Name: MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie die MitoCeption-Methode zur Übertragung isolierter menschlicher MSC-Mitochondrien an Glioblastom-Stammzellen. Diese Technik ermöglicht die unabhängige Analyse mitochondrialer Effekte auf den Stoffwechsel und die Funktion von Krebszellen.

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Wir danken Andrea Parmeggiani (L2C und DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) sowie Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen, Christophe Duperray für die Hilfe bei der FACS-Analyse, die Montpellier RIO Imaging Facility (MRT) für die Bereitstellung von eine angemessene Umgebung für FACS und konfokale Mikroskopie. BNM wurde durch ein Graduiertenstipendium von der LABEX Numev (convention ANR-10-LABX-20) unterstützt. AB von einem Bachelor-Stipendium der Universität Warschau und der Europäischen Union unterstützt wurde (n POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV ist ein wissenschaftlicher Mitarbeiter vom Nationalen Zentrum für wissenschaftliche Forschung (CNRS).

Tag 1 1. Markieren des mesenchymalen Stammzelle (MSC) Mitochondria (Optional) <ol><li> Zwei Tage vor der Mitochondrien Präparation, Samen humane MSCs in einer 100 mm Kulturschale in 10 ml &amp; agr; MEM / 10% FBS, um bis 4 haben x 10 5 MSCs in Kultur am Tag 1. </li><li> Spülen Sie MSCs mit PBS (4 ml) und 4 ml &amp; agr; MEM / FBS 1% (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Fügen Sie die erforderliche Menge an Mitochondrien Vitalfarbstoff und inkubieren Zellen für 30 Minuten im 37 ° C-Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Mitochondrien Farbstofflösung, spülen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml vorgewärmtem (37 ° C) &amp; agr; MEM / FBS 1% und fügen Sie zurück 4 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%. Inkubiere Zellen bei 37 ° C. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium (10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%) nach 30 min und ein weiteres Mal, zwei Stunden später. </li></ol> Tag 1 2. Markierung der Glioblastom Stammzellen (GSC) (optional, siehe Diskussion Sektion) <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-mit-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Zellkulturmedium , </td><td> Zusammensetzung </td></tr><tr><td rowspan="5"> GSC Basalmedium </td><td> DMEM / F-12, ergänzt mit </td></tr><tr><td> Insulin 20 mg / ml </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung 1x </td></tr><tr><td> Glucose 3 g / L </td></tr><tr><td> L-Glutamin 2 mM </td></tr><tr><td rowspan="9"> GSC Proliferationsmedium </td><td> In den Basismedium: </td></tr><tr><td> B27 Ergänzung 1x </td></tr><tr><td> EGF 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF 10 ng / ml </td></tr><tr><td> Fungine 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Fungizone 0,25 mg / ml </td></tr><tr><td> Heparin 2 mg / ml </td></tr><tr><td> Ciprofloxacin 2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin 2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td rowspan="4"> MSC Proliferationsmedium </td><td> &amp; #945; MEM, ergänzt mit </td></tr><tr><td> L-Glutamin 2 mM </td></tr><tr><td> 10% FBS </td></tr><tr><td> bFGF 2 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kulturmedien. <ol><li> Distanzieren GSCs (Gb4 Zelllinie 32 (10 x 10 6 Zellen) als Neurosphären auf Poly-HEMA beschichteten Zellkulturflaschen gezüchtet (siehe Schritte 3,1-3,12). </li><li> Seed GSCs in einer 48-Well - Platte bei 10 5 Zellen / Vertiefung in GSC Proliferationsmedium (500 &amp; mgr; l) (siehe Tabelle 1). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Die erforderliche Menge an Zellvitalfarbstoff und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> In 500 ul GSC Basalmedium (Tabelle 1) pro Vertiefung der 48-Well - Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5 auf 2.6. </li><li> In 500 ul GSC Basismedium und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g bei 20 ° C für 5 min. Den Überstand aspirieren. </li><li> In 500 ul GSC Proliferationsmedium pro Vertiefung der 48-Well-Platte und Inkubation in dem 37 ° C Inkubator. Anmerkung: Die Menge an GSCs angegeben (10 x 10 6 Zellen) ermöglicht , die verschiedenen