MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zuvor isolierte Mitochondrien von Spenderzellen wie mesenchymalen Stammzellen auf Zielzellen wie Glioblastom-Stammzellen zu übertragen. Dieses Verfahren kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Stoffwechsels zu beantworten, wie z. B. die metabolischen und biologischen Wirkungen der Mitochondrien, die spontan zwischen Zellen übertragen werden, z. B. durch das Tunneln von Nanoröhren oder Mikrovesikeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Auswirkungen der Mitochondrien unabhängig von anderen in der Mikroumgebung vorhandenen Faktoren wie Zytokinen oder Metaboliten sowie von anderen Verbindungen beurteilt werden können, die ebenfalls in den tunnelnden Nanoröhren transportiert werden können.

Zu bildgebenden Zwecken können MSC-Mitochondrien und GSC vor dem Mitochondrientransfer mittels MitoCeption mit lebenswichtigen Farbstoffen markiert werden. Nach der Vormarkierung von GSCs mit lebenswichtigen Farbstoffen gemäß dem Textprotokoll sammeln Sie zunächst GSC-Neurosphären in einem 50-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation bei 270 mal g bei 20 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie fünf Milliliter HBSS, um die Zellen zu waschen, und drehen Sie das Röhrchen erneut.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das GSC-Pellet mit 100 Mikrolitern 0,25 % Trypsin-EDTA sanft. Dann inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter 20 millimolare Calciumchlorid in zwei Mikrolitern zu 10 Milligramm pro Milliliter DNase I in das Röhrchen.

Dissoziieren Sie die Neurosphären, indem Sie mit einer P200-Pipette 30 bis 50 Mal sanft auf und ab pipettieren, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Geben Sie 10 Mikroliter 5%igen Trypsin-Inhibitor in 10 Milliliter HBSS in die Zellen und zentrifugieren Sie die GSCs sieben Minuten lang. Anschließend werden der Überstand und 10 Milliliter GSC-Basalmedium in die Probe abgegeben.

Zählen Sie nun mit einer Thoma-Zählkammer die Zellen, bevor Sie sie erneut drehen. Fügen Sie das entsprechende Volumen des GSC-Proliferationsmediums hinzu, um ein zelluläres Konzentrat von 10 bis zum sechsten GSC pro Milliliter zu erreichen. Säen Sie dann 10 bis zu den fünften GSCs pro Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Zentrifugieren Sie die Platte so, dass sich die GSCs am Boden der Vertiefungen absetzen. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

Um die MSC-Mitochondrienisolierung durchzuführen, stellen Sie zunächst die Temperatur der Mikrozentrifuge auf vier Grad Celsius ein. Bereiten Sie zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den Bezeichnungen A und C mit Reagenzien für die Mitochondrienextraktion vor. Bereiten Sie zwei weitere Röhrchen mit den Bezeichnungen MSC und MiTo vor.

Bewahren Sie die Röhren auf Eis auf. Bereiten Sie auch Röhrchen für die Mitochondrien-Serienverdünnungen vor, die mit der Mitochondrienpräparation eingerichtet werden. Verwenden Sie 10 Milliliter PBS, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, um die MSCs zu waschen.

Waschen Sie dann die Zellen mit zwei Millilitern EDTA-freiem Trypsin 10 Sekunden lang und fügen Sie einen weiteren Milliliter Trypsin hinzu, bevor Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Verwendung von EDTA gemäß Protokoll sollte vermieden werden, insbesondere für die MSC-Trypsinisierung und für Proteasehemmer, die in der Mitochondrienvorbereitung verwendet werden. Die MSCs werden durch Zugabe von 10 Millilitern Alpha MEM 10%FBS zurückgewonnen und die Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter Alpha MEM 10%FBS zum Zellpellet. Verwenden Sie dann eine Malassez-Zählkammer, um die MSCs zu zählen, bevor Sie vier- bis fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen herunterdrehen.

Entsorgen Sie den Überstand, geben Sie einen Milliliter eiskaltes Alpha MEM 10%FBS zum Zellpellet und geben Sie die Zellen in das zuvor vorbereitete MSC-markierte Röhrchen, während Sie es weiterhin auf Eis halten. Zentrifugieren Sie dann das MSC-Röhrchen bei 900 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie sämtliches Restmedium aus dem Röhrchen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter Mitochondrien-Isolationsreagenz A mit EDTA-freien Proteaseinhibitoren zu den MSCs und wirbeln Sie fünf Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen.

Lassen Sie die Röhren dann genau zwei Minuten auf Eis. Fügen Sie 2,5 Mikroliter Mitochondrien-Isolationsreagenz B hinzu und wirbeln Sie die Zellen 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit durch, bevor Sie die Röhrchen wieder auf Eis legen. Wiederholen Sie den Wirbel fünf Minuten lang alle 30 Sekunden.

