Name: Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Erfahren Sie die biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotoren in E. coli mittels Echtzeit-Tracking von Sondenperlen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Mechanobiologie bakterieller Mobilität.

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Die Autoren danken Howard Berg für die Spende des Bead-Tracking-Mikroskops/Photomultipliers und der Texas A&M Engineering Experiment Station für die Finanzierung.

1. Zellpräparation <ol><li> Wachsen über Nacht Kulturen der gewünschten Stamm der klebrigen fliC Allel 15,22 in Trypton - Bouillon tragen (TB, 1% Pepton, 0,5% NaCl) , gefolgt von der Inokulation bei 1: 100 Verdünnung in 10 ml frischem TB. Die Kultur bei 33 ° C in einem Schüttelinkubator bis OD 600 = 0,5. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 xg für 5 bis 7 min und re-dispergieren das Pellet kräftig in 10 ml filtersterilisiert Motilität Puffer (MB; 10 mM Phosphatpuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 &amp; mgr; M Methionin, pH 7,0). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2 zwei weitere Male und das endgültige Pellet in 1 ml MB wieder zu dispergieren. </li><li> Scher die Suspension durch durch Polyethylenschlauch verbunden mit 21 bis 23 Manometeradaptern hin und her ~ 75 mal zwischen zwei Spritzen vorbei (7 bis 12 cm lang, 0,58 mm Innendurchmesser). Begrenzen Sie die Gesamtzeit für die auf 30 Scheren - 45 s. </li><li> Zentrifugieren Sie die geschert Zellen bei 1.500 × g für 5-7 Minuten und wieder zu dispergieren diePellet in 100-500 ul MB. </li></ol> 2. Schieben Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch zwei doppelseitige Klebebänder zwischen einem Deckglas zwischen sich und einem Objektträger. Für die Chemotaxis-Assays einsetzen jede mikrofluidischen Kammer, die den Austausch von MB und chemischen Stimulanzien ermöglicht. </li><li> 0.01% Poly-L-Lysin-Lösung in der Kammer und nach 5 min sanft spülen Sie die Oberflächen mit MB (80 - 100 ul). </li><li> Werden 40 &amp; mgr; l der Zellsuspension in die Kammer und damit ausreichend Zeit für die Befestigung an der Glasoberfläche (7 - 8 min). Ausfließen unstuck Zellen durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l MB auf einer Seite der Kammer, während die Lösung mit einem Filterpapier von der anderen Seite wicking. </li><li> In 10 bis 15 &amp; mgr; l von Latexkügelchen in die Kammer und damit die angemessene Zeit Perlen absetzen und zu den Zellen befestigen (7 - 8 min). Spülen Sie vorsichtig mit 100 &amp; mgr; l MB, wie 2.3 in Schritt beschrieben, Perlen zu entfernen unstuck. Verwenden Sie eine Reihe von Perle-sizes für die Experimente so lange, wie ein guter Kontrast zur Verfügung steht. </li></ol> 3. Bead-Tracking <ol><li> Legen Sie die Probe auf einem Mikroskoptisch und scannen die Oberfläche für die Perlen an Motoren angebracht. Verwenden Sie ein 40X Phase Ziel Beobachtungen zu machen, obwohl Phasenmikroskopie nicht notwendig ist. Alternativ verwenden Hellfeld-Bildgebung, solange ein ausreichender Kontrast aufrechterhalten wird, um deutlich eine helle Perle auf einem dunklen Hintergrund zu unterscheiden. </li><li> Sobald ein Wulst ausgewählt wurde, bewegen die Bühne seitlich den Wulst in einem vorbestimmten Winkel zu positionieren , wie in 1B gezeigt. Position beads an derselben Ecke zu gewährleisten, dass die Drehrichtung des Wulstes richtig bekannt ist. Die ideale Perle Bahn ist etwa kreisförmig, sondern elliptisch Bahnen sind zulässig. </li><li> Pflegen die Abtastfrequenz höher ist als das Doppelte der Drehfrequenz des Motors Fehler mit aliasing zugeordnet zu vermeiden. In dieser Arbeit, einen Motor verwenden, der rotierte bei50 Hz und Probe bei Frequenzen, die 10-mal höher (500 Hz) sind, ein glattes Signal zu erhalten. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Center und die PMT - Ausgangsspannungen und korrekte Elliptizität in den Trajektorien mit Affintransformationen skaliert , wenn 23 benötigt. Verwenden Sie ein Power-Spektrum - Analyse Drehraten 17 zu bestimmen. </li><li> Bestimmen Polarwinkel, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Bestimmung der Schwankungen der Motordrehzahlen und Schalt über die Zeit durch ω Berechnungs <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Verwenden einen Medianfilter die Motordrehzahldaten zu glätten. Ein Filterfenster über zwei volle Umdrehungen wird 23,24 empfohlen. </li></ol>

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<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
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<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um tethered Wulst-Tracking und korrekte Schätzung der Motor-Drehmomente zu erleichtern, sollten die folgenden Informationen überprüft werden. Wenn diese Messungen mit flagellated Zellen durchgeführt wird, Scherung ist ein kritischer Schritt. Shearing reduziert die Flagellenfilamenten auf eine bloße stub, wodurch sichergestellt wird, dass die viskose Last auf dem Motor zu dem Wulst überwiegend aus und kann innerhalb von 10% Fehler 16 geschätzt werden. Shearing verbessert auch die Chancen mit dicht verteilten E...