Dosis-Wirkungs-Experimente und FACS Kontrollen durchzuführen. Sobald die Versuchsbedingungen mehr exakt diese Menge definiert ist, kann verkleinert werden. </li></ol> Tag 2 3. Seeding von Glioblastom Stammzellen <ol><li> Sammeln Sie die GSC Neurosphären (10 x 10 6 Zellen) durch Zentrifugation bei 270 g für 5 min bei 20 ° C in einem 50 - ml - Tube. </li><li> Wasche die Zellen mit 5 ml HBSS, und die Zentrifuge bei 270 × g für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren. </li><li> resuspendieren vorsichtig die GSC-Pellet in 100 ul Trypsin-EDTA (0,25%) (je 10 x 10 <sbis&gt; 6 Zellen) </li><li> 3 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l CaCl 2 (20 mM) und 2 &amp; mgr; l DNase I (10 mg / ml). </li><li> Distanzieren die Neurosphären durch sanftes Auf- und Abpipettieren (30-50x) mit einer P200 Pipette. Vermeiden Sie Blasen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass alle GSCs gelöst sind. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Trypsin-Inhibitor (5%) und 10 ml HBSS. </li><li> Zentrifuge GSCs bei 270 xg für 7 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und 10 ml GSC Basis - Medium (Tabelle 1). </li><li> Graf GSCs mit einer Thoma-Zählkammer und dann zentrifugiert werden die Zellen bei 270 g für 7 min bei 20 ° C. </li><li> Fügen Sie das entsprechende Volumen von GSC Proliferationsmedium (Tabelle 1) , um die zelluläre Konzentration von 10 6 GSCs / ml zu erreichen. </li><li> Seed 10 5 GSCs (100 &amp; mgr; l der Zellsuspension) pro Well einer 96-Well - Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platten bei 270 g für 7 min bei 20 ° C GSCs zu erhalten bei den Bottom von Brunnen. </li><li> Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 ° C bis Abschnitt 5. </li></ol> Tag 2 4. MSC Mitochondria Isolation <ol><li> Stellen Sie die microtube Zentrifugentemperatur auf 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen &quot;A&quot; und &quot;C&quot; enthält die Reagenzien für den Mitochondrien Extraktion (200 ul Reagens A und 400 ul Reagenz C, enthalten beide die EDTA-freie Protease-Inhibitoren). Bereiten Sie zwei weitere Rohre, die mit &quot;MSC&quot; und &quot;Mito&quot;. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis. Auch bereiten Röhren für den Mitochondrien Reihenverdünnungen. </li><li> Wasch MSCs mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C) PBS. </li><li> Wash MSCs mit 2 ml Trypsin (kein EDTA) für 10 Sekunden und 1 ml Trypsin (kein EDTA). Inkubiere Zellen für 5-10 min bei 37 ° C. </li><li> Recover die MSCs durch Zugabe von 10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10%, in einen 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und fügen10 ml &amp; agr; MEM / FBS 10% zum Zellpellet. </li><li> Zählen Sie die MSCs mit einem Malassez Zählkammer. </li><li> Zentrifuge MSCs (4-5 x 10 &amp; sup5 ; ) bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen, fügen Sie 1 m eiskalter &amp; agr; MEM / FBS 10% auf dem Zellpellet und übertragen Sie die Zellen auf die &quot;MSC&quot; -markierten Rohr (hergestellt in Schritt 4.2). Halten Sie das Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen die MSCs bei 900 xg für 5 min bei 4 ° C enthält. </li><li> Entfernen Sie alle Reste des Mediums aus der Tube. </li><li> In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz A (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden und lassen Röhrchen auf Eis genau 2 min. </li><li> Hinzufügen, 2,5 ul Mitochondria Isolation Reagent B. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 10 sec, und dann Röhrchen auf Eis belassen. Wiederholen Sie alle 30 Sekunden für 5 min. </li><li> In 200 ul Mitochondria Isolation Reagenz C (die EDTA-freie Proteaseinhibitoren). Mischen Sie durch das Rohr Kippen (roughly 30-mal, nicht vortexen). Zentrifugiere die Röhrchen bei 700 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand (mit der MSC Mitochondrien) in die &quot;Mito&quot; Rohr (hergestellt in Schritt 4.2). </li><li> Zentrifuge bei 3000 xg, 15 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien. </li><li> Spülen Sie die Mitochondrien-Pellet mit 200 &amp; mgr; l des Reagenz C. Dann Zentrifuge bei 12.000 xg, 5 min bei 4 ° C, die Mitochondrien-Pellet zu