Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen
January 26th, 2017
Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.
Das übergeordnete Ziel dieser Tandem-Affinitätsreinigungsmethode ist die Isolierung von Proteinkomplexen, die aus eukaryotischen Zellen exprimiert werden, für die biochemische Charakterisierung und molekulare Anordnungen sowie die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen, die ihre Funktion regulieren. Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung intakter Proteinkomplexe aus eukaryotischen Zellen, um neue Interaktoren und regulatorische posttranslationale Modifikationen zu identifizieren, die ihre Funktion feinabstimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hohe Reinheit und Ausbeute von Proteinkomplexen für nachgelagerte In-vitro-Anwendungen zur Untersuchung ihrer Funktion und Aktivität ermöglicht.
Die Zellen werden 48 Stunden nach der Transfektion aus der STREP-Affinitätsreinigung entnommen. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie acht Milliliter kaltes PBS hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen von der Platte zu lösen.
Sammeln Sie die Zellsuspension, geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen vier Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 800 g ab. Entfernen Sie den PBS-Überstand. Eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 800 g herunterschleudern, um alle PBS-Reste zu eliminieren.
Um dieses Verfahren zu starten, resuspendieren Sie jedes Zellpellet mit dem Fünffachen des Zellpelletvolumens von passivem Lysepuffer (PLB). Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Suspension kurz einwirbeln und 30 Minuten bei vier Grad Celsius nutatieren.
Schleudern Sie die Zellsuspension bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Übertragen Sie das lösliche Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Zellpellet. Speichern Sie 10 % des endgültigen Volumens des löslichen Lysats als STREP-AP-Eingabe und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.
Es ist wichtig, STREP-Kügelchen für den ersten Schritt der Affinitätsreinigung zu verwenden, da Komplexe, die mit STREP-Kügelchen abgezogen werden, deutlich mehr Protein zurückgewinnen als solche, die mit den FLAG-Kügelchen abgezogen werden. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung die entsprechende Menge an 50%iger STREP-Bead-Aufschlämmung für die Affinitätsreinigung. Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern.
Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter PLB zu den Kügelchen. Die Perlenmischung fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius nutatieren. Drehen Sie sich wieder nach unten.
Entfernen Sie nach dem dritten Waschen den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in PLB auf ein Endvolumen von n mal 40 Mikrolitern, wobei n die Anzahl der Proben ist. Geben Sie 40 Mikroliter 50%ige STREP-Bead-Slurry zu jeder Zelllysatprobe und nutatisieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Während dieser Proteinproduktion und -rückgewinnung können mehrere Zellplatten verwendet werden, und dieselben Proteinproben, die von verschiedenen Platten lysiert wurden, können während der STREP-Affinitätsreinigung mit einem Teil der Kügelchen kombiniert werden.
Nachdem die Mischungen aus Zelllysat und STREP-Bead-Slurry zwei Stunden lang inkubiert wurden, schleudern Sie sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.500 g herunter. Bewahren Sie den Überstand auf, während STREP AP durchfließt, und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Geben Sie 500 Mikroliter STREP AP Waschpuffer eins zu den Kügelchen.
Die Kügelchen in einer Puffermischung fünf Minuten bei vier Grad Celsius nutatisieren und bei 1.500 mal g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut mit 500 Mikrolitern STREP AP Waschpuffer eins. Übertragen Sie die Bead-Lösung nach dem dritten Waschen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Proteinhintergrund zu reduzieren.
Waschen Sie ein viertes Mal mit STREP AP Waschpuffer eins. Nach dem Schleudern den Überstand entfernen und 500 Mikroliter Waschbutter zwei hinzufügen. Äquilibrieren Sie die Kügelchen, indem Sie die Röhrchen umdrehen und dann zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.500 g nach unten schleudern.
Entsorgen Sie den Überstand. Eluieren Sie das Protein von Interesse mit 50 Mikrolitern STREP-Elutionspuffer. Vortex bei 800 U/min für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Schleudern Sie die Kügelchen bei 1.500 g für eine Minute bei vier Grad Celsius herunter. Sammelt den Überstand ein. Dieser Anteil entspricht der STREP AP-Elutionsprobe.
Bewahren Sie die Kügelchenfraktion bei vier Grad Celsius für eine zweite Elution auf. Aliquotieren Sie 10 % der STREP AP-Elution für die Silberfärbung und/oder Western Blotting. Um die Menge an Ausgangsmaterial für die anschließende FLAG-Immunpräzipitation zu erhöhen, können die erste und zweite STREP-Elution für eine effizientere Rückgewinnung der FLAG-Elution zusammengelegt werden.
Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung die entsprechende Menge der FLAG-Bead-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter FLAG Waschpuffer zu den Kügelchen.
Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Den Überstand entsorgen und erneut mit FLAG Waschpuffer waschen. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in FLAG Waschpuffer auf ein Endvolumen von n mal 16 Mikrolitern, wobei n die Anzahl der Proben ist.
Geben Sie 16 Mikroliter des FLAG-Bead-Slurry zur restlichen STREP AP-Elution und nutieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach einer Inkubation über Nacht mit der FLAG-Bead-Slurry und der STREP AP-Elution ist mit der FLAG-Immunpräzipitation fortzufahren. Schleudern Sie die FLAG Wulstsuspension bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunter.
