Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, patienteneigene Speiseröhrenepithelzellen aus endoskopischen Biopsien zu erweitern, um Speiseröhrenerkrankungen zu untersuchen oder ein 3D-Ösophagusgerüst für die nachgeschaltete Modellierung oder den Ersatz von Speiseröhrengewebe zu erstellen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Epithelzellen der Speiseröhre bei Erkrankungen der Speiseröhre besser zu verstehen. Sie können auch verwendet werden, um 3D-Gerüste für die Modellierung oder Implantation zu sehen.

Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir patientenspezifische Epithelzellen aus einem sehr kleinen Stück Gewebe erzeugen können, ohne dass genetische oder dauerhafte Veränderungen erforderlich sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf das Verständnis der Pathogenese der eosinophilen Ösophagitis sowie auf die Entwicklung von Behandlungen für Ösophagusatresie und eosinophile Ösophagitis. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, die Feederzellen vor der Entnahme menschlicher Epithelzellen der Speiseröhre vollständig zu entfernen, um die Reinheit zu erhalten.

Diese Technik wird von Christopher Foster, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Mindestens drei Tage vor der Entnahme der Patientenproben sind die 3T3-Zellen in 3T3-Kulturmedium in gewebebehandelten T75-Kolben zu plattieren. Am Tag des Experiments, kurz vor der Entnahme der Proben, lösen Sie die 3T3-Zellen mit 5 Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA pro Kolben für etwa fünf Minuten bei 37 Grad Celsius ab.

Wenn die meisten Zellen schwimmen, fügen Sie 5 Milliliter 3T3-Medium hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und überführen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Pellet zum Zählen wieder in Medium. Übertragen Sie dann die entsprechende Anzahl von Zellen für die Aussaat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie anschließend 25 Milliliter frisches 3T3-Medium zu den Zellen für die Bestrahlung bei 3000 rad. Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in einem bedingten Programmiermedium bei fünf Millilitern pro 100-Millimeter-Platte. Nachdem zum Zeitpunkt der Endoskopie etwa sechs Ösophagusbiopsien entnommen wurden, legen Sie sechs Biopsien in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das vollständiges serumfreies Keratinozytenmedium enthält, ergänzt mit Primocin auf nassem Eis.

Platzieren Sie eine Biopsie in fünf Millilitern gepuffertem Formalin auf nassem Eis und legen Sie eine Biopsie in ein kleines Biopsie-Kryomold, das Einbettmedium enthält. Tauchen Sie die Form sofort in ein Becherglas mit Eis oder Pentan in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff. Sobald das Gewebe eingefroren ist, legen Sie den Kryoschimmel in einen Probenbeutel auf Trockeneis in einen Behälter aus Polystyrolschaum.

Legen Sie dann die Röhrchen mit den Biopsien in einen verschließbaren Beutel in einer Versandschachtel mit dem Biohazard-Etikett mit nassem Eis und verschließen und beschriften Sie beide Behälter mit einem Biohazard-Aufkleber für den Transport zum Labor. Nach dem Betreten des Labors wird die gefrorene Biopsie sofort in ein Lager bei minus 80 Grad Celsius gebracht, um sie anschließend zu schneiden oder RNA-Extraktion durchzuführen. Legen Sie die Probe in Formalin in einen Kühlschrank mit vier Grad Celsius für die Fixierung über Nacht und geben Sie die restlichen Biopsien in die Zentrifuge.

Ersetzen Sie das Medium in jedem Röhrchen durch 10 Milliliter Dispaselösung und verschließen Sie die Röhrchen für eine 15-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Am Ende der Inkubation schleudern Sie die Biopsien erneut herunter und suspendieren Sie die Proben in fünf Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA. Übertragen Sie die Biopsien auf eine sterile 100-Milliliter-Platte und verwenden Sie zwei sterilisierte Rasierer, um das Gewebe so fein wie möglich zu zerkleinern.

Wenn das gesamte Gewebe geschnitten wurde, übertragen Sie die Gewebefragmente in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Platte zweimal mit fünf Millilitern 0,05 % Trypsin-EDTA aus. Sammeln Sie die Waschungen im Röhrchen und geben Sie die Proben in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die aufgeschlossenen Probenstücke und die Feederzellen und suspendieren die Pellets in jeweils fünf Millilitern bedingtem Reprogrammierungsmedium.

Kombinieren Sie dann die Feeder- und die Ösophagusbiopsieproben in einem Röhrchen und fügen Sie den Zellen Rhokinase oder ROCK-Inhibitor für ihre Co-Kultur auf einer gelatinebeschichteten Gewebekulturschale hinzu. Entfernen Sie nach etwa fünf Tagen das Medium und die gehackten Biopsiestücke durch Aspiration und spülen Sie die Schale zwei- bis dreimal mit fünf Millilitern sterilem PBS aus. Geben Sie nach der letzten Wäsche 10 Milliliter frisches Medium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt ist, auf die Platte und stellen Sie die Co-Kultur wieder in den Inkubator, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreicht haben.

