Name: Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie die Sammlung, Kryokonservierung und heterologe In-vitro-Fertilisation von Tursiops truncatus-Spermien mit bovinen Oozyten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Spermienfunktionalität.

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seine Arbeit wurde durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (AGL2015-70140-R, D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan und J. F. Pérez-Gutiérrez und Seneca Stiftung von Murcia (Grant 20040/GERM/16, F. García-Vázquez) finanziert.

Ethik-Anweisung: die experimentellen Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, wie von der Gesellschaft für die Studie der Reproduktion und dem Tierschutzgesetz für die Pflege von Meeressäugern angenommen.
 1. Dolphin Spermiengewinnung und Kryokonservierung <ol><li>Vorbereitung <ol><li>stellen FERT Medium (Heparin und Hypotaurine-frei). Bereiten Sie FERT LEDIG-Medium ergänzt mit Bicarbonat 25 mM, 22 mM Natrium Laktat, 1 mM Natrium Pyruvat, 6 mg/mL Fettsäure-freie BSA und 10 mg/mL Heparin (pH 7,4). 
		Hinweis: Dieses Medium am Tag der Verwendung vorbereiten und halten Sie es bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft.</li>
		<li>Bereiten TRIS Ei Eigelb-Puffer. Auflösen von 30,28 g/L Tris, 16,75 g/L Zitronensäure, Fructose 12,5 g/L und 0,5 g/L Streptomycin Reinstwasser (pH 7,3, Osmolalität = 310 mOsm/kg). Fügen Sie 20 % Eigelb (V/V).</li>
	</ol></li> <li>Zug eine bewährte Zucht männlichen Tümmler im dorsalen Recumbence nahe dem Rand des Pools für freiwillige Samengewinnung liegen. 
	Hinweis: Sollte der männlichen Delphin über 6 Monate durch positive Verstärkung trainiert werden wie oben beschrieben 4.</li>
	<li>Führen verschiedene taktile Stimulationen durch leichtes Drücken auf den kranialen Bereich der genitalen Nut des Delphins zu entlocken Freiwilligen Extrusion des Penis aus der genitalen Nut.</li>
	<li>Nach dem Erreichen einer vollständigen Erektion, die Penis-Spitze direkt in einen sterilen Behälter, das Ejakulat zu erhalten.</li>
	<li>Pflegen die Spermaprobe bei 37 ° C bis die Analyse. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 für aufeinanderfolgende Ejakulat Sammlungen, mit einem neuen Propylen-Glas jedes Mal.</li>
	<li>Sofort nach der Entnahme, bestimmen die Lautstärke mit einem abgestuften Glaszylinder zuvor erwärmt, um 37 ° C. Evaluate die Farbe, pH und Osmolarität (mit einem Mikro-XR) des Ejakulats.</li>
	<li>Die Konzentration der Spermien im Ejakulat, auszuwertende 10 µL der Spermien Suspension hinzufügen ein Eppendorf-Röhrchen mit 90 µL destilliertes Wasser. Bestimmen die Samenzellenkonzentration mit einem Spermien zählen Kammer. 
	Hinweis: Bei der Bewertung, halten Sie den Rest des Ejakulats bei 37 ° c</li>
	<li>Bewerten die Motilität Parameter.
	<ol><li>10 µL der Spermaprobe nehmen und legen Sie sie in eine vorgewärmte Sperma Kammer.</li>
		<li>Bewerten die Motilität über eine EDV-gestützte Sperma-Analyse-System bereits für der Große Tümmler, überprüft die Spermien-Motilität- 2 objektiv beurteilen. 
		Hinweis: Bei Bedarf verdünnen Sie die Spermaprobe mit FERT Medium (Heparin und Hypotaurine-frei) für die angemessene Visualisierung von der Beweglichkeit der Spermien. Bei der Auswertung erhalten die Probe bei 37 ° C auf einem beheizten Mikroskoptisch.</li>
	</ol></li> <li>20 µL der Spermaprobe nehmen und bewerten die Lebensfähigkeit und Sperma Morphologie als zuvor beschriebenen 5.</li>
	<li>Übertragen die Spermaprobe in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Spermaprobe 250 X g für 5 min. Danach bestimmen die Samenzellenkonzentration mit einer Zählkammer, passen Sie die Samenzellenkonzentration bis 400 x 10 6 Spermien/mL. 
	Hinweis: Bei Bedarf verdünnen Sie das Pellet aus konzentrierter Ejakulate mit isolierten Seminalplasma aus eine überschüssige Menge von der gleichen Ejakulat durch Zentrifugieren (250 X g, 10 min).
	<ol><li>Im Laufe von 5 min langsam verdünnte das Sperma Probe 1:1 (V/V) mit einem TRIS Ei Eigelb-basierte Puffer mit 1,5 % Glycerin. Das Rohr mit der Sperma-Aussetzung bei 5 ° C für 1 h 30 min.</li>
		<li>Führen eine zweite Verdünnung der Spermien Suspension mit einem TRIS Ei Eigelb-Puffer mit Glycerin um eine Konzentration von 3 % final Glycerin und eine Endkonzentration von 200 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten. Pflegen die Sperma-Aussetzung bei 5 ° C für 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Laden die Sperma-Suspension in 0,25 mL Strohhalme. Thermoklebende die Strohhalme. Ort die Strohhalme in einem Rack 4,5 cm über Flüssigstickstoff für 10 min. die Strohhalme in flüssigem Stickstoff eintauchen und bis zur Auswertung lagern.</li>