erhalten. </li></ol> 5. Übertragung von isolierten MSC Mitochondria zu GSCs (MitoCeption) <ol><li> Zugabe von 200 ul der vorgekühlten (0 ° C) GSC Proliferationsmedium in die Mitochondrien - Pellet von MSCs isoliert (4 x 10 5). </li><li> Verdünnen Sie die Mitochondrien Vorbereitung (in GSC Proliferationsmedium) konsequent 20 ul mitochondriale Suspension zu den GSCs hinzuzufügen. </li><li> Füge das Volumen von isolierten Mitochondrien in die Vertiefungen der 96-well Platte die GSCs (aus Schritt 3.15), in der gewünschten Konzentration (0,1 bis 10 &amp; mgr; g) enthielt. Fügen Sie den Mitochondrien langsam, nahe dem Boden des Bohrlochs, um die gesamte Oberfläche mindestens einmal abdeckt. </li><li> MSC Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage Zur Steuerung, fügen Sie die gleichen Mengen der Mitochondrien-Präparat (0,1 bis 10 ug) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte GSC Proliferationsmedium, das nur (keine GSCs) (Teil 6.2 für Vitalfarbstoff Leckageerkennung sehen). </li><li> Zentrifuge die 96-well Platte die Mitochondrien Empfänger GSCs mit der MSC Mitochondrien (Schritt 5.3) und der Steuerplatte (Schritt 5.4) bei 1.500 xg für 15 min bei 4 ° C enthält. </li><li> Legen Sie die Kulturplatten in der 37 ° C Zellinkubators unmittelbar nach dem Zentrifugieren. Hinweis: Die Mitochondrien Übertragungsprotokoll beruht auf der Zentrifugation der Mitochondrien-Suspension auf die kultivierten Zellen am ausreichende Zentrifugationskraft, mit einer Reihe von Zentrifugationen, die in Abhängigkeit von der syst eingestellt werden kann,em von Mitochondrien Donor / Empfängerzellen. </li></ol> Tag 3 6. Analyse der Mitochondria Übertragung durch FACS und konfokale Bildgebung <ol><li> Herstellung von GSC Proben für die FACS - Analyse Hinweis: Wenn MSC Mitochondrien mit einem vitalen Farbstoff markiert wurden vorher (Abschnitt 1) ​​kann die Effizienz durch FACS überwacht werden, 24 Stunden nach der Mitochondrien Übertragung. <ol><li> Zentrifuge die 96-well Platte mit den MitoCepted GSCs bei 270 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> 100 l Trypsin (kein EDTA) in jede Vertiefung geben. 3 min bei 37 ° C inkubieren. Pipettieren nach oben und unten die Neurosphären in der 24-Stunden-Zeitraum gebildet zu distanzieren. </li><li> 100 l GSC Basalmedium. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 g für 5 min bei 20 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren GSCs in 300 ul GSC Basismedium und Transfer zum FACS angepasst Rohre. </li><li> Führen Sie die FACS einalysis. </li></ol></li><li> Steuerung für Mitochondrien Vitalfarbstoff Leckage aus dem isolierten Mitochondrien (FACS) Hinweis: Der Zweck dieses Schrittes ist es, das Hintergrund FACS-Signal zu bestimmen, die nicht eine echte MSC Mitochondrien Übertragung widerspiegeln würde, sondern vielmehr das bloße Leckage von Vitalfarbstoff aus der MSC markierten Mitochondrien für MitoCeption verwendet (Schritt 5.3). <ol><li> Seed GSC-Zellen wie in den Schritten 3,1-3,15 beschrieben. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen nur Mitochondrien enthält (aus Schritt 5,4 bis 5,6) bei 1.500 xg für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Saugen Sie das Kulturmedium aus dem GSC 96-Well-Platte (Schritt 6.2.2) und ersetzen Sie es nur durch das Medium mit Mitochondrien inkubiert (Stand aus Schritt 6.2.3). </li><li> Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen, die GSCs bei 37 ° C für 2 Stunden enthält. </li><li> Gehen Sie wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.7 für FACS-Analyse. </li></ol></li><li> Herstellung von GSC samples für die konfokale Bildgebung Hinweis: Wenn die Übertragung der MSC Mitochondrien GSCs ist durch Fluoreszenz-Bildgebung untersucht werden, wobei beide MSCs und GSCs müssen vorher markiert werden, die jeweils mit den Mitochondrien (Schritt 1) ​​und Zelle (Schritt 2) Vitalfarbstoffe. <ol><li> Bereiten Sie GSCs wie in den Schritten 6.1.1 bis 6.1.5. </li><li> Resuspendieren GSCs in 2 ml GSC Proliferationsmedium, das 2% FBS und Samen in 35 mm Kulturschalen (Glasboden). </li><li> Führen Sie die konfokale Abbildung auf den GSCs mit den übertragenen Fluoreszenz MSC Mitochondrien 24 Stunden später. </li></ol></li></ol>