Um die Zellen zu erweitern, entfernen Sie die Feeder mit fünf Millilitern 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für nicht länger als zweieinhalb Minuten. Spülen Sie die Platte mit fünf Millilitern frischem PBS, um die schwimmenden Feederzellen zu entfernen, und fügen Sie fünf Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA für eine fünf- bis 10-minütige Inkubation hinzu, bis sich die Biopsieprobenzellen vom Boden der Platte gelöst haben. Stoppen Sie dann die Reaktion mit 10 Millilitern frischem Medium und geben Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem frischen bedingten Reprogrammierungsmedium zum Zählen und zählen Sie nun eins mal 10 zu den sechsten menschlichen Speiseröhrenzellen in eine neue konische Röhre. Geben Sie 1,2 mal 10 zu den sechsten bestrahlten 3T3-Zellen zu den Speiseröhrenzellen und bringen Sie das Gesamtvolumen im Röhrchen auf 15 Milliliter mit frischem bedingtem Reprogrammierungsmedium. Geben Sie dann frischen ROCK-Inhibitor in die Zellen und geben Sie die Co-Kultur auf eine mit Gelatine beschichtete 150-Millimeter-Schale.

Um die Speiseröhrenzellen für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren, entfernen Sie die Futterautomaten und lösen Sie die Speiseröhrenzellen, wie gerade gezeigt. Als nächstes werden die Zellen zur Zentrifugation in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und das Pellet bei einer einsmal 10 bis sechsten Zellen pro zwei Milliliter Gefriermittelkonzentration wieder suspendiert. Übertragen Sie dann zwei Milliliter Zellen in jedes vormarkierte Kryofläschchen und lagern Sie die Proben mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie sie in eine Langzeitlagerung mit flüssigem Stickstoff bringen.

Epithelzellkolonien bilden sich in etwa vier bis fünf Tagen und sind von Fibroblasten-Feederzellen umgeben. Wenn sich diese Kolonien ausdehnen, verschmelzen sie mit anderen Kolonien zu größeren Kolonien. Sobald die Kultur zu 70 % zusammenfließt, müssen sie erweitert werden.

Nachdem die Feederzellen entfernt wurden, können die adhärenten Epithelzellen trypsonisiert und auf neue bestrahlte Feederzellen wieder plattiert werden. Die phänotypische Charakterisierung dieser Zellen mittels qRT-PCR zeigt eine Hochregulation von P63, einem Vorläuferzellmarker am Ende der ersten Passage, im Vergleich zur ursprünglichen Biospionageprobe, was darauf hindeutet, dass die Zellen in einen eher vorläuferstammähnlichen Zustand umprogrammiert wurden. Wenn diese Zellen auf normale Gewebekulturplatten übertragen werden, nimmt die P63-Expression ab und die Expression des Tight Junction Proteins One oder TJP1 oder E-Cadherin nimmt zu, was eine Phänotypverschiebung von der Vorläuferzelle zu einer differenzierteren Epithelzelle zeigt.

Die durchflusszytometrische Analyse der Zellen nach der Passage 1 zeigt, dass mehr als 90% der Zellen auch positiv für EpCAM sind. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die Zellen ihre epithelialen Marker, Vorläufermarker, Proliferationsmarker und epithelialen Tight-Junction-Proteinexpression beibehalten. Die Verdopplungszeit von Speiseröhrenzellen eines nicht erkrankten Patienten wurde auf etwa 36 bis 40 Stunden berechnet, obwohl es wahrscheinlich ist, dass die Verdopplungszeit der erkrankten Zellen langsamer sein wird.

Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte sie in etwa einer Stunde abgeschlossen sein. Achten Sie bei diesem Verfahren darauf, eine sterile Technik zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern, und arbeiten Sie zügig, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Assays, wie z. B. die Transwell-Kultur, durchgeführt werden, um zu bewerten, welche Antigene eine Entzündung der Speiseröhre oder eine Pathogenese verursachen.

Nach der Entwicklung wird dieser Assay den Forschern den Weg ebnen, auslösende Antigene zu identifizieren, die eosinophile Ösophagitis verursachen, sowie neue Behandlungsoptionen für die Behandlung dieser Patienten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Speiseröhrenepithelzellen aus endoskopischen Biopsien isoliert und erweitert, um sie zur Untersuchung von Speiseröhrenerkrankungen oder zur Erstellung von 3D-Modellen zu verwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit scharfen Instrumenten und biologischem Gewebe gefährlich sein kann.

Achten Sie darauf, scharfe Instrumente ordnungsgemäß zu entsorgen, und wenden Sie gute Biosicherheitspraktiken an.