Geben Sie nun 200 Mikroliter Mitochondrien-Isolationsreagenz C mit EDTA-freien Proteaseinhibitoren in das Röhrchen und mischen Sie den Inhalt, indem Sie das Röhrchen etwa 30 Mal kippen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Den Überstand mit den MSC-Mitochondrien in das zuvor vorbereitete MiTo-Röhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.000 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie 200 Mikroliter Reagenz C, um das mitochondriale Pellet zu spülen. Dann schleudern Sie die Suspension bei 12.000 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Organellen zu pelletieren.

Um isolierte MSC-Mitochondrien auf GSCs zu übertragen, fügen Sie dem mitochondrialen Pellet 200 Mikroliter vorgekühltes GSC-Proliferationsmedium hinzu. Verdünnen Sie das mitochondriale Präparat in GSC-Proliferationsmedium, um die Zugabe von 20 Mikrolitern mitochondrialer Suspension zu den GSCs konsistent zu ermöglichen. Fügen Sie dann langsam die Mitochondrien in der Nähe des Bodens der Vertiefung hinzu.

Um das Austreten von MSC-Mitochondrien-Vitalfarbstoffen zu kontrollieren, geben Sie die gleiche Menge Mitochondrienpräparat in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte, die nur GSC-Proliferationsmedium enthält. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1.500 mal g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Dann stellen Sie die Kulturen sofort auf 37 Grad Celsius.

Um die Kontrollwells auf lebenswichtige Farbstoffleckagen zu untersuchen, säen Sie am nächsten Tag GSC-Zellen wie zuvor beschrieben aus, zentrifugieren Sie die Platte und inkubieren Sie die Kulturen dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte, die nur Mitochondrien enthält. Aspirieren Sie dann das Medium aus der GSC 96-Well-Platte und ersetzen Sie es durch den Mitochondrienüberstand.

Inkubieren Sie die GSCs mit dem Mitochondrienüberstand zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie schließlich die Analyse des Mitochondrientransfers, die FACS-Analyse und die konfokale Bildgebung gemäß dem Textprotokoll durch. GSCs sind Krebsstammzellen, die als Neurosphären gezüchtet werden, um ihre Stammzelleigenschaften zu erhalten.

Kurz vor dem mitochondrialen Transfer werden sie als einzelne Zellen ausgesät, um eine hohe Mitochondrientransfereffizienz zu ermöglichen, und am nächsten Tag, wie hier gezeigt, werden die Zellen wieder dabei beobachtet, wie sie Neurosphären bilden. In dieser Abbildung sind fluoreszenzmarkierte MSC-Mitochondrien zu sehen, die in Gb4-GSCs lokalisiert sind. Die MSC-Mitochondrien kommen in den GSCs ähnlich wie die GSC-Mitochondrien vor.

Der Transfer von MSC-Mitochondrien konnte bei den meisten GSCs in der 3D-Rekonstruktion aus konfokalen GSC-Bildern beobachtet werden, die die interzelluläre Lokalisation der übertragenen MSC-Mitochondrien bestätigen. Die Vormarkierung von GSCs sowohl mit blauzellulären als auch mit roten mitochondrialen Vitalfarbstoffen ermöglichte es, die Lokalisation der übertragenen MSC-Mitochondrien in Grün im Vergleich zu den endogenen GSC-Mitochondrien sichtbar zu machen. Wie hier gezeigt, führte die MitoCeption mit zunehmenden Mengen fluoreszierender MSC-Mitochondrien zu erhöhten FACS-Signalen, die um mehrere Größenordnungen höher waren als das Kontrollsignal.

Das hier vorgestellte Mitochondrientransferprotokoll, das an einzelligen GSCs durchgeführt wurde, zeigte eine dosisabhängige Reaktion und eine relative mittlere Fluoreszenzintensität. Obwohl der MSC-Mitochondrientransfer auch auf GSC-Neurosphären erreicht wurde, war die Wirksamkeit des Transfers auf GSCs unter diesen Bedingungen geringer als bei mitochondrialen Transfers auf GSCs, die zunächst als Einzelzellen ausgesät wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Mitochondrienpräparat immer auf Eis zu halten. Im Anschluss an diese Verfahren können andere Methoden wie FACS, konfokale Mikroskopie und QPCR an mitochondrialer DNA durchgeführt werden, um den mitochondrialen MSC-Transfer zu den Zielzellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Es können auch funktionelle Studien durchgeführt werden, um die biologischen Wirkungen der übertragenen Mitochondrien zu bestimmen.

Beachten Sie, dass diese Studien in der Regel mit geringeren Mengen an Mitochondrien durchgeführt werden als diejenigen, die zur Visualisierung des Mitochondrientransfers verwendet werden. Diese Technik wird es ermöglichen, das Ergebnis und die biologischen Wirkungen von Mitochondrien zu erforschen, die spontan zwischen Zellen entweder unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen übertragen werden, und so zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Behandlungen beitragen.