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</ol>

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), mit dem CJ und ML.V. angeschlossen sind, hat eine Patentanmeldung auf der MitoCeption Technik (EP14306154.7) eingereicht.

Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass Zellen, die Mitochondrien austauschen können, und dass diese Mitochondrien haben tiefgreifende Auswirkungen auf die Zielzellstoffwechsel und Funktionen. Daher ist es wichtig, die Werkzeuge, zu beherrschen, um quantitativ die Mitochondrien aus den Spenderzellen zu diesen Zielzellen übertragen, um eine genaue Untersuchung ihrer biologischen Wirkungen zu ermöglichen. Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich Mitochondrien zu übertragen , iso...

Mitochondrien sind Organellen in eukaryotischen Zellen zu finden, wo sie eine zentrale Rolle bei der Nährstoffaufnahme sowie in der Energie- und Stoffproduktion spielen. Diese Organellen enthalten Kreis mitochondriale DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, die Proteine der Elektronentransportkette Komplexe, tRNAs und rRNAs 1 kodiert. Die Funktionalität dieser Organellen ist entscheidend für die Homöostase Zelle und mehreren Pathologien haben mit Mitochondrien - Dysfunktion 1, 2, 3 verbunden. Die Mitochondrien - Status hat , beispielsweise auf eine Entzündung, Infektionskrankheiten und Krebs in Verbindung gebracht worden, in diesem letzteren Fall mit Folgen für Metastasierung und Therapieresistenz 4, 5, 6, 7. Mitochondria zeigen die bemerkenswerte Fähigkeit von<html> Immer zwischen &quot;Spender&quot; und &quot;Ziel&quot; Zellen übertragen. Dies führt zu Änderungen im Energiestoffwechsel der Zielzellen sowie in andere funktionelle Modifikationen wie die Reparatur von Gewebe und Beständigkeit gegenüber chemotherapeutischen Mitteln, wie kürzlich von verschiedenen Laboratorien 8 gezeigt, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Die humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zeigen diese Fähigkeit Mitochondrien zu einer Vielzahl von Zielzellen zu übertragen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, Lungen alveolaren Epithelzellen, renale tubuläre Zellen und Krebszellen, Änderungen der funktionellen Eigenschaften dieser Zellen führt 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. Mitochondria Austausch erscheint nun als weit verbreiteter Mechanismus, der eine Reihe von verschiedenen Zelltypen ermöglicht, miteinander und ändern ihre biologischen Eigenschaften zu kommunizieren. Diese Mitochondrien Austausch kann Tunneling - Nanoröhrchen (TNT) Bildung kommen durch, an denen Connexin 43 enthaltenden gap junctions 8 oder M-Sec / TNFaip2 und die Exocyst Komplex 19. Alternativ wurde die Mitochondrien Übertragung auch durch Arrestin domain-containing protein 1-vermittelten Mikrovesikel (ARMMs) 20 vermittelt gezeigt werden. Interessanterweise wurde die Wirksamkeit der Mitochondrien Übertragung auf die Expressionsrate des Rho - GTPase 1 Miro1 21 verbunden ist , ein Schlüsselfaktor zur Erklärung der Unterschiede in den Mitochondrien Transfer Wirksamkeiten zwischen iPSC-MSCs und Erwachsenen BM-MSCs 22. Trotz dieser Vielzahl von Daten über Zell-zu-Zell-Mitochondrien Austausch wird relativ wenig über die metabolischen und biologischen Ergebnisse dieser Mitochondrien Übertragung bekannt. Daher voll es garantiert, dass die entsprechenden Tools einrichten, um vollständig die biologischen Wirkungen dieser Übertragung beurteilen. Im Laufe der Jahre auf mehrere technische Ansätze Mitochondrien von Spender zu Akzeptor-Zellen übertragen wurden vorgeschlagen. Dazu gehören die direkte Injektion von Mitochondrien in Oozyten 23, 24, 25, Zellfusion transmitochondrial cybrids 26, 27 zu erzeugen , und in jüngster Zeit , die Übertragung von isolierten Mitochondrien Lichtwärmeumsetzmaterial