</ol> 2. Heterologe In Vitro Befruchtung mittels Zona intakt Bovine Eizellen <ol><li>Vorbereitung <ol><li>bereiten die Färbung Lösung und das Eindeckmittel.
		<ol><li>Bereiten Hoechst-Stammlösung von Hoechst 1 mg in 1 mL destilliertem Wasser auflösen. Machen Sie 30 µL-Aliquots zu und halten sie im Dunkeln bei-20 ° C bis zur Verwendung. Bereiten Sie Färbelösung durch Zugabe von 25 µL der Stammlösung Hoechst bis 5 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 g/L PVA ergänzt. Gut mischen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C halten.</li>
			<li>Vorbereiten Eindeckmedium durch das Mischen von 6,25 mL PBS mit 6,25 mL Glycerin und 6,25 µL der Stammlösung Hoechst. Gut mischen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C halten.</li>
		</ol></li> <li>Das Medium für Sammlung und in-vitro- Befruchtung der Eizelle vorzubereiten.
		<ol><li>Bereiten Kochsalzlösung 0,9 % NaCl destilliertes Wasser 0,5 mL Gentamycin hinzu.</li>
			<li>Bereiten Sie das Lager Reifung Medium durch Zugabe von 10 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 10 % fetalen Kälberserum (FCS) auf 10 mL von TCM-199. Beide Medien bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Die Eierstöcke im Schlachthof in Kochsalzlösung bei 33-35 ° C zu sammeln und transportieren sie an das Labor innerhalb von 4 h aus Sammlung.</li>
	<li>Einmal im Labor, die Eierstöcke dreimal waschen, entfernen den Schmutz und Blut, mit Kochsalzlösung zuvor erwärmt bis 37 ° c halten die Eierstöcke in Kochsalzlösung bei 37 ° C während des Prozesses.</li>
	<li>Aspirat 2 bis 8 mm Follikel mit einer 18G Nadel und eine 10-mL-Spritze. Sammeln von angesaugte Follikelflüssigkeit in 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Ermöglichen die Follikelflüssigkeit mit den Eizellen für ca. 15 min bei 37 ° C, bis die Zellen Sediment stehen. Den Überstand des Rohres mit einer Pasteurpipette zu entfernen und wieder auszusetzen das Pellet in PBS.</li>
	<li>Erholen sich die Cumulus-Eizelle komplexe (CoC) in 90 mm Schalen unter einem Stereomikroskop.</li>
	<li>Waschen die COCs dreimal mit PBS-Puffer und einmal in Reifung Medium.</li>
	<li>Transfer morphologisch normalen COCs zum 4-wohlen Teller, jeweils gut 500 mL Reifung Medium, in Gruppen von 50 COCs pro Bohrloch. 
	Hinweis: Hier, drei Brunnen &#8211; einen Brunnen für heterologe IVF, ein Steuerelement für homologe IVF und gut mit nur gereift COCs als Parthenogenetische Kontrolle &#8211; verwendet wurden.</li>
	<li>Brüten die CoC für 24 h bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in der Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Bereiten das Medium und der Dichtegradient.
	<ol><li>Befruchtung Medium (FERT) vorbereiten, FERT LEDIG-Medium mit Bicarbonat 25 mM, 22 mM Natrium Laktat, 1 mM Natrium Pyruvat, 6 mg/mL Fettsäure-freie BSA und 10 mg/mL Heparin zu ergänzen. Bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.</li>
		<li>Vorbereitung der Dichtegradient durch Zugabe von 1 mL der Dichte Gradienten Medium, um eine 15-mL-Tube und 3 mL Waschlösung, eine 15-mL-Tube. Pflegen sie bei 38,5 ° C für mindestens 1 h</li>
	</ol></li> <li>Waschen Sie sich die in-vitro- gereifte Eizellen zweimal in FERT Medium.</li>
	<li>Übertragen die Eizellen auf 4-wohlen Teller, jeweils gut 50 COCs in 250 mL FERT. 4-wohlen Teller bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit während der Vorbereitung der Spermien zur Befruchtung zu erhalten.</li>
	<li>Auftauen eine gefrorene Stroh mit Delphin Spermien in einem Wasserbad bei 37 ° C für 50 s. 
	Hinweis: Rindersperma für homologe IVF muss parallel nach dem Standardprotokoll für die homologe bovine IVF verarbeitet werden.</li>
	<li>Nehmen 10 µL der Spermien probieren und legen Sie sie in eine vorgewärmten Spermien zählen Kammer. Bewerten Sie die Motilität mit eine EDV-gestützte Sperma-Analyse-System, zuvor validiert für die Arten, die Beweglichkeit der Spermien Objektiv zu beurteilen. Während dieser Zeit halten die Spermaprobe bei 38,5 ° c</li>
	<li>Die Spermaprobe hinzufügen das Dichte Gradienten Rohr (Schritt 2.10.2). Zentrifuge für 10 min bei 250 X g.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pasteurpipette. Hinzugeben Sie 3 mL Reinigungslösung in das Röhrchen mit dem Pellet. Wieder aussetzen der Pellets durch sanft mischen.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 250 X g. entfernen den Überstand mit einer Pasteurpipette Spermien Volumen von 300 µL.</li>