Flagellenmotoren ermöglichen Zellen durch Drehen Schraubenextrazellulären Filamente zu schwimmen. Der Betrag des Drehmoments des Motors für eine gegebene Länge des Flagellums erzeugen kann (dh die viskose Last) bestimmt die Schwimmgeschwindigkeit. Auf der anderen Seite, seine Fähigkeit, die Drehrichtung steuert, die Zellmigration in Reaktion auf Chemikalien, ein Verfahren bekannt, wie Chemotaxis zu wechseln. Chemotaxis und Beweglichkeit sind Virulenzfaktoren 1-3, Flagellenmotoren wurden 4 über die Jahre gut charakterisierte. Montage Hinweise darauf , nun , dass der Motor als Mechanosensor wirkt - es erkennt , mechanisch das Vorhandensein von festen Substraten 5,6. Diese Fähigkeit hilft wahrscheinlich bei der Auslösung von Oberflächenbesiedlung und Infektionen 5,7. Als Ergebnis, wobei die Mechanismen die Motoroberflächen und initiiert Signalisierungs Sinne sind von Bedeutung 8,9. Der Flagellenmotors kann leicht durch Anbinden der flagell untersucht werdenum auf ein Substrat und das Beobachten Zellrotation. Solche Anbinden wurde zuerst von Silverman und Simon erreicht, der mit einer polyhook Mutante in E. coli und erfolgreich befestigt Haken auf Glassubstrate mit anti-hook Antikörper 10 gearbeitet. Die tethered-Zell-Assay Forschern ermöglicht, die Antworten des Motorschalter in einer Vielzahl von chemischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel Segall et al chemisch gebundenen Zellen mit Hilfe von iontophoretischen Pipetten stimuliert. Die entsprechenden Änderungen in CW bias (der Bruchteil der Zeit Motoren drehen im Uhrzeigersinn CW) ermöglichte es ihnen 11,12 die Kinetik der Anpassung in der Chemotaxis - Netzwerk zu messen. Während die tethered - Zell - Assay in Studium Schalter Reaktionen wirksam war, war es nur in der Lage Einblicke in Motormechanik 13 über einen begrenzten Bereich von viskosen Belastungen zu bieten. Um dieses Problem zu überwinden, Ryu et al gebunden sphärisch, Latexperlen stubs auf Zellen an Oberflächen geklebt Filaments. Die Perlen wurdendann zurückverfolgt Brenn Interferometrie mit schwachen optischen Fallen 14 verwendet wird . Durch die Arbeit mit Perlen unterschiedlicher Größe, könnten Forscher untersuchen den Motor über eine viel breitere Palette von Lasten. Dieser Assay wurde später verbessert durch Yuan und Berg, der einen Photovervielfacher-basierte bead-Verfolgungstechnik mit Laser-Dunkelfeldbeleuchtung in Kombination entwickelt. Ihre Methode ermöglicht Verfolgung von tethered Gold Nanobeads , die so klein waren (~ 60 nm) , dass die externen viskoser Widerstände waren niedriger im Vergleich zu den inneren viskosen Widerstände gegen Rotation 15,16. Dies führte zu den Messungen der maximal erreichbaren Geschwindigkeiten in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, ähnlich Perle Assays Messungen der Spinngeschwindigkeiten bei Zwischen viskos Lasten (~ 700 Hz) 17 aktiviert. Durch die Aktivierung Messungen der motorischen Reaktionen über den gesamten möglichen Bereich von viskosen Lasten (von Null-Last bis nahen Stall), vorausgesetzt, die Wulst-Assays ein wichtiges Werkzeug, um die biophysikalischen t zu verstehen,orque-Erzeugungsprozess 18,19. Vor kurzem geändert wir den Yuan-Berg - Test optische Pinzette aufzunehmen , die uns präzise mechanische Reize auf einzelne Motoren 6 anwenden aktiviert. Unter Verwendung dieser Technik haben wir gezeigt, daß die Kraftgeneratoren, die den Motor dynamisch sind Mechanosensoren drehen - sie remodellieren in Reaktion auf Änderungen in viskoser Lasten. Es ist möglich, dass solche Load-Sensing-Zelldifferenzierung in Schwärmen Bakterien ausgelöst wird, obwohl die Mechanismen unklar bleiben. Sie ist auch wahrscheinlich , dass die Flagellenmotoren in anderen Spezies sind auch mechanosensitive 20, direkte Beweise fehlen. Hier diskutieren wir die Photomultiplier-basierte (PMT) Ansatz zur Verfolgung der Rotation von Latex - Kügelchen gebunden an Flagellen Fäden 15. Im Vergleich mit ultraschnellen Kameras Verfolgung der Photomultiplier-Aufbau ist vorteilhaft, da es relativ einfach ist, einzelne Perlen in Echtzeit und über lange dura zu verfolgengen. Es ist besonders nützlich , wenn 21 Umbau in Flagellenmotors Komplexe durch Umweltreize seit langer Zeit zu studieren. Obwohl wir Detail Protokolle speziell für E. coli, können sie leicht für das Studium Flagellenmotoren in anderen Arten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead-Mikrosphären</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer-Slip-Tip-Spritze</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23 Gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Photomultiplier Röhren</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Spektraler Empfindlichkeitsbereich von 300 bis 920 nm, Peakwellenlänge 630 nm, Ansprechzeit von 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm Präzisionsschlitze</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 Schlitze rechtwinklig zueinander montiert auf Photomultiplier-Röhren</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Alternative Marken sind akzeptabel. Digitales Oszilloskop, TBS 1000B-Serie, 2 analog, 30 MHz, 500 MSPS, 2,5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Pole LP/HP Filter</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Alternative Marken sind akzeptabel. Empfohlen wird ein Frequenzbereich von 0,1 Hz bis 200 kHz. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Jedes aufrechte oder inverse Phasenmikroskop kann verwendet werden. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Würfelstrahlteiler</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