Verwendung nanoblades 28. Wir und andere haben bereits gezeigt, die Fähigkeit von isolierten mitochondria durch lebende Zellen internalisiert zu werden, sowohl in vitro als auch in vivo als beobachtet 29, 30, 31, durch Mechanismen vorgeschlagen Makropinozytose 32 einzubeziehen. Wir entwickelten außerdem ein Verfahren, genannt MitoCeption, quantitativ zu isolierten Mitochondrien übertragen (von MSCs) an die Zielzellen, wie mit dem (adhärenten) beispielhaft MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie 31. Dieses Protokoll wurde hier für die Übertragung von isolierten humanen MSC Mitochondrien Glioblastom Stammzellen (GSCs) angepasst ist. Glioblastome sind aggressive bösartige Tumoren des Gehirns, die sich schnell auf die Behandlung resistent werden, vor allem wegen Glioblastom Stammzellen (GSC) , die innerhalb des Tumors 33. Diese GSCs wachsen als Neurosphären in vitro und erzeugen Tumoren in Xenotransplantatmodellen. Krebszellen innerhalb Glioblastom haben dieKapazitäts Zell-zu-Zell Verbindungen herzustellen, wie kürzlich für Astrozyten Gehirntumorzellen gezeigt , die Zwischenverbindung über erweiterte Mikroröhrchen, durch die Mitochondrien (sowie Calcium und Zellkerne) wandern kann, was zu einer Strahlentherapie festen Astrozytom Netzwerke 34. Glioblastom können viele verschiedene Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung rekrutieren, darunter MSCs 35, 36. Wir haben gezeigt, dass MSCs können Zell-Zell-Verbindungen mit GSCs in Co-Kultur machen und übertragen ihre Mitochondrien (Daten nicht gezeigt), die voraussichtlich GSC funktionelle Eigenschaften zu modifizieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie die MitoCeption Technik Mitochondrien, isoliert vorher aus menschlichen MSCs, die menschliche GSCs mit dem Zweck zu übertragen verwendet werden können, deren funktionelle biologische Ergebnis zu bestimmen. Die multi- und hoch tumorigenen Gb4 GSC Linie 37 wurde in dieser Studie verwendet.

<table><tbody><tr><td>Mitochondrien-Isolationskit für Gewebe&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>10579663</tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement ohne Vit A (50x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11500446</tr><tr><td>HBSS ohne Ca2+ ohne Mg2+</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>poly Häm&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM ohne Glutamin</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 ohne</td><td>Glutamin Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11540566</tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I 1882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mensch&nbsp; bFGF&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>AF-100-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td></td><td></td>10104159001</tr><tr><td>Trypsin 0,25% / EDTA 1&nbsp; mM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer EDTA-freies</td><td>Sigma</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fungine&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Grün FM</td><td>Molekulare Sonden</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Rot CMXRos</td><td>Molekulare Sonden</td><td>&nbsp; M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Molekulare Sonden</td><td>&nbsp; M22426&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Grün CMFDA</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Blau CMF2HC</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Sterile Kulturschale</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Rohre</td><td>Beckman Coulter</td><td>2.523.749</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Apparatur</td><td>Gallios&nbsp;</td><td>&nbsp; 3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception: Übertragen von isolierten humanen msc mitochondrien an glioblastom stammzellen

