Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Mitochondrien der Skelettmuskulatur durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im mitochondrialen bioenergetischen Bereich zu beantworten, wie z.B. Krankheiten und Syndrome, die mit mitochondrialer Dysfunktion verbunden sind, wie z.B. diverse neurologische Erkrankungen, Sepsis und altersbedingte Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist das Fehlen der meisten zytologischen Faktoren in der isolierten mitochondrialen Präparation, die die Analyse der Mitochondrienfunktionen beeinträchtigen können. Das Verfahren wird von Sandra Nansoz, der Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, besorgen Sie sich ein Becherglas mit Skelettmuskelproben, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie den Becher auf einen Eiskübel. Mit einer feinen Schere den Muskel in ein bis zwei Millimeter große Stücke hacken.

Spülen Sie anschließend das gehackte Tuch zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer mit 20 Millilitern pro Waschgang ab. Suspendieren Sie das gewaschene Gewebe in 10 Millilitern Isolationspuffer pro Gramm Gewebe und fügen Sie dann fünf Milligramm Protease-G-Gewebe hinzu. Dann den Becher mit einem Magnetrührer in ein Eisbad geben und 10 Minuten rühren.

Danach verdünnen Sie die Suspension mit weiteren 10 Millilitern Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % entfettetem BSA pro Gramm Gewebe. Dekantieren Sie anschließend den gesamten Isolationspuffer aus dem Becherglas. Waschen Sie das Tuch zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % BSA, mit 20 Millilitern pro Waschgang.

Suspendieren Sie dann das Gewebe in 10 Millilitern BSA-supplementiertem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe. Verwenden Sie einen halbautomatischen Glashomogenisator mit einem locker sitzenden Stößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Als nächstes wird das Homogenat in ein Zentrifugationsröhrchen überführt und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 10.000 G zentrifugiert.

Entsorgen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette. Suspendieren Sie das Pellet mit 10 Millilitern eiskaltem, mit BSA angereichertem Isolationsmedium pro Gramm Gewebe. Die Suspension wird bei 350 mal G 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Verwenden Sie danach eine serologische Pipette, um den Überstand zu reservieren, und verwerfen Sie das Pellet. Filtrieren Sie den Überstand durch zwei Schichten Gaze in ein auf Eis gehaltenes Becherglas. Die filtrierte Suspension wird in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius 7.000 Mal G zentrifugiert.

Entsorgen Sie dann den Überstand. Suspendieren Sie das rohe mitochondriale Pellet in fünf Millilitern BSA-supplementiertem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe. Zentrifugieren Sie diese Suspension 7.000 Mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie anschließend den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 20 Millilitern Waschpuffer. Zentrifugieren Sie bei 7.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Resuspensions- und Zentrifugationsvorgang noch einmal.

Danach wird der Überstand entsorgt und das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer wieder suspendiert. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einer beliebigen Standardmethode. Bewahren Sie dann die konzentrierte mitochondriale Suspension auf Eis auf, bis Sie für die Durchführung von Respirometrie-Assays bereit sind.

Zu Beginn resuspendieren Sie das mitochondriale Konzentrat im Atmungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter mitochondrialem Protein. Als nächstes saugen Sie das Atmungsmedium aus der luftkalibrierten Oxygraphenkammer ab. Fügen Sie 2,1 Milliliter isolierte mitochondriale Suspension hinzu.

Setzen Sie einen Stopfen ein, um die Oxygraphkammer zu verschließen. Rühren Sie dann die mitochondriale Suspension kontinuierlich bei 700 U/min bei 37 Grad Celsius um. Zeichnen Sie die Zellatmung zu Studienbeginn drei bis fünf Minuten lang auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.

Um eine komplexe I-abhängige Atmung zu beginnen, injizieren Sie 12,5 Mikroliter 0,8 molares Malat durch die Titan-Injektionsöffnung des Stopfens in eine Oxygraphenkammer, die mit der isolierten mitochondrialen Suspension vorbereitet wurde. Injizieren Sie dann 10 Mikroliter Glutamat mit zwei Molaren. Zeichnen Sie die Zellatmung drei bis fünf Minuten lang auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.