	<li>Hinzufügen 5 µL der Spermien Aussetzung zu einem Microcentrifuge 95 µL destilliertes Wasser enthält. Pflegen die Sperma-Aussetzung bei 38,5 ° C. füllen die Zellzählung Kammer mit 10 µL der 01:20 Sperma Verdünnung und messen die Konzentration. Berechnen Sie die Menge der FERT Medium, das 100 µL der Spermien, 2 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten hinzugefügt werden muss.</li>
	<li>Eine 15-mL-Tube das berechnete FERT und Spermien Volumen hinzufügen und vorsichtig mischen mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL der Sperma-FERT Suspension in jede Vertiefung der 4-Well Schale mit FERT Mediums mit der gereiften Eizellen, eine Endkonzentration von 1 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten.</li>
	<li>Co inkubieren der Gameten für 18 h bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Bereiten das Kulturmedium anhand der synthetischen oviductal Flüssigkeit mit 5 % FCS ergänzt. Bereiten Sie 25 µL der synthetischen oviductal Fluid Kultur Tröpfchen im 35-mm-Gerichte mit 3 mL Mineral Öl bedeckt. Bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.</li>
	<li>Auf 2,5 h Post Co Inkubationszeit, 20 Eizellen aus der Schale entfernen; die restlichen Eizellen in den Inkubator unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
	<ol><li>Entfernen Sie die lose beigefügten Spermatozoa durch kräftig pipettieren die Hälfte die Eizellen durch eine enge Bohrung Pasteurpipette 10mal.</li>
		<li>Fix den 20 Eizellen in 50 µL 0,5 % Glutaraldehyd für 30 min. Waschen die Eizellen mit PBS-Puffer für 5 min. Transfer die Eizellen zu 50 µL Hoechst Färbelösung für 15 min und waschen Sie die Eizellen mit PBS-Puffer für 5 min.</li>
		<li>Übertragen die Eizellen individuell auf 2 µL Tröpfchen Eindeckmedium mit einer Rate von 10 Eizellen pro Folie. Sanft mit einem Deckgläschen abdecken und mit Nagellack versiegeln.</li>
		<li>Die Anzahl der Spermien befestigt, die bovinen Eizellen mit dem Phasenkontrast-Mikroskop mit Epifluorescent Optik und 361 nm Anregung Filter bei 40 X Vergrößerung ausgestattet.</li>
	</ol></li> <li>Nach 12 h Co Inkubation, 4-wohlen Teller 10 mutmaßliche Zygoten entfernen; die übrigen mutmaßlichen Zygoten im Brutschrank unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
	<ol><li>Übertragung der 10 mutmaßliche Zygoten zu einer Zentrifuge 15 mL Röhrchen mit 2 mL PBS und Wirbel sanft für 2 min die Kumuluszellen entfernen. Waschen zweimal in PBS, Fix und Fleck, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2.)</li>
	</ol></li> <li>Nach 18, 20, 22 und 24 h Co Inkubation, 10 entfernen Sie mutmaßliche Zygoten vom 4-wohlen Teller und Wirbel, reparieren und färben sie wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2). Den Rest des mutmaßlichen Zygoten im Brutschrank unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
	<ol><li>Man Bildung und Polyspermy unter dem Mikroskop Phase-Kontrast/Epifluorescent in die homologen und heterologen IVF-Gruppen durch Färbung mit Hoechst zu bewerten.</li>
		<li>Bewertet man Bildung in 10 zufällig ausgewählte mutmaßlichen Hybrid Zygoten pro Probe. Bestätigt man Formation unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop bei 488 nm Argon Laser Erregung und 515 bis 530 nm Erkennung.</li>
		<li>Abschnitt optisch mutmaßliche Zygoten sequenziell (2 mm) und sammeln Bilder über eine imaging-Software. Mit einer 3D Analyse Software zu visualisieren.</li>
		<li>Nach 24 h Inkubation Co Waschen 50 mutmaßliche Zygoten viermal in PBS und zweimal in Kulturmedium.</li>
	</ol></li> <li>Übertragen Sie sie in Gruppen von 25 auf Microdroplets Kulturmedium zuvor vorbereitet und equilibriert.</li>
	<li>Pflegen bei 38,5 ° C unter einer Atmosphäre von 5 % O 2 / 5 % CO 2 und in der Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Nach 26 und 28 h Co Inkubation, Gerichte und Wirbel, Fix 10 mutmaßliche Zygoten entnehmen, und färben sie, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2).</li>
	<li>Nach 48 h Kultur, beobachten die Spaltung unter einem Stereomikroskop.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) durch Übertragung der Embryonen zu einer Protease-Lösung von 5 mg/mL.</li>
	<li>Individuell jedem Embryo dreimal waschen mit PBS-Puffer. Frieren sie Snap-in flüssigem Stickstoff in 0,2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Speichern sie bei-80 ° C bis zur Analyse.</li>