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle für den Zellstoffwechsel, Energieerzeugung und Kontrolle der Apoptose. Eine unzureichende Funktion der Mitochondrien ist verantwortlich für die verschiedensten Krankheiten gefunden, von neurologischen Krankheiten bis hin zum Krebs. Interessanterweise haben Mitochondrien kürzlich die Fähigkeit zur Anzeige übertragen werden zwischen Zelltypen, insbesondere von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), um Krebszellen in Kokultur Bedingungen mit metabolischen und funktionellen Konsequenzen für den Mitochondrien Empfängerzellen gezeigt worden, das weiterhin den aktuellen Interesse zu verstärken für die biologischen Eigenschaften dieser Organellen. Evaluierung der Effekte der übertragenen MSC Mitochondrien in den Zielzellen ist von vorrangiger Bedeutung, die biologische Ergebnis solcher Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen. Das MitoCeption hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Übertragung der zuvor aus der Spenderzellen zu den Zielzellen isolierten Mitochondrien, MSC Mitochondrien unter Verwendungund Glioblastom Stammzellen (GSC) als Modellsystem. Dieses Protokoll ist zuvor verwendet worden, Mitochondrien, isoliert von MSCs zu übertragen, MDA-MB-231 Krebszellen haftend. Diese Mitochondrien - Transfer - Protokoll wird hier für GSCs angepasst, die die spezifische Besonderheit der wachsenden als Neurosphären in vitro präsentieren. Die Übertragung der isolierten Mitochondrien kann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und konfokaler Bildgebung Mitochondrien Vitalfarbstoffen verfolgt werden. Die Verwendung von Mitochondrien Donor- und Zielzellen mit unterschiedlichen Haplotypen (SNPs) ermöglicht auch Detektion der übertragenen basierend Mitochondrien von der Konzentration ihrer Kreis mitochondriale DNA (mtDNA) in den Zielzellen. Sobald das Protokoll mit diesen Kriterien überprüft wurde, können die Zellen, die übertragenen Mitochondrien beherbergen die Wirkungen der exogenen Mitochondrien auf biologische Eigenschaften zu bestimmen, untersucht werden, wie beispielsweise Zellstoffwechsels, Plastizität, Proliferation und Ansprechen auf die Therapie.

Die Verfahrensschritte die Isolierung von Mitochondrien aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) und deren Übertragung auf die gezielte Glioblastom Stammzellen (GSC) durch MitoCeption skizziert sind in Abbildung 1 dargestellt. GSCs sind Krebsstammzellen als Neurosphären gewachsen ihre Stammzelleigenschaften zu erhalten. Für das Protokoll werden GSCs ausgesät als einzelne Zellen ein paar Stunden vor der Übertragung der Mitochondrien (Schritt 3) zu höheren Mitochondrien Übertra...

Hier wird ein Protokoll (MitoCeption) dargestellt Mitochondrien zu übertragen, isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), zu Glioblastom Stammzellen (GSC), mit dem Ziel, ihre biologischen Wirkungen auf Stoffwechsel und GSC Funktionen studieren. kann ein ähnliches Protokoll Mitochondrien zwischen anderen Zelltypen zu übertragen, angepasst werden.

MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zuvor isolierte Mitochondrien von Donorzellen wie mesenchymalen Stammzellen auf Zielzellen wie Glioblastom-Stammzellen zu übertragen. Dieses Verfahren kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet des Stoffwechsels zu beantworten, beispielsweise bezüglich der metabolischen und biologischen Effekte von Mitochondrien, die spontan zwischen Zellen durch Prozesse wie Tunneling-Nanotubuli oder Mikrovesikel übertragen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Wirkungen der Mitochondrien unabhängig von anderen Faktoren im Mikromilieu wie Zytokinen oder Metaboliten sowie unabhängig von anderen Substanzen beurteilt werden können, die ebenfalls über Tunneling-Nanotubuli transportiert werden könnten.Zu bildgebenden Zwecken können die Mitochondrien von MSCs und GSCs vor der Mitochondrienübertragung mittels MitoCeption mit Vitalfarbstoffen markiert werden. Beginnen Sie damit, nach der Vorbehandlung der GSCs mit Vitalfarbstoffen gemäß dem Textprotokoll die GSC-Neurosphären durch Zentrifugation bei 270 × g und 20 °C für fünf Minuten in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Spülen Sie die Zellen mit fünf Millilitern HBSS u

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Tumorstammzellen von mutierten Mäusen mit ektopischen Sonic Hedgehog-Signalweg Tätigkeit stammen.

Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stem Cells

In diesem Video wird eine Methode demonstriert, die den Transfer von fluoreszenzmarkierten Mitochondrien in Glioblastom-Stammzellen (GSCs) durch Zentrifugation ermöglicht. Die erfolgreiche Aufnahme und funktionelle Integration der Donormitochondrien wird durch die Detektion der Fluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt.

Zentrifugationsunterstützter mitochondrialer Transfer in Glioblastom-Stammzellen

Tumor-Suche nach therapeutischen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) vielversprechend zur Behandlung von invasiven Glioblastom. Optimale Transplantation umfasst Lieferung von MSCs in den Tumor Resektion Hohlraum auf Gerüsten. Hierbei sind präklinische Techniken, MSC Behandlung des Glioblastoms zu studieren vorgesehen, einschließlich: bildgebende Tumor Resektion; Implantation von MSC ausgesät Gerüste; und postoperative Therapie verfolgen.

Bildgestützte Resektion der Glioblastom und intrakraniellen Implantation von therapeutischen Stammzellen entkernt Gerüste

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.

Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Cybrid-Generierung aus suspensionswachsenden Krebszellen, um die Rolle der Mitochondrien im tumorigenen Prozess zu untersuchen.

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das mitochondriale Tracing, direkte Co-Kulturverfahren von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und retinalen Pigmentepithelzellen (ARPE19) sowie die Methoden zur Beobachtung und statistischen Analyse der Bildung von tunnelnden Nanoröhren (TNT) und des mitochondrialen Transfers umfasst, um den mitochondrialen Austausch über TNTs zwischen MSCs und ARPE19-Zellen zu charakterisieren.

Mitochondrialer Transfer durch Tunneln von Nanoröhren zwischen mesenchymalen Stammzellen und retinalem Pigmentepithel in vitro

Hirnorganoide dienen als wertvolles Modell für Studien zu mitochondrialer Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnlichen Episoden (MELAS), indem sie Einblicke in ihre zugrunde liegende Pathophysiologie bieten und eine Plattform für das Wirkstoffscreening bieten. Organoide, die aus Zelllinien mit unterschiedlichem Grad an Heteroplasmie von krankheitsverursachenden Genen stammen, weisen signifikante phänotypische Unterschiede auf.

Modellierung mitochondrialer Erkrankungen anhand von Hirnorganoiden: Ein Fokus auf mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden

Exogene Mitochondrien menschlichen und murinen Ursprungs können durch Differenzierung von Präadipozyten internalisiert und während der adipogenen Differenzierung mittels bildgebender und genetischer Instrumente verfolgt werden. Obwohl diese Mitochondrien physikalisch mit dem endogenen mitochondrialen Netzwerk interagieren, erhöhen sie nicht die Expression der Marker, die mit reifen braunen Adipozyten assoziiert sind.

Exogener mitochondrialer Transfer bei der Differenzierung von braunen Adipozyten und AGPAT2-defizienten Präadipozyten

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Erfahren Sie die MitoCeption-Methode zur Übertragung isolierter menschlicher MSC-Mitochondrien an Glioblastom-Stammzellen. Diese Technik ermöglicht die unabhängige Analyse mitochondrialer Effekte auf den Stoffwechsel und die Funktion von Krebszellen.

MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

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