Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen
26. Januar 2017
Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.
Das übergeordnete Ziel dieser Tandem-Affinitätsreinigungsmethode ist die Isolierung von Proteinkomplexen, die aus eukaryotischen Zellen exprimiert werden, für die biochemische Charakterisierung und molekulare Anordnungen sowie die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen, die ihre Funktion regulieren. Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung intakter Proteinkomplexe aus eukaryotischen Zellen, um neue Interaktoren und regulatorische posttranslationale Modifikationen zu identifizieren, die ihre Funktion feinabstimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hohe Reinheit und Ausbeute von Proteinkomplexen für nachgelagerte In-vitro-Anwendungen zur Untersuchung ihrer Funktion und Aktivität ermöglicht.
Die Zellen werden 48 Stunden nach der Transfektion aus der STREP-Affinitätsreinigung entnommen. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie acht Milliliter kaltes PBS hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen von der Platte zu lösen.
Sammeln Sie die Zellsuspension, geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen vier Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 800 g ab. Entfernen Sie den PBS-Überstand. Eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 800 g herunterschleudern, um alle PBS-Reste zu eliminieren.
Um dieses Verfahren zu starten, resuspendieren Sie jedes Zellpellet mit dem Fünffachen des Zellpelletvolumens von passivem Lysepuffer (PLB). Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Suspension kurz einwirbeln und 30 Minuten bei vier Grad Celsius nutatieren.
Schleudern Sie die Zellsuspension bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Übertragen Sie das lösliche Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Zellpellet. Speichern Sie 10 % des endgültigen Volumens des löslichen Lysats als STREP-AP-Eingabe und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.
Es ist wichtig, STREP-Kügelchen für den ersten Schritt der Affinitätsreinigung zu verwenden, da Komplexe, die mit STREP-Kügelchen abgezogen werden, deutlich mehr Protein zurückgewinnen als solche, die mit den FLAG-Kügelchen abgezogen werden. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung die entsprechende Menge an 50%iger STREP-Bead-Aufschlämmung für die Affinitätsreinigung. Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern.
Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter PLB zu den Kügelchen. Die Perlenmischung fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius nutatieren. Drehen Sie sich wieder nach unten.
Entfernen Sie nach dem dritten Waschen den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in PLB auf ein Endvolumen von n mal 40 Mikrolitern, wobei n die Anzahl der Proben ist. Geben Sie 40 Mikroliter 50%ige STREP-Bead-Slurry zu jeder Zelllysatprobe und nutatisieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Während dieser Proteinproduktion und -rückgewinnung können mehrere Zellplatten verwendet werden, und dieselben Proteinproben, die von verschiedenen Platten lysiert wurden, können während der STREP-Affinitätsreinigung mit einem Teil der Kügelchen kombiniert werden.
Nachdem die Mischungen aus Zelllysat und STREP-Bead-Slurry zwei Stunden lang inkubiert wurden, schleudern Sie sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.500 g herunter. Bewahren Sie den Überstand auf, während STREP AP durchfließt, und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Geben Sie 500 Mikroliter STREP AP Waschpuffer eins zu den Kügelchen.
Die Kügelchen in einer Puffermischung fünf Minuten bei vier Grad Celsius nutatisieren und bei 1.500 mal g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut mit 500 Mikrolitern STREP AP Waschpuffer eins. Übertragen Sie die Bead-Lösung nach dem dritten Waschen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Proteinhintergrund zu reduzieren.
Waschen Sie ein viertes Mal mit STREP AP Waschpuffer eins. Nach dem Schleudern den Überstand entfernen und 500 Mikroliter Waschbutter zwei hinzufügen. Äquilibrieren Sie die Kügelchen, indem Sie die Röhrchen umdrehen und dann zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.500 g nach unten schleudern.
Entsorgen Sie den Überstand. Eluieren Sie das Protein von Interesse mit 50 Mikrolitern STREP-Elutionspuffer. Vortex bei 800 U/min für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Schleudern Sie die Kügelchen bei 1.500 g für eine Minute bei vier Grad Celsius herunter. Sammelt den Überstand ein. Dieser Anteil entspricht der STREP AP-Elutionsprobe.
Bewahren Sie die Kügelchenfraktion bei vier Grad Celsius für eine zweite Elution auf. Aliquotieren Sie 10 % der STREP AP-Elution für die Silberfärbung und/oder Western Blotting. Um die Menge an Ausgangsmaterial für die anschließende FLAG-Immunpräzipitation zu erhöhen, können die erste und zweite STREP-Elution für eine effizientere Rückgewinnung der FLAG-Elution zusammengelegt werden.
Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung die entsprechende Menge der FLAG-Bead-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 Mikroliter FLAG Waschpuffer zu den Kügelchen.
Bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunterschleudern. Den Überstand entsorgen und erneut mit FLAG Waschpuffer waschen. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in FLAG Waschpuffer auf ein Endvolumen von n mal 16 Mikrolitern, wobei n die Anzahl der Proben ist.
