Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die Funktionalität von kryokonserviertem Delfinsperma mittels heterologer In-vitro-Fertilisation unter Verwendung von kryokonservierten Delfinspermien und Zona-intakten bovinen Oozyten zu bewerten. In diesem Video zeigen wir, wie man Delfinspermien sammelt, bewertet und kryokonserviert. Anschließend untersuchen wir die Spermieninteraktion und -penetration bis zur Zona pellucida.

Bildung des männlichen Pronukleus und Teilung der Hybrid-Embryonen. Ein kritisches Problem bei der Entwicklung assistierter Fortpflanzungstechnologien ist die Beurteilung der Spermienfunktion, die am besten durch die Befruchtungsfähigkeit angezeigt wird. Homologe IVF-Techniken werden üblicherweise zur Beurteilung der Spermienfunktion eingesetzt, doch die Gewinnung von Delfin-Oozyten ist äußerst schwierig.

Der Hauptvorteil der heterologen In-vitro-Fertilisation liegt in ihrer Einfachheit. Bovine Oozyten sind leicht erhältlich und können mittels gut etablierter Protokolle in vitro verarbeitet werden. Außerdem zeigen wir, wie man Delfinspermien mittels flüssigem Stickstoffdampf kryokonserviert.

Eine einfache Technik, die keine hochspezialisierte Gefrierausrüstung erfordert. Für dieses Verfahren sollte das männliche Tier zuvor sechs Monate lang mittels positiver Verstärkung trainiert worden sein. Lassen Sie das Tier in dorsaler Rückenlage nahe am Beckenrand liegen.

Führen Sie verschiedene taktile Stimulierungen durch, indem Sie sanft auf den kranialen Bereich der Genitalfurche drücken, um eine freiwillige Ausstülpung des Penis auszulösen. Nach Erreichen einer vollständigen Erektion richten Sie die Penisspitze in einen sterilen Behälter. Bewahren Sie das Ejakulat bei 37 Grad Celsius bis zur Analyse auf.

Wiederholen Sie die taktile Stimulation bei Bedarf für aufeinanderfolgende Ejakulatsammlungen, wobei jedes Mal ein neues Polypropylglas verwendet wird. Bewerten Sie das Ejakulat unmittelbar nach der Sammlung, wobei es währenddessen stets bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Bestimmen Sie das Volumen, die Farbe, den pH-Wert und die Osmolarität der Ejakulate.

Anschließend anhand eines 10-Mikroliter-Aliquots die Spermienkonzentration in einer Zählkammer bestimmen. Das Ejakulat auf einen Objektträger auf einem beheizten Mikroskop-Objekttisch bei 37 Grad Celsius geben. Mithilfe eines computergestützten Analysesystems die Spermienmotilität bewerten.

Falls erforderlich, verdünnen Sie das Sperma mit Befruchtungsmedium, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Anschließend bewerten Sie mittels eines 20-Mikroliter-Aliquots des Ejakulats die Spermavitalität und -morphologie durch konventionelle Färbung mit Eosin Nigrosin und Spermac. Für die Kryokonservierung überführen Sie zunächst die Spermaprobe in ein Zentrifugenröhrchen.

Sedimentieren Sie dann die Spermien bei 250 × g für fünf Minuten. Verdünnen Sie nun über einen Zeitraum von fünf Minuten langsam die Spermienprobe im Verhältnis 1:1 mit einem Spureneiweiß-basierten Puffer, der 1,5 % Glycerin enthält. Kühlen Sie die Probe anschließend für 1,5 Stunden auf 5 °C ab.

Eine Stunde später die 1:1-Verdünnung mit dem gleichen Puffer wiederholen und die Spermensuspension anschließend 10 Minuten lang bei fünf Grad Celsius aufbewahren. Danach die Suspension in 0,25-Milliliter-Straws füllen und diese verschweißen. Die Straws in einen Halter laden und den Halter 4,5 Zentimeter über flüssigem Stickstoff 10 Minuten lang hängen lassen.

Anschließend die Strohhalme zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff eintauchen. Verwenden Sie für dieses Protokoll Rinderovarien, die innerhalb der letzten drei Stunden in warmer Kochsalzlösung gesammelt wurden. Beginnen Sie damit, die Ovarien dreimal mit Kochsalzlösung zu waschen.

Halten Sie sie stets bei 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie anschließend alle Follikel von zwei Millimeter bis acht Millimeter mit einer 18-Gauge-Nadel und einer Spritze. Überführen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie die Oozyten 15 Minuten lang sedimentieren.

Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Follikel in PBS. Gewinnen Sie die COCs unter einem Stereomikroskop in 90-Millimeter-Schalen. Wählen Sie Oozyten der Klasse eins und zwei aus, die ein homogenes Zytoplasma aufweisen und von mindestens drei Cumuluszelllagen umgeben sind.

Überführen Sie diese Oozyten in PBS in eine 35-Millimeter-Schale. Waschen Sie die COCs danach dreimal in PBS und einmal im Reifungsmedium. Anschließend werden die COCs in Vierkammerschalen mit jeweils 50 COCs und 500 Millilitern Reifungsmedium pro Kammer aufgeteilt und für 24 Stunden inkubiert.

Sobald die Oozyten ausgedehnte Cumuluszellen aufweisen, sind sie reif. Anschließend werden sie zweimal in Befruchtungsmedium gewaschen und in Vierer-Schalen in Gruppen von jeweils 50 mit 250 Milliliter Befruchtungsmedium pro Vertiefung überführt. Danach werden die COCs in den Inkubator zurückgebracht und die Spermien für die Befruchtung vorbereitet.