</ol> 3. PCR <ol><li>Materialien und Reagenzien Hinweis: die Reagenzien, Materialien und Geräte zur Durchführung der PCR-Protokoll sind detailliert in der Tabelle der Materialien und umfassen eine PCR-Rohr-Rack und eine Reihe von Mikropipetten (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, PCR-Röhrchen und Kappen, einem Thermocycler, ein UV-Strahler, Agarosegel und Puffer (Tris Borat EDTA (TBE)).
	<ol><li>Schonend auftauen alle Reagenzien auf Eis. Pflegen sie im Eis während des Experiments. Verwenden Sie Deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP und dGTP), Ziel Primer auf die Referenz gen Kodierung für das Delphin 18 S ribosomale Protein (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG und F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA-Polymerase, 5 X Puffer für die DNA-Polymerase DNA-Vorlage, steriles Wasser und Magnesiumchlorid (MgCl 2 um eine Endkonzentration von 5,0 mM).</li>
		<li>Agarose-Gel und Probe-Vorbereitung.
		<ol><li>Prepare Delphin und Rinder Samenzellen DNA Proben.
			<ol><li>Tauwetter eine gefrorene Stroh jeder Tierart in einem Wasserbad bei 37 ° C für 50 s. 3 mL Waschlösung hinzugeben. Zentrifuge bei 250 X g für 10 min. entfernen den überstand. Fügen Sie 30 µL STES Lyse Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; und 1 mM 0,1 % SDS), 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 5 µL Dithiothreitol (DTT); Endkonzentration: 150 mM. Pflegen Sie über Nacht bei 55 ° C. Fügen Sie 200 µL Reinstwasser. Zentrifuge bei 250 X g für 5 min. halten überstand. Die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen.</li>
			</ol></li> <li>Führen Sie serielle Verdünnungen der DNA von Delphin Spermien (d. h. 40, 4 und 0,4 ng/mL) mit Reinstwasser zu prüfen, ob die PCR-Bedingungen in der Lage sind eine kleine Menge von Dolphin DNA erkennen.</li>
			<li>Führen Sie serielle Verdünnungen der bovinen Samenzellen DNA (z. B. 4.000, 400, 40 und 4 ng/mL) mit Reinstwasser zu prüfen, ob die PCR-Bedingungen in der Lage, eine kleine Menge der bovinen DNA zu erkennen sind.</li>
			<li>Bereiten die Delphin und Rind Embryonen. Die Embryonen auf Eis auftauen. 8 µL 100 µg/mL Proteinase K hinzufügen und verwalten über Nacht bei 55 ° C. Um die Reaktion zu stoppen, legen Sie die Proben bei 96 ° C für 5 min.</li>
			<li>Zubereiten 2 % Agarose-Gel-TBE-Puffer und 20 µL der Nukleinsäure-Fleck mit Standardtechniken.</li>
		</ol></li> <li>PCR-Vorbereitung.
		<ol><li>Bezeichnung PCR Tube(n): Delphin Verdünnungsreihen (40, 4 und 0,4 ng/mL), bovine Verdünnungsreihen (4.000, 400 40 und 4 ng/mL), homologe bovine zwei-Zell-Embryo, zwei Zellen mutmaßlichen heterologen Embryonen und Negativkontrolle.</li>
			<li>Bereiten Sie eine master Mischung in einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu einem Endvolumen von 25 µL pro Reaktion.
			<ol><li>Hinzufügen 5 µL 5 X DNA Polymerase Flexi Puffer, 0,5 µL von dNTPs (10 mM) 1,5 µL MgCl 2 (25 mM), 0,5 µL vorwärts- und Grundierung (10 µM), 1,5 µL DNA Schablone (Sperma) oder 8 µL DNA Schablone (zwei Zellen Embryonen) , 0,07 µL Taq Polymerase und steriles destilliertes Wasser bis zu einem 25 µL Endvolumen. Mischen Sie gut.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Verstärkung Protokoll <ol><li>legen Sie die Rohre in den Thermocycler. Wählen Sie das folgende Programm: 94 ° C für 3 min; 40 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 59 ° C für 25 s, 72 ° C für 20 s; und 72 ° C für 5 min. das Programm gestartet werden.</li>
		<li>Speichern die Rohre bei 4 ° C. hinzufügen 2.5 µL Ladepuffer zu jedem PCR-Produkt bei 4 ° C und Last 15 µL des Gemisches in die Vertiefungen der 2 % Agarose-Gel. Verwenden Sie einen DNA-Leiter-Marker für die genaue Größe Schätzung der PCR-Fragmente.</li>
		<li>Perform Elektrophorese für 15 min auf DNA-Migration zu ermöglichen. Mit einem UV-Strahler visualisiert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für viele verschiedene Säugetierarten gibt es vielfältige Vorteile bei der Verwendung von aufgetauten Spermien. Dazu gehören die Fähigkeit übertragen wertvolles genetisches Material, das Potenzial für den weltweiten Vertrieb, das geringe Risiko der Kontamination und die Fähigkeit, die männlichen Gameten für Jahrzehnte zu bewahren. Die Verwendung von kryokonservierten Spermien gilt der Große Tümmler, da diese Spezies unter Anhang II des Washingtoner ARTENSCHUTZÜBEREINKOMMENS, geschützt ist, was den Transport und Austausch...

