11, 12, 13. Bei dieser bekannten Interaktion im Auge, STREP-tagged CycT1 und FLAG-markierten CDK9 waren über in HEK293T-Zellen exprimiert. Eine reziproke TAP Experiment wurde mit Strep-tagged CDK9 und FLAG-markiertes CycT1 geführt weiter zu bestätigen, dass die Protein-Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Epitope. Die Zellen wurden gesammelt und lysiert 48 h nach der Transfektion. Das lösliche Lysat durch TAP gereinigt (STREP AP gefolgt von FLAGIP). Eingangs- und gereinigten Proteine wurden durch Western Blot und Silberfärbung (Abbildung 3) analysiert.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-Tag Elutionspuffer</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm & times 20 mm Style Dish Cell Culture behandelt nichtpyrogenes Polystyrol 20/Hülse</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48-Loch Mikrorohr-Schaumstoffgestell</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Shaker Rotisserie&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>Artikel-Nr.: 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affinity purification von proteinkomplexen aus eukaryotischen zellen

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Die Reinigung von aktivem Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexen ist von entscheidender Bedeutung für die Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten und de novo Identifizierung neuer Untereinheiten und post-translationalen Modifikationen. Bakterielle Systeme erlauben die für die Expression und Reinigung einer Vielzahl von einzelnen Polypeptide und Proteinkomplexen. Allerdings ist dieses System nicht die Reinigung von Protein - Untereinheiten ermöglichen , die post-translationale Modifikationen beinhalten (zB Phosphorylierung und Acetylierung) und die Identifizierung von neuen regulatorischen Untereinheiten , die nur present / ausgedrückt in der eukaryotischen System sind. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines neuen, robusten und effizienten tandem Affinitätsreinigung (TAP) Verfahren unter Verwendung von Strep- und FLAG-markierte Proteine, die die Reinigung von Proteinkomplexen mit transient oder stabil exprimiert erleichtert Epitop-markierten Proteinen aus eukaryontischen Zellen. Dieses Protokoll kann angewendet werden Prot zu charakterisierenein komplexer Funktionalität, zu entdecken, post-translationale Modifikationen an komplexen Untereinheiten und neuen Regulations komplexen Komponenten durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Bemerkenswert ist, kann diese TAP-Methode angewendet werden Proteinkomplexe durch eukaryotische oder pathogene (viral und bakteriell) Komponenten gebildet zu untersuchen, so dass eine Vielzahl von stromabwärts experimentellen Möglichkeiten ergibt. Wir schlagen vor, dass die Forscher mit Proteinkomplexen arbeiten in vielen verschiedenen Möglichkeiten, um diesen Ansatz nutzen können.

In diesem Artikel zeigen wir die Anwendbarkeit der TAP Verfahren zur gut charakterisierten CycT1-CDK9 Komplexes (auch als P-TEFb Kinase bekannt). Plasmide , kodierend Cyclin T1-Strep (CycT1: S) und CDK9-FLAG (CDK9: F) oder CDK9-Strep (CDK9: S) und Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (Tabelle 1), wurden in HEK293T - Zellen transfiziert . Negative Kontrollen enthalten Transfektionen mit einem leeren Vektor und dem CDK9: F...

Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Das übergeordnete Ziel dieser Tandem-Affinitätsreinigungsmethode besteht darin, aus eukaryotischen Zellen exprimierte Protein-Komplexe für die biochemische Charakterisierung und molekulare Analyse sowie zur Identifizierung neuartiger Interaktionspartner und posttranslationaler Modifikationen, die ihre Funktion regulieren, zu isolieren. Diese Methode ermöglicht die Reinigung intakter Protein-Komplexe aus eukaryotischen Zellen, um neuartige Interaktionspartner und regulatorische posttranslationale Modifikationen, die ihre Funktion feinabstimmen, zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine hohe Reinheit und Ausbeute an Protein-Komplexen für nachgeschaltete in-vitro-Anwendungen ermöglicht, um deren Funktion und Aktivität zu untersuchen.Die Zellen werden 48 Stunden nach der Transfektion aus der STREP-Affinitätsreinigung gewonnen. Entfernen Sie das Medium und geben Sie acht Milliliter kalte PBS hinzu. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen von der Platte zu lösen.Sammeln Sie die Zellsuspension und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 × g für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das PBS-Überstand. Zentrifugieren Sie erneut bei 800 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius, um eventuelle Reste von PBS zu entfernen.Um dieses Verfahren zu beginnen, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in der fünffachen Menge an Puffer für passive Lyse (PLB) im Vergleich zum Volumen des Zellpellets. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Vortexen Sie die Suspension kurz und inkubieren Sie sie unter leichtem Schütteln (Nutation) 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension mit 10.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das lösliche Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Zellpellet. Heben Sie 10 % des endgültigen Volumens des löslichen Lysats als STREP-AP-Eingabe auf und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Es ist wichtig, STREP-Kügelchen für den ersten Affinitätsreinigungsschritt zu verwenden, da Komplexe, die mit STREP-Kügelchen angereichert werden, signifikant mehr Protein zurückgewinnen als solche, die mit FLAG-Kügelchen angereichert werden. Entfernen Sie mithilfe einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die geeignete Menge der 50 %igen STREP-Kügelchenschlämme für die Affinitätsreinigung. Zentrifugieren Sie bei 1.500 × g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter PLB zu den Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie die Kügelchenmischung fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Zentrifugieren Sie erneut.Nach der dritten Wäsche das Überstand entfernen und die Perlen in PLB auf ein Endvolumen von n mal 40&nbsp;Mikroliter resuspendieren, wobei n die Anzahl der Proben ist. 40&nbsp;Mikroliter 50&nbsp;% STREP-Perlen-Suspension zu jeder Zelllysatprobe hinzufügen und zwei Stunden bei vier Grad Celsius nütieren. Während dieser Proteinproduktion und -gewinnung können mehrere Zellplatten verwendet werden, und die gleichen Proteinproben, die aus verschiedenen Platten lysiert wurden, können mit einem Teil der Perlen während der STREP-Affinitätsreinigung kombiniert werden.Nachdem die Gemische aus Zelllysat und STREP-Perlen-Suspension zwei Stunden lang inkubiert wurden, zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 1.500 × g und 4 °C. Heben Sie den Überstand als STREP AP-Durchfluss auf und lagern Sie ihn bei 4 °C. Geben Sie 500 µL STREP AP-Waschpuffer eins zu den Perlen hinzu.Schwenken Sie die Kügelchen fünf Minuten lang in der Puffermischung bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie zwei Minuten bei 1.500 × g und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie erneut mit 500 µL STREP AP-Waschpuffer eins. Nach der dritten Wäsche überführen Sie die Kügelchenlösung in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Proteinhintergrund zu verringern.Ein viertes Mal mit STREP AP-Waschpuffer eins waschen. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und 500 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen. Die Perlen durch Vorsichtiges Umstülpen der Röhrchen mischen und anschließend 2 Minuten bei 1.500 × g und 4 °C zentrifugieren.Verwerfen Sie den Überstand. Eluieren Sie das Protein von Interesse mit 50 µL STREP-Elutionspuffer. Vortexen Sie 15 Minuten bei 800 U/min bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 1.500 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand. Diese Fraktion entspricht der STREP AP-Elutionsprobe.Bewahren Sie die Bead-Fraktion bei vier Grad Celsius für eine zweite Elution auf. Aliquotieren Sie 10 % der STREP-AP-Elution für die Silberfärbung und/oder die Westernblot-Analyse. Um die Menge des Ausgangsmaterials für die nachfolgende FLAG-Immunpräzipitation zu erhöhen, können die erste und zweite STREP-Elution zusammengefasst werden, um die FLAG-Elution effizienter anzureichern.