Füllen Sie einen gefrorenen Strohhalm mit Delfinspermatozoen und einen Strohhalm mit Rinderspermatozoen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 50 Sekunden. Bewerten Sie anschließend die Motilität subjektiv mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops. Überführen Sie danach die Spermienprobe in ein Dichtegradientenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 250 ×g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Und geben Sie drei Milliliter der Waschlösung wieder hinzu. Suspendieren Sie die Spermien anschließend durch vorsichtiges Mischen erneut. Zentrifugieren Sie nun das Gefäß erneut und entfernen Sie den größten Teil des Überstands, wobei die Spermien in 300 Mikrolitern verbleiben.

Zählen Sie nun die Spermien und stellen Sie die Konzentration auf zwei Millionen pro Milliliter ein, verdünnt mit Befruchtungsmedium. Geben Sie 250 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung mit Oozyten, um eine endgültige Spermienkonzentration von einer Million pro Milliliter zu erreichen. Beobachten Sie unter einem Stereomikroskop die expandierten, reifen Oozyten, die von beweglichen Rinder- oder Delphinspermien umgeben sind, wobei die Delphinspermien kleiner als die Rinderspermien sind.

Die Gameten 18 Stunden lang gemeinsam inkubieren. Um die Interaktion der Spermien mit der Zona pellucida zu bewerten, entnehmen Sie 2,5 Stunden nach der gemeinsamen Inkubation 20 Oozyten aus der Schale. Entfernen Sie die locker angehefteten Spermien durch kräftiges Pipettieren durch eine Pasteurpipette mit enger Öffnung.

Fixieren und färben Sie anschließend die Oozyten mit Haken auf 3342. Überführen Sie die gefärbten Oozyten einzeln in Tropfen von zwei µL Eindeckmedium und zählen Sie die Anzahl der an den Oozyten haftenden Spermatozoen mit einem Phasenkontrastmikroskop. Beginnend nach 18 Stunden der Koinkubation übertragen Sie die 10 vermuteten Zygote in ein 15-mL-Zentrifgenröhrchen, das zwei mL PBS enthält, und wirbeln es drei Minuten lang vorsichtig um die Cumuluszellen zu entfernen.

Zweimal mit PBS waschen und wie zuvor beschrieben fixieren und färben. Zusätzlich 50 Zygoten nach 18 Stunden der Co-Inkubation zur Kultivierung sammeln. Diese 3 Minuten lang im PBS vortexen und anschließend zweimal mit PBS waschen.

Nach dem Waschen ausgewählter Zygote mit homogenem Zytoplasma zum Kultivieren. Überführen Sie sie in Gruppen von 25 in 25-Mikroliter-Tropfen synthetischer Oviduktflüssigkeit, ergänzt mit 5 % Fetalrinderserum. Kultivieren Sie anschließend die vermuteten Zygote 48 Stunden lang und bewerten Sie ihre Teilungsrate mithilfe eines Stereomikroskops.

Später genetisches Profil mittels PCR gemäß dem Textprotokoll weiter untersuchen. Die Spermatozoen aufgetauter gefrorener Delphinsperma waren etwa zu 85 % beweglich und zu 70 % progressiv beweglich. Diese Werte sind repräsentativ für hochwertig kryokonservierte Spermatozoen.

Delfinspermatozoen hefteten sich nach 2,5 Stunden Koinkubation in einem höheren Prozentsatz an die bovine Zona pellucida an als Rinderspermatozoen. Die Delfinspermatozoen konnten intakte bovine Oozyten durchdringen, was zur Bildung von Pronuklei und zur Teilung führte. In der heterologen In-vitro-Fertilisationsgruppe wurde keine Polyspermie beobachtet.

Die Bildung von Pronuklei erreichte nach 24 Stunden den höchsten Prozentsatz. Die Bildung von Pronuklei verlief in der homologen Gruppe schneller. Die Teilungsrate nach 48 Stunden war bei heterologen Befruchtungen niedriger als bei homologen Befruchtungen.

Die PCR bestätigte das Vorhandensein von Delfin-Genmaterial in den Hybrid-Embryonen. Es wurden Primer für das Delfin-18S-Ribosomen-Gen getestet, die ein Produkt von 190 Basenpaaren ergeben. Die Gelen 1 bis 30 enthalten Delfin-Rind-Hybride.

Die Kontrollen waren Delfin-DNA in den S-Lanes und zwei zelluläre bovine Embryonen in den C-Lanes. Das vorgestellte Protokoll für die autologe In-vitro-Fertilisation hat gezeigt, dass Große Tümmler in der Lage sind, intakte bovine Oozyten zu befruchten, was zu Hybridembryonen führt.

Weitere Entwicklungen und Optimierungen dieser Technik werden die Beurteilung der Spermienfunktion von Delfinen erleichtern. Die Kryokonservierung von Delfinspermien mittels flüssigem Stickstoffdampf ist eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode, die gute Werte bei der tiefen Motilität ergibt und eine erfolgreiche heterologe In-vitro-Fertilisation ermöglicht. Die Beobachtung, dass Delfinspermien in der Lage sind, Rinder-Oozyten zu befruchten, eröffnet neue Forschungsmöglichkeiten zur Fortpflanzung von Delfinen und anderen Meerestieren.

Stellt zudem Fragen zu den Mechanismen der Befruchtung, die weitgehend unbeantwortet bleiben.