Techniken der assistierten Reproduktion sind schlecht in wilde Tiere, einschließlich Meeressäugern entwickelt. Der Mangel an sensiblen Verfahren zur Beurteilung der Spermien Düngung Erfolg trägt zu der langsamen Entwicklung der reproduktiven Technologien in Arten wie Delphin. Es war nicht bis vor kurzem, dass die bahnbrechenden Grundparameter der Große Tümmler (Tursiops Truncatus) gemeldeten1,2. Variablen wie Motilität und Morphologie, geben obwohl weit verbreitet, jedoch nur begrenzte Informationen über reproduktive Effizienz. Der beste Indikator für die Qualität der Spermien ist die Düngung Potenzialbeurteilung.
Vor kurzem herangezogen unsere Fraktion eine Methode zur Delphin Sperma Düngung Potenzial durch die Beurteilung der männlichen man Bildung und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten3Beurteilung. Die Verwendung von Delphin-Rind heterologen IVF hat wichtige Vorteile gegenüber dem homologen IVF, wie es die Schwierigkeit, Delphin Eizellen überwindet und erleichtert die Verwendung von bewährten in Vitro boviner Oozyten Reifung Systeme. Zur Vermeidung von Arten Spezifität erfolgt in der Regel heterologen Befruchtung bei fehlender ZP. Obwohl es für die Bewertung der Fähigkeit von Akrosom reagierte Spermien mit der Dotterhäutchen Membran verschmelzen kann, beeinträchtigt es die Bewertung der anderen Features, die im Zusammenhang mit der Befruchtung. Das beschriebene Verfahren Zona intakte Eizellen verwendet und ermöglicht die Auswertung der folgenden Parameter: Sperma Zona Bindung und Anhaftung, eindringen, Polyspermy, man Bildung und hybride Embryo Spaltung.
Hier präsentieren wir Ihnen verschiedene Protokolle zur Spermiengewinnung, grundlegende Spermiogramm, Spermien Einfrieren sowie die Auswertung der Delphin-Sperma-Funktionalität durch die Beurteilung der männlichen man und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP medium</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Geschirr</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradient BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>Waschlösung Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Puffer Tris Borat EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB agarose</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq flexi buffer</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB agarose</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taq-Polymerase</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Makler Zählkammer</td><td>Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thoma Kammer</td><td>Hecht-Assistant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmeter MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometer Advanced Mikroosmometer 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computergestütztes Spermienanalysesystem</td><td>Projectes y Serveis F+E</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszierende Optik Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokaler Assistent 4.02 Software</td><td>Bio-Rad</td><td>3D-Analysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropippeten (P2. P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Iluminator</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bottlenose delphin (tursiops truncatus) spermien: sammlung, kryokonservierung und heterologen befruchtung in vitro