Injizieren Sie danach 10 Mikroliter 0,05 molare ADP durch die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis das Sauerstoffflusssignal zunimmt, dann abnimmt und stabilisiert. Für die komplexe II-abhängige Atmung injizieren Sie zwei Mikroliter 0,2 millimolares Rotenon in eine Oxygraphenkammer, die mit isolierter mitochondrialer Suspension hergestellt wurde.

Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist. Injizieren Sie dann 20 Mikroliter eines molaren Succinats. Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.

Injizieren Sie danach 10 Mikroliter 0,05 molare ADP durch die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis das Sauerstoffflusssignal zunimmt, dann abnimmt und stabilisiert. Für die komplexe IV-abhängige Atmung injizieren Sie 2,5 Mikroliter 0,8 millimolares Ascorbat in eine Oxygraphenkammer, die mit isolierter mitochondrialer Suspension hergestellt wurde.

Als nächstes injizieren Sie sofort 2,5 Mikroliter 0,2 molare TMPD und 10 Mikroliter 0,05 molare ADP. Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist. Injizieren Sie dann 10 Mikroliter eines molaren Natriumazids.

Zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis das Sauerstoffflusssignal abnimmt und sich dann stabilisiert. In dieser Studie werden intakte Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur isoliert. Komplexe I-abhängige Atemfrequenzen werden dann mittels hochauflösender Respirometrie gemessen.

Wie zu sehen ist, steigt die mitochondriale Atmungsrate unmittelbar nach der Zugabe von ADP an. Die Atmungsrate sinkt nach ADP-Depletion auf ein ähnliches Niveau wie vor der Zugabe von ADP. Dies deutet darauf hin, dass das Verhältnis von Zustand 3 und Zustand 4, das als Respiratory Control Ratio (RCR) bekannt ist, hoch ist und dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.

Komplex-II-abhängige Atemfrequenzen werden dann beobachtet, indem die komplexe I-Atmung mit Rotenon gehemmt und das komplexe II-Substrat Succinat injiziert wird. Dann wird ADP hinzugefügt, was zu einer sofortigen Erhöhung der Atmung führt. Sobald ADP erschöpft ist, sinkt die Atmung auf ein ähnliches Niveau wie vor der Zugabe von ADP, was auf eine hohe RCR hinweist, da die mitochondriale Integrität während der Isolierung gut erhalten bleibt.

Komplexe IV-abhängige Respirationsraten werden durch Zugabe von Ascorbat, TMPD und ADP beobachtet. Natriumazid wird dann zugegeben, um den Komplex IV zu hemmen. Der Unterschied im Sauerstoffverbrauch vor und nach der Zugabe von Natriumazid wird als die tatsächliche komplexe IV-Atmung interpretiert. Die hohe komplexe IV-abhängige Respirationsrate, die in Zustand 3 beobachtet wurde, deutet darauf hin, dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als eineinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sauerstoffsensoren vor der Homogenisierung zu kalibrieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Messungen des zellulären ADP-Gehalts, des mitochondrialen Membranpotentials und der enzymatischen Aktivität der ATP-Synthase als Substratspiegel durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Veränderungen der Atemfrequenz auf einen Mangel an mitochondrialem Substrat, Membranpotenzial oder eine verringerte enzymatische Aktivität der ATP-Synthase zurückzuführen sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien aus einem Skelettmuskel durch differentielle Zentrifugation isoliert und wie man die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I, II und IV mit hochauflösender Respirometrie misst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des mitochondrialen Energiestoffwechsels, um die Energiefunktion der Mitochondrien in Bereichen wie genetischen Mitochondrienerkrankungen, Myopathien, Ischämie, Reperfusionsschäden in isolierten Mitochondrien zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Antimycin A, Rotenon, Natriumazid und FCCP äußerst gefährlich sein kann.

Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.