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Pipettenspitze mit großem Durchmesser verwenden, um die geeignete Menge an FLAG-Perlen-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1.500 × g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter FLAG-Waschpuffer zu den Perlen hinzu.Zentrifugieren bei 1.500 × g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Das Überstand entfernen und die Perlen erneut mit FLAG-Waschpuffer waschen. Nach dem dritten Waschschritt den Überstand entfernen und die Perlen in FLAG-Waschpuffer resuspendieren, sodass ein Endvolumen von n × 16 µL erreicht wird, wobei n die Anzahl der Proben angibt.Gebe 16 µL der FLAG-Bead-Suspension zur verbleibenden STREP-AP-Elution hinzu und inkubiere unter leichtem Schütteln über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der über Nacht erfolgten Inkubation der FLAG-Bead-Suspension mit der STREP-AP-Elution fahre mit der FLAG-Immunpräzipitation fort. Zentrifugiere die FLAG-Bead-Suspension bei 1.500 ×g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand als FLAG-IP-Durchfluss sammeln und bei vier Grad Celsius lagern. 500 Mikroliter FLAG-Waschpuffer zu den Kügelchen geben. Fünf Minuten bei vier Grad Celsius nütieren und anschließend zwei Minuten bei vier Grad Celsius mit 1.500 × g zentrifugieren.Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie erneut mit 500 Mikrolitern FLAG-Waschpuffer. Nach der dritten Waschung überführen Sie die Protein-Perlen-Lösung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um die Hintergrundreaktion zu verringern. Waschen Sie ein viertes Mal mit FLAG-Waschpuffer.Entfernen Sie den Überstand nach der letzten Zentrifugation und geben Sie 30 Mikroliter FLAG-Waschpuffer, der 200 Nanogramm pro Mikroliter FLAG-Peptid enthält, zu den Perlen hinzu. Vortexen Sie zwei Stunden lang bei 800 U/min und vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.500 × g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Das Überstand aufsammeln und bei vier Grad Celsius als FLAG-IP-Eluat lagern. In diesem Video wurde die Tandem-Affinitätsreinigung, also die TAP-Methode, auf den Cyclin-T1-CDK9-Komplex angewendet. STREP-markiertes Cyclin-T1 und FLAG-markiertes CDK9 wurden in HEK293-T-Zellen überexprimiert.Ein umgekehrtes Experiment wurde ebenfalls mit STREP-markiertem CDK9 und FLAG-markiertem Cyclin-T1 durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass FLAG-markiertes CKD9 zusammen mit STREP-markiertem Cyclin-T1 von den STREP-Beads miteluiert wurde, nicht jedoch in der negativen Kontrolle, bei der AP ohne STREP-markiertes Cyclin-T1 fehlte. Beide Proteine wurden in der FLAG-Elution nachgewiesen, was die Komplexbildung weiter bestätigte.Die umgekehrten TAP-Ergebnisse zeigen, dass Cyclin-T1 mit FLAG-Tag gemeinsam mit CDK9 mit STREP-Tag eluiert wurde, was weiter bestätigt, dass die Interaktion zwischen Cyclin-T1 und CDK9 unabhängig von den verwendeten Epitopen ist. Die Ergebnisse des TAP und des umgekehrten TAP wurden außerdem durch Silberfärbung analysiert. Die Sternchen kennzeichnen miteluierte Verunreinigungen.FLAG-markiertes CKD9 wurde gemeinsam mit STREP-markiertem Cyclin-T1 von den STREP-Kügelchen eluiert, jedoch nicht von der Kontroll-AP. In der anschließenden FLAG-Elution wurde STREP-markiertes Cyclin-T1 gemeinsam mit FLAG-markiertem CDK9 von den FLAG-Kügelchen eluiert. Ebenso wurde FLAG-markiertes Cyclin-T1 gemeinsam mit STREP-markiertem CDK9 von den STREP-Kügelchen eluiert, jedoch nicht von der Kontroll-AP. Der Protein-Protein-Komplex wurde nach dem zweiten FLAG-IP-Schritt effizient gewonnen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in zwei Tagen durchgeführt werden, beginnend damit, dass die Zellen zur Sammlung bereitstehen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Anzahl der Zellkulturschalen pro Experiment entsprechend zu erhöhen, um sicherzustellen, dass ausreichend Protein gewonnen und nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel bei der Identifizierung neuartiger regulatorischer Untereinheiten und/oder der Untersuchung posttranslationaler Modifikationen an Komplexuntereinheiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Protein-Protein-Interaktionen untersuchen, um neuartige Interaktoren und posttranslationale Modifikationen in eukaryotischen Zellen zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine mithilfe von STREP- und FLAG-Tags isoliert und charakterisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die...

Tandem-Affinitätsreinigungsassay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Die Methode der Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) wurde ausgiebig verwendet, um native Komplexe aus zellulärem Extrakt, hauptsächlich eukaryotisch, für die Proteomik zu isolieren. Hier stellen wir ein TAP-Methodenprotokoll vor, das für die Aufreinigung von nativen Komplexen für Strukturstudien optimiert ist.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Wir stellen Ihnen hier eine bewährte und getestete Protokoll für die Reinigung der Chloroplasten Import Proteinkomplexe (TOC-TIC-Komplex) mit der TAP-Tag. Das einstufige Affinität-Isolierung-Protokoll kann potenziell auf jedem Protein angewendet werden und verwendet werden, um neue Interaktionspartner identifizieren durch Massenspektrometrie.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Affinitätsreinigung eines humanen rekombinanten Proteins, der Lappen-Endonuklease 1 (FEN1), vor, das mit einem 6X-Histidin-Tag markiert wurde. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei unterschiedlichen immobilisierten Metallionensäulen für die Aufreinigung des markierten Proteins.

Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System 

Lernen Sie die Tandem-Affinitätsreinigung zur Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer Interaktoren und post-translationaler Modifikationen.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

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