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Die Verwendung von kryokonservierten Delphin Spermien erleichtert den Austausch genetischen Materials zwischen Wasserparks und Spermien für Laboratorien für Studien zu unserem Verständnis der Meeressäuger Reproduktion weiter zugänglich macht. Heterologe IVF, Ersatz für homologe IVF, könnten ein Mittel, um die Spermien Fruchtbarkeit potenzielle testen; Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren; und die Verwendung von wertvollen Delphin Eizellen zu vermeiden, die schwer zu erhalten sind. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die erfolgreich eingesetzt haben, zu sammeln und Tiefgefrieren Delphin Spermien. Die Sammlung des Samens erfolgt durch manuelle Stimulation über ausgebildete Delphine. Die Kryokonservierung wird erreicht mit einem TRIS-Eigelb-Basis-Extender mit Glycerin. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, beschreibt heterologen IVF mit Delphin Spermatozoa und boviner Oozyten und, überprüft die hybride Natur des entstehenden Embryos mittels PCR. Heterologen Befruchtung wirft Fragen auf Düngung und kann als Werkzeug verwendet werden, um die Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren. Darüber hinaus zeigt sich der Erfolg der heterologen IVF das Potential dieser Technik Delphin Sperma Düngung Kapazität, die weitere Prüfung lohnt zu testen.