Geben Sie 16 Mikroliter des FLAG-Bead-Slurry zur restlichen STREP AP-Elution und nutieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach einer Inkubation über Nacht mit der FLAG-Bead-Slurry und der STREP AP-Elution ist mit der FLAG-Immunpräzipitation fortzufahren. Schleudern Sie die FLAG Wulstsuspension bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunter.
Bewahren Sie den Überstand auf, während der FLAG-IP-Fluss durchfließt, und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Geben Sie 500 Mikroliter FLAG Waschpuffer zu den Kügelchen. Fünf Minuten bei vier Grad Celsius nutatisieren und bei 1.500 mal g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut mit 500 Mikrolitern FLAG Waschpuffer. Übertragen Sie die Proteinkügelchenlösung nach dem dritten Waschen in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Hintergrund zu reduzieren. Ein viertes Mal mit FLAG Waschpuffer waschen.
Entfernen Sie den Überstand aus der letzten Schleuderung und fügen Sie den Kügelchen 30 Mikroliter FLAG-Waschpuffer hinzu, der 200 Nanogramm pro Mikroliter FLAG-Peptid enthält. Vortex bei 800 U/min für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden schleudern Sie die Suspension bei 1.500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius herunter.
Ernten Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius als FLAG IP-Elution. In diesem Video wurde die Tandem-Affinitätsreinigungs- oder TAP-Methode auf den Cyclin-T1 CDK9-Komplex angewendet. STREP-markiertes Cyclin-T1 und FLAG-markiertes CKD9 wurden in HEK293 T-Zellen überexprimiert.
Ein reziprokes Experiment wurde auch mit STREP-markiertem CDK9 und FLAG-markiertem Cyclin-T1 durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass FLAG-markiertes CKD9 mit STREP-markiertem Cyclin-T1 aus den STREP-Kügelchen koeluierte, jedoch nicht in der Negativkontrolle, bei der AP STREP-markiertes Cyclin-T1 fehlte. Beide Proteine wurden in der FLAG-Elution nachgewiesen, was die Komplexbildung weiter bestätigte.
Die reziproken TAP-Ergebnisse zeigen, dass FLAG-markiertes Cyclin-T1 mit STREP-markiertem CDK9 koeluiert, was weiter bestätigt, dass die Cyclin-T1 CDK9-Interaktion unabhängig von den verwendeten Epitopen ist. Die Ergebnisse der TAP und der reziproken TAP wurden ebenfalls durch Silberfärbung analysiert. Die Sternchen weisen auf koeluierte Verunreinigungen hin.
FLAG-markiertes CKD9 koeluiert mit STREP-markiertem Cyclin-T1 von den STREP-Kügelchen, aber nicht von der Kontrolle AP.In der nachfolgenden FLAG-Elution, STREP-markiertes Cyclin-T1 koeluiert mit FLAG-markiertem CDK9 von den FLAG-Kügelchen. In ähnlicher Weise koeluierte FLAG-markiertes Cyclin-T1 mit STREP-markiertem CDK9 von den STREP-Kügelchen, aber nicht von der Kontroll-AP. Und der Protein-Protein-Komplex wurde nach dem zweiten FLAG IP-Schritt effizient wiederhergestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen durchgeführt werden, beginnend mit der Zellenentnahme, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Anzahl der Zellplatten pro Experiment entsprechend zu erhöhen, um sicherzustellen, dass genügend Protein zurückgewonnen und nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel die Identifizierung der neuen regulatorischen Untereinheiten und/oder die Untersuchung der posttranslationalen Modifikationen an komplexen Untereinheiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Protein-Protein-Wechselwirkungen untersuchten, um neuartige Interaktoren und posttranslationale Modifikationen in eukaryotischen Zellen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine mit STREP- und FLAG-Tags isoliert und charakterisiert werden können.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) vor, die für die effiziente Isolierung und Charakterisierung von Protein-Komplexen aus eukaryotischen Zellen konzipiert ist. Die Methode ermöglicht die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen, die die Proteinfunktion beeinflussen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Zellbiologie
- Proteinwechselwirkungen
Hintergrund
- Die Tandem-Affinitätsreinigung ist eine Technik zur Isolierung von Protein-Komplexen.
- Das Verständnis von Protein-Wechselwirkungen ist entscheidend, um zelluläre Funktionen aufzuklären.
- Posttranslationale Modifikationen spielen eine bedeutende Rolle bei der Regulation der Proteinaktivität.
- Diese Methode verbessert die Reinheit und Ausbeute von Protein-Komplexen für weitere Analysen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer robusten TAP-Methode zur Isolierung von Protein-Komplexen.
- Vermittlung der biochemischen Charakterisierung von Protein-Komplexen.
- Identifizierung neuartiger Interaktoren und regulatorischer Modifikationen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Protein-Komplexen aus eukaryotischen Zellen.