Bewahren Sie den Überstand auf, während der FLAG-IP-Fluss durchfließt, und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Geben Sie 500 Mikroliter FLAG Waschpuffer zu den Kügelchen. Fünf Minuten bei vier Grad Celsius nutatisieren und bei 1.500 mal g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut mit 500 Mikrolitern FLAG Waschpuffer. Übertragen Sie die Proteinkügelchenlösung nach dem dritten Waschen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Hintergrund zu reduzieren. Ein viertes Mal mit FLAG Waschpuffer waschen.
Entfernen Sie den Überstand aus der letzten Schleuderung und fügen Sie den Kügelchen 30 Mikroliter FLAG-Waschpuffer hinzu, der 200 Nanogramm pro Mikroliter FLAG-Peptid enthält. Vortex bei 800 U/min für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden schleudern Sie die Suspension bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunter.
Ernten Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius als FLAG IP-Elution. In diesem Video wurde die Tandem-Affinitätsreinigungs- oder TAP-Methode auf den Cyclin-T1 CDK9-Komplex angewendet. STREP-markiertes Cyclin-T1 und FLAG-markiertes CKD9 wurden in HEK293 T-Zellen überexprimiert.
Ein reziprokes Experiment wurde auch mit STREP-markiertem CDK9 und FLAG-markiertem Cyclin-T1 durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass FLAG-markiertes CKD9 mit STREP-markiertem Cyclin-T1 aus den STREP-Kügelchen koeluierte, jedoch nicht in der Negativkontrolle, bei der AP STREP-markiertes Cyclin-T1 fehlte. Beide Proteine wurden in der FLAG-Elution nachgewiesen, was die Komplexbildung weiter bestätigte.
Die reziproken TAP-Ergebnisse zeigen, dass FLAG-markiertes Cyclin-T1 mit STREP-markiertem CDK9 koeluiert, was weiter bestätigt, dass die Cyclin-T1 CDK9-Interaktion unabhängig von den verwendeten Epitopen ist. Die Ergebnisse der TAP und der reziproken TAP wurden ebenfalls durch Silberfärbung analysiert. Die Sternchen weisen auf koeluierte Verunreinigungen hin.
FLAG-markiertes CKD9 koeluiert mit STREP-markiertem Cyclin-T1 von den STREP-Kügelchen, aber nicht von der Kontrolle AP.In der nachfolgenden FLAG-Elution, STREP-markiertes Cyclin-T1 koeluiert mit FLAG-markiertem CDK9 von den FLAG-Kügelchen. In ähnlicher Weise koeluierte FLAG-markiertes Cyclin-T1 mit STREP-markiertem CDK9 von den STREP-Kügelchen, aber nicht von der Kontroll-AP. Und der Protein-Protein-Komplex wurde nach dem zweiten FLAG IP-Schritt effizient wiederhergestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen durchgeführt werden, beginnend mit der Zellenentnahme, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Anzahl der Zellplatten pro Experiment entsprechend zu erhöhen, um sicherzustellen, dass genügend Protein zurückgewonnen und nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel die Identifizierung der neuen regulatorischen Untereinheiten und/oder die Untersuchung der posttranslationalen Modifikationen an komplexen Untereinheiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Protein-Protein-Wechselwirkungen untersuchten, um neuartige Interaktoren und posttranslationale Modifikationen in eukaryotischen Zellen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine mit STREP- und FLAG-Tags isoliert und charakterisiert werden können.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine neuartige Tandem-Affinitäts-Reinigungs-(TAP)-Methode, die für die effiziente Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen entwickelt wurde. Die Methode ermöglicht die Identifizierung neuartiger Interaktoren und post-translationaler Modifikationen, die die Proteinfunktion beeinflussen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Zellbiologie
- Protein-Interaktionen
Hintergrund
- Tandem-Affinitäts-Reinigung ist eine Technik zur Isolierung von Proteinkomplexen.
- Das Verständnis von Proteininteraktionen ist entscheidend für die Aufklärung zellulärer Funktionen.
- Post-translationale Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Proteinaktivität.
- Diese Methode verbessert die Reinheit und Ausbeute von Proteinkomplexen für weitere Analysen.
Ziel der Studie
- Entwicklung einer robusten TAP-Methode zur Isolierung von Proteinkomplexen.
- Erleichterung der biochemischen Charakterisierung von Proteinkomplexen.
- Identifizierung neuartiger Interaktoren und regulatorischer Modifikationen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen.
- Einsatz von STREP-Affinitäts-Reinigung 48 Stunden nach der Transfektion.
- Anwendung von kaltem PBS für die Zellablösung.
- Downstream In-vitro-Anwendungen zur Untersuchung der Proteinfunktion.
Hauptergebnisse
- Es wurden hohe Reinheit und Ausbeute isolierter Proteinkomplexe erreicht.
- Die Identifizierung neuartiger Interaktoren wurde erleichtert.
- Post-translationale Modifikationen, die die Proteinfunktion regulieren, wurden charakterisiert.
- Die Methode erwies sich als effektiv für die biochemische Charakterisierung.
Schlussfolgerungen
- Die TAP-Methode ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Proteinkomplexen.
- Sie ermöglicht die Identifizierung wichtiger regulatorischer Interaktionen.
- Dieser Ansatz kann unser Verständnis von Proteinfunktion und -aktivität verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