Alle Ergebnisse, Tabellen und Abbildungen (1 und 2) hier vorgestellt wurden mit Erlaubnis3wiedergegeben.
Delphin Spermien haben hohe Motilität nach Einfrieren und Auftauen
Die aufgetauten Delphin ejakuliert zeigte Prozentsätze (% ± SD) von 84,5 ± 5,3 Total bewegliche und 69,1 ± 5,1 progressiv bewegliche Spermien. Hinsichtlich der Motilität sind die...

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die für Delphin Spermien Sammlung, Kryokonservierung und heterologen IVF-Leistung mit boviner Oozyten erfolgreich eingesetzt haben.

Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die Funktionalität von kryokonserviertem Delfinsperma mittels heterologer In-vitro-Fertilisation unter Verwendung von kryokonservierten Delfinspermien und Zona-intakten bovinen Oozyten zu bewerten. In diesem Video zeigen wir, wie man Delfinspermien sammelt, bewertet und kryokonserviert. Anschließend untersuchen wir die Spermieninteraktion und -penetration bis zur Zona pellucida.Bildung des männlichen Pronukleus und Teilung der Hybrid-Embryonen. Ein kritisches Problem bei der Entwicklung assistierter Fortpflanzungstechnologien ist die Beurteilung der Spermienfunktion, die am besten durch die Befruchtungsfähigkeit angezeigt wird. Homologe IVF-Techniken werden üblicherweise zur Beurteilung der Spermienfunktion eingesetzt, doch die Gewinnung von Delfin-Oozyten ist äußerst schwierig.Der Hauptvorteil der heterologen In-vitro-Fertilisation liegt in ihrer Einfachheit. Bovine Oozyten sind leicht erhältlich und können mittels gut etablierter Protokolle in vitro verarbeitet werden. Außerdem zeigen wir, wie man Delfinspermien mittels flüssigem Stickstoffdampf kryokonserviert. Eine einfache Technik, die keine hochspezialisierte Gefrierausrüstung erfordert. Für dieses Verfahren sollte das männliche Tier zuvor sechs Monate lang mittels positiver Verstärkung trainiert worden sein. Lassen Sie das Tier in dorsaler Rückenlage nahe am Beckenrand liegen.Führen Sie verschiedene taktile Stimulierungen durch, indem Sie sanft auf den kranialen Bereich der Genitalfurche drücken, um eine freiwillige Ausstülpung des Penis auszulösen. Nach Erreichen einer vollständigen Erektion richten Sie die Penisspitze in einen sterilen Behälter. Bewahren Sie das Ejakulat bei 37 Grad Celsius bis zur Analyse auf.Wiederholen Sie die taktile Stimulation bei Bedarf für aufeinanderfolgende Ejakulatsammlungen, wobei jedes Mal ein neues Polypropylglas verwendet wird. Bewerten Sie das Ejakulat unmittelbar nach der Sammlung, wobei es währenddessen stets bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Bestimmen Sie das Volumen, die Farbe, den pH-Wert und die Osmolarität der Ejakulate.Anschließend anhand eines 10-Mikroliter-Aliquots die Spermienkonzentration in einer Zählkammer bestimmen. Das Ejakulat auf einen Objektträger auf einem beheizten Mikroskop-Objekttisch bei 37 Grad Celsius geben. Mithilfe eines computergestützten Analysesystems die Spermienmotilität bewerten.Falls erforderlich, verdünnen Sie das Sperma mit Befruchtungsmedium, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Anschließend bewerten Sie mittels eines 20-Mikroliter-Aliquots des Ejakulats die Spermavitalität und -morphologie durch konventionelle Färbung mit Eosin Nigrosin und Spermac. Für die Kryokonservierung überführen Sie zunächst die Spermaprobe in ein Zentrifugenröhrchen.Sedimentieren Sie dann die Spermien bei 250 × g für fünf Minuten. Verdünnen Sie nun über einen Zeitraum von fünf Minuten langsam die Spermienprobe im Verhältnis 1:1 mit einem Spureneiweiß-basierten Puffer, der 1,5 % Glycerin enthält. Kühlen Sie die Probe anschließend für 1,5 Stunden auf 5 °C ab.Eine Stunde später die 1:1-Verdünnung mit dem gleichen Puffer wiederholen und die Spermensuspension anschließend 10 Minuten lang bei fünf Grad Celsius aufbewahren. Danach die Suspension in 0,25-Milliliter-Straws füllen und diese verschweißen. Die Straws in einen Halter laden und den Halter 4,5 Zentimeter über flüssigem Stickstoff 10 Minuten lang hängen lassen.Anschließend die Strohhalme zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff eintauchen. Verwenden Sie für dieses Protokoll Rinderovarien, die innerhalb der letzten drei Stunden in warmer Kochsalzlösung gesammelt wurden. Beginnen Sie damit, die Ovarien dreimal mit Kochsalzlösung zu waschen.Halten Sie sie stets bei 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie anschließend alle Follikel von zwei Millimeter bis acht Millimeter mit einer 18-Gauge-Nadel und einer Spritze. Überführen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie die Oozyten 15 Minuten lang sedimentieren.Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Follikel in PBS. Gewinnen Sie die COCs unter einem Stereomikroskop in 90-Millimeter-Schalen. Wählen Sie Oozyten der Klasse eins und zwei aus, die ein homogenes Zytoplasma aufweisen und von mindestens drei Cumuluszelllagen umgeben sind.Überführen Sie diese Oozyten in PBS in eine 35-Millimeter-Schale. Waschen Sie die COCs danach dreimal in PBS und einmal im Reifungsmedium. Anschließend werden die COCs in Vierkammerschalen mit jeweils 50 COCs und 500 Millilitern Reifungsmedium pro Kammer aufgeteilt und für 24 Stunden inkubiert.Sobald die Oozyten ausgedehnte Cumuluszellen aufweisen, sind sie reif. Anschließend werden sie zweimal in Befruchtungsmedium gewaschen und in Vierer-Schalen in Gruppen von jeweils 50 mit 250 Milliliter Befruchtungsmedium pro Vertiefung überführt. Danach werden die COCs in den Inkubator zurückgebracht und die Spermien für die Befruchtung vorbereitet.Füllen Sie einen gefrorenen Strohhalm mit Delfinspermatozoen und einen Strohhalm mit Rinderspermatozoen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 50 Sekunden. Bewerten Sie anschließend die Motilität subjektiv mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops. Überführen Sie danach die Spermienprobe in ein Dichtegradientenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten bei 250 ×g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.Und geben Sie drei Milliliter der Waschlösung wieder hinzu. Suspendieren Sie die Spermien anschließend durch