- Verwendung der STREP-Affinitätsreinigung 48 Stunden nach der Transfektion.
- Anwendung von kaltem PBS zur Zellablösung.
- Downstream in-vitro-Anwendungen zur Untersuchung der Proteinfunktion.
Hauptergebnisse
- Es wurden hohe Reinheit und Ausbeute isolierter Protein-Komplexe erzielt.
- Die Identifizierung neuartiger Interaktionspartner wurde erleichtert.
- Posttranslationale Modifikationen, die die Proteinfunktion regulieren, wurden charakterisiert.
- Die Methode erwies sich als wirksam für die biochemische Charakterisierung.
Schlussfolgerungen
- Die TAP-Methode ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Komplexen.
- Sie ermöglicht die Identifizierung zentraler regulatorischer Wechselwirkungen.
- Dieser Ansatz kann unser Verständnis der Proteinfunktion und -aktivität verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) unter Verwendung von STREP- und FLAG-markierten Proteinen lässt sich eine Isolierung eukaryotischer Protein-Komplexe in hoher Reinheit erreichen, was die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase unterstützt. Die Methode ermöglicht die Identifizierung neuartiger Interaktionspartner und posttranslationaler Modifikationen und verbessert so die Vorhersagesicherheit bezüglich Proteinfunktion und Komplexbildung. Dieser Ansatz verringert biologische Unschärfen bei der Zielstrukturauswahl und unterstützt skalierbare Arbeitsabläufe für die Leitsubstanz-Identifizierung und präklinische Charakterisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Isolierung intakter Protein-Komplexe aus eukaryotischen Zellen zur funktionellen Charakterisierung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch hochgradige Reinigung von Komplexen, die vorübergehend exprimierte regulatorische Untereinheiten enthalten.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in das Zielmolekül, indem die Detektion von mitgereinigten Interaktionspartnern und regulatorischen Modifikationen mittels Massenspektrometrie ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte eukaryotische Protein-Komplexe für nachgeschaltete biochemische Assays zur Messung enzymatischer Aktivität oder Bindungskinetik vor.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Isolierung von Komplexen mit definierter Untereinheitenzusammensetzung und Modifikationsstatus.
- Skalierbarkeit: Unterstützt die Plattformwiederverwendung für mehrere Zielstrukturen, indem Lysate von verschiedenen Zellkulturschalen während der Inkubation mit STREP-Beads kombiniert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Charakterisiert krankheitsrelevante Protein-Komplexe, die aus eukaryotischen oder pathogenen Komponenten gebildet werden, und ermöglicht so Einblicke in die Mechanismen von Wirt-Pathogen-Interaktionen.
- Operativer Wert: Stellt eine kontinuierliche Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem geeignete Komplexe für strukturelle und funktionelle Untersuchungen bereitgestellt werden.
- Risikominderung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung, indem neuartige regulatorische Untereinheiten und posttranslationale Modifikationen identifiziert werden, die die Funktion des Komplexes feinregulieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die TAP-Methode ist in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitsubstanzen integriert und ermöglicht die biochemische Charakterisierung von Protein-Komplexen vor der Verbindungsscreening.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Isolierung von Komplexen, um neue Interaktionspartner und regulatorische posttranslationale Modifikationen zu identifizieren.
- Screening: Ermöglicht die Bereitstellung von gereinigten Komplexen, die für in-vitro-Aktivitäts- und Bindungsassays einsatzbereit sind.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse mittels Massenspektrometrie und Western-Blot-Analyse, um die Zusammensetzung von Komplexen unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem Komplexe aus eukaryotischen oder pathogenen Systemen charakterisiert werden, um mechanistische Risiken abzubauen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode für mehrere Zielstrukturen, da der gleiche Workflow mit STREP- und FLAG-Beads auf verschiedene epitopmarkierte Konstrukte angewendet werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten und Identifizierung neuartiger regulatorischer Mechanismen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Isolierung von Protein-Komplexen über mehrere experimentelle Bedingungen hinweg.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch verbesserte Zielvalidierung, kapitalwirtschaftliche Effizienz in der frühen Entdeckungsphase und reduziertes Risiko biologischer Fehlschläge in späteren Phasen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierter Komplexzusammensetzung und Modifikationsstatus.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, eukaryotischer Zellkultur und Affinitätsreinigungstechniken.
- Hängt vom Zugang zu Zentrifugiergeräten, Mikrozentrifugenröhrchen sowie STREP- und FLAG-Affinitätsmaterialien ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Positionierung der Tags, der Zusammensetzung des Lysepuffers und der Waschstringenz, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Erfordert Anpassungen, wenn das Verfahren auf verschiedene eukaryotische Zelllinien oder auf Expressionssysteme für pathogene Proteine angewendet wird.
- Praktische Einschränkung: Die Effizienz hängt von der Transfektionseffizienz und den Expressionsniveaus der epitopmarkierten Konstrukte in eukaryotischen Zellen ab.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