biophysikalische charakterisierung von flagellenmotors funktionen

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Die Rolle von Flagellenmotoren bei der bakteriellen Motilität und Chemotaxis ist gut verstanden. Jüngste Entdeckungen deuten darauf hin, dass Flagellenmotoren in der Lage sind, sich als Reaktion auf eine Vielzahl von Umweltreizen umzugestalten und zu den Auslösern für Oberflächenbesiedlung und Infektionen gehören. Die genauen Mechanismen, mit denen Motoren die zelluläre Anpassung umgestalten und fördern, hängen wahrscheinlich von wichtigen motorischen Attributen ab. Die hier vorgestellte Photomultiplier-basierte Bead-Tracking-Technik ermöglicht eine genaue biophysikalische Charakterisierung motorischer Funktionen, einschließlich Anpassungen der Motordrehzahl und der Schaltdynamik. Dieser Ansatz bietet den Vorteil des Echtzeit-Trackings und die Möglichkeit, das motorische Verhalten über längere Zeiträume zu untersuchen. Die diskutierten Protokolle können leicht erweitert werden, um Flagellenmotoren in einer Vielzahl von Bakterienarten zu untersuchen.

Der Photomultiplier Aufbau ist in 1A gezeigt. Es ist wichtig, dass die PMT von den Kügelchen von Interesse verstreut hohe Empfindlichkeiten über den Bereich von Wellenlängen aufweisen. Die PMT hier beschäftigt arbeiten im sichtbaren und im nahen Infrarot-Bereich, und waren in der Lage Licht von Perlen mit einem Halogenlichtquelle beleuchtet verstreut zu erkennen. Die optimale Lichtverhältnisse und Versorgungsspannungen werden von einer Einrichtung zur anderen variieren. ...

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass bakterielle Flagellenmotoren eine Vielzahl von Umweltsignalen wahrnehmen und sich als Reaktion darauf umgestalten. Es wird erwartet, dass die hier diskutierten Bead-Assays dazu beitragen, die Rolle des Umbaus bei der zellulären Anpassung an Umweltstressoren zu erklären.

Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Drehung von Sondenkügelchen zu messen, die an einzelnen Geißelmotoren in lebenden Bakterienzellen angeheftet sind. Die beschriebene Technik bietet den Vorteil, dass Motorantworten in Echtzeit verfolgt werden können und zwischen zulässigen und unzulässigen Daten in Echtzeit unterschieden werden kann. Dieser Ansatz hilft uns dabei, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mechanobiologie zu beantworten und die physikalischen Grundlagen des Verhaltens molekularer Motoren aufzudecken.Obwohl wir diese Techniken hauptsächlich zur Untersuchung von Geißelmotoren in E.coli verwenden, lassen sich diese Protokolle leicht anpassen, um Motoren in anderen Arten flagellierter Bakterien zu untersuchen. Züchten Sie Übernachtkulturen des gewünschten Stammes, der das sticky fliC-Allel trägt, in TB. Inokulieren Sie am nächsten Tag 10 Milliliter frisches TB mit einer Verdünnung von 1:100. Züchten Sie die Kultur bei 33 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 beträgt.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1500 × g für fünf bis sieben Minuten. Lösen Sie das Pellet anschließend kräftig in 10 Mil

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Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.

MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Erfahren Sie die biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotoren in E. coli mittels Echtzeit-Tracking von Sondenperlen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Mechanobiologie bakterieller Mobilität.

Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

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