vorsichtiges Mischen erneut. Zentrifugieren Sie nun das Gefäß erneut und entfernen Sie den größten Teil des Überstands, wobei die Spermien in 300 Mikrolitern verbleiben.Zählen Sie nun die Spermien und stellen Sie die Konzentration auf zwei Millionen pro Milliliter ein, verdünnt mit Befruchtungsmedium. Geben Sie 250 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung mit Oozyten, um eine endgültige Spermienkonzentration von einer Million pro Milliliter zu erreichen. Beobachten Sie unter einem Stereomikroskop die expandierten, reifen Oozyten, die von beweglichen Rinder- oder Delphinspermien umgeben sind, wobei die Delphinspermien kleiner als die Rinderspermien sind.Die Gameten 18 Stunden lang gemeinsam inkubieren. Um die Interaktion der Spermien mit der Zona pellucida zu bewerten, entnehmen Sie 2,5 Stunden nach der gemeinsamen Inkubation 20 Oozyten aus der Schale. Entfernen Sie die locker angehefteten Spermien durch kräftiges Pipettieren durch eine Pasteurpipette mit enger Öffnung.Fixieren und färben Sie anschließend die Oozyten mit Haken auf 3342. Überführen Sie die gefärbten Oozyten einzeln in Tropfen von zwei µL Eindeckmedium und zählen Sie die Anzahl der an den Oozyten haftenden Spermatozoen mit einem Phasenkontrastmikroskop. Beginnend nach 18 Stunden der Koinkubation übertragen Sie die 10 vermuteten Zygote in ein 15-mL-Zentrifgenröhrchen, das zwei mL PBS enthält, und wirbeln es drei Minuten lang vorsichtig um die Cumuluszellen zu entfernen.Zweimal mit PBS waschen und wie zuvor beschrieben fixieren und färben. Zusätzlich 50 Zygoten nach 18 Stunden der Co-Inkubation zur Kultivierung sammeln. Diese 3 Minuten lang im PBS vortexen und anschließend zweimal mit PBS waschen.Nach dem Waschen ausgewählter Zygote mit homogenem Zytoplasma zum Kultivieren. Überführen Sie sie in Gruppen von 25 in 25-Mikroliter-Tropfen synthetischer Oviduktflüssigkeit, ergänzt mit 5 % Fetalrinderserum. Kultivieren Sie anschließend die vermuteten Zygote 48 Stunden lang und bewerten Sie ihre Teilungsrate mithilfe eines Stereomikroskops.Später genetisches Profil mittels PCR gemäß dem Textprotokoll weiter untersuchen. Die Spermatozoen aufgetauter gefrorener Delphinsperma waren etwa zu 85 % beweglich und zu 70 % progressiv beweglich. Diese Werte sind repräsentativ für hochwertig kryokonservierte Spermatozoen.Delfinspermatozoen hefteten sich nach 2,5 Stunden Koinkubation in einem höheren Prozentsatz an die bovine Zona pellucida an als Rinderspermatozoen. Die Delfinspermatozoen konnten intakte bovine Oozyten durchdringen, was zur Bildung von Pronuklei und zur Teilung führte. In der heterologen In-vitro-Fertilisationsgruppe wurde keine Polyspermie beobachtet.Die Bildung von Pronuklei erreichte nach 24 Stunden den höchsten Prozentsatz. Die Bildung von Pronuklei verlief in der homologen Gruppe schneller. Die Teilungsrate nach 48 Stunden war bei heterologen Befruchtungen niedriger als bei homologen Befruchtungen.Die PCR bestätigte das Vorhandensein von Delfin-Genmaterial in den Hybrid-Embryonen. Es wurden Primer für das Delfin-18S-Ribosomen-Gen getestet, die ein Produkt von 190 Basenpaaren ergeben. Die Gelen 1 bis 30 enthalten Delfin-Rind-Hybride.Die Kontrollen waren Delfin-DNA in den S-Lanes und zwei zelluläre bovine Embryonen in den C-Lanes. Das vorgestellte Protokoll für die autologe In-vitro-Fertilisation hat gezeigt, dass Große Tümmler in der Lage sind, intakte bovine Oozyten zu befruchten, was zu Hybridembryonen führt.Weitere Entwicklungen und Optimierungen dieser Technik werden die Beurteilung der Spermienfunktion von Delfinen erleichtern. Die Kryokonservierung von Delfinspermien mittels flüssigem Stickstoffdampf ist eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode, die gute Werte bei der tiefen Motilität ergibt und eine erfolgreiche heterologe In-vitro-Fertilisation ermöglicht. Die Beobachtung, dass Delfinspermien in der Lage sind, Rinder-Oozyten zu befruchten, eröffnet neue Forschungsmöglichkeiten zur Fortpflanzung von Delfinen und anderen Meerestieren.Stellt zudem Fragen zu den Mechanismen der Befruchtung, die weitgehend unbeantwortet bleiben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Eine Ethylenglykol-Basis Verglasung Methode zur Maus-Embryonen beschrieben. Es ist vorteilhaft, andere Methoden in ihrer Einfachheit und niedrigen embryonalen Toxizität, und kann daher weitgehend auf viele Stämme von Mäusen, einschließlich Inzucht-und Gen-veränderten Mäusen.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren der Fisch Sperma Bewertung mit computerunterstützten Spermiogramm und Kühlgeräten. Die Software bietet eine schnelle, genaue und Quantitative Analyse von Fisch Spermienqualität basierend auf Motilität der Spermien, die ein nützliches Werkzeug in der Aquakultur Reproduktionserfolg zu verbessern sein kann.

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.

Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Weg zur Verbesserung der Effizienz und Kapazität der Verarbeitung und Kryokonservierung von Spermien bedrohter Korallenarten, mit dem Ziel, die genetische Vielfalt zu sichern und die Bemühungen zur Wiederherstellung von Riffen zu unterstützen.

Ein halbautomatischer Workflow für die Kryokonservierung von Korallenspermien zur Unterstützung von Biobanking und Aquakultur

Dieses Protokoll bietet eine einfache Mikroaspirationstechnik, um lebensfähige somatische Zellen (SCs) aus kryokonserviertem Pferdesamen zu isolieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen vermeidet diese Technik lange In-vitro-Kulturen und verhindert die Spermienkontamination, was den sofortigen Einsatz beim somatischen Zellklonen ermöglicht.

Eine einfache Mikroaspirationstechnik zur Isolierung somatischer Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen als Kernspender für das Klonieren

Lernen Sie die Sammlung, Kryokonservierung und heterologe In-vitro-Fertilisation von Tursiops truncatus-Spermien mit bovinen Oozyten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Spermienfunktionalität.

Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

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