Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe durch Differenzzentrifugation zu isolieren und die Atmungsraten der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mitochondrialen Bioenergetik zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit Erkrankungen und Syndromen, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiert sind, wie vielfältige neurologische Erkrankungen, Sepsis und altersbedingte Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Abwesenheit der meisten zytoplasmatischen Faktoren in der isolierten mitochondrialen Präparation, die die Analyse der mitochondrialen Funktionen stören könnten. Die Durchführung des Verfahrens wird Sandra Nansoz, die Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen Becher mit Skelettmuskelproben gemäß dem schriftlichen Protokoll beschaffen. Stellen Sie den Becher auf einen Eisbehälter. Zerkleinern Sie das Muskelgewebe mithilfe einer feinen Schere in Stücke von ein bis zwei Millimetern Größe.

Anschließend wird das zerkleinerte Gewebe zweimal mit jeweils 20 Milliliter eiskaltem Isolationspuffer gewaschen. Das gewaschene Gewebe wird in 10 Milliliter Isolationspuffer pro Gramm Gewebe suspendiert und anschließend 5 Milligramm Protease-G-Gewebe zugegeben. Danach wird das Becherglas in ein Eisbad mit einem magnetischen Rührer gestellt und 10 Minuten gerührt.

Danach die Suspension mit weiteren 10 Millilitern Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % entfettetem BSA pro Gramm Gewebe, verdünnen. Anschließend den gesamten Isolationspuffer aus dem Becher abgießen. Das Gewebe zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % BSA, waschen, wobei jeweils 20 Milliliter pro Waschgang verwendet werden.

Anschließend das Gewebe in 10 Milliliter BSA-haltigem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe erneut suspendieren. Das Gewebe mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator und einem locker sitzenden Stößel homogenisieren. Danach das Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen überführen und bei 10.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Verwerfen Sie den Überstand mithilfe einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 Milliliter eiskaltem, mit BSA angereichertem Isolationsmedium pro Gramm Gewebe. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 350 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Verwenden Sie danach eine serologische Pipette, um den Überstand aufzubewahren, und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie den Überstand durch zwei Lagen Gaze in einen auf Eis stehenden Becher. Überführen Sie die filtrierte Suspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 7.000 × g und vier Grad Celsius.

Danach den Überstand verwerfen. Das rohe mitochondriale Pellet in fünf Milliliter BSA-supplementiertem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe resuspendieren. Diese Suspension bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 7.000 × g zentrifugieren.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Waschpuffer. Zentrifugieren Sie bei 7.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Resuspensions- und Zentrifugationsvorgang ein weiteres Mal.

Danach die Überstände verwerfen und das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer erneut suspendieren. Die Proteinkonzentration mit einer gängigen Methode bestimmen. Den konzentrierten mitochondrialen Suspension anschließend auf Eis lagern, bis die Respirometrie-Assays durchgeführt werden.

Als Erstes das mitochondriale Konzentrat im Atmungspuffer suspendieren, um eine Endkonzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter mitochondrialem Protein zu erreichen. Anschließend das Atmungsmedium aus der luftkalibrierten Oxygraphkammer absaugen. 2,1 Milliliter der isolierten mitochondrialen Suspension hinzufügen.

Setzen Sie einen Stopfen ein, um die Oxygraphiekammer zu verschließen. Rühren Sie die mitochondriale Suspension anschließend kontinuierlich mit 700 U/min bei 37 Grad Celsius um. Registrieren Sie die zelluläre Atmung zunächst über drei bis fünf Minuten, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.

Um die Atmung über Komplex I zu starten, injizieren Sie 12,5 Mikroliter einer 0,8-molaren Malat-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit der isolierten mitochondrialen Suspension vorbereitet wurde, durch den Titan-Injektionshafen des Stopfens. Anschließend injizieren Sie 10 Mikroliter einer zwei-molaren Glutamat-Lösung. Registrieren Sie die zelluläre Atmung drei bis fünf Minuten lang, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist.

Danach injizieren Sie 10 Mikroliter einer 0,05-molaren ADP-Lösung über die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die zelluläre Atmung auf, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal ansteigt, dann abfällt und sich stabilisiert. Für die Atmung, die von Komplex II abhängt, injizieren Sie zwei Mikroliter einer 0,2-Millimolaren Rotenon-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit einer Suspension isolierter Mitochondrien vorbereitet wurde.

Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist. Dann injizieren Sie 20 Mikroliter einer einmolarigen Succinatlösung. Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist.

Danach injizieren Sie 10 Mikroliter einer 0,05-molaren ADP-Lösung über die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die zelluläre Atmung auf, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal ansteigt, dann abfällt und sich stabilisiert. Für die Atmung, die von Komplex IV abhängt, injizieren Sie 2,5 Mikroliter einer 0,8-millimolaren Ascorbat-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit einer Suspension isolierter Mitochondrien vorbereitet wurde.

Als Nächstes sofort 2,5 µL 0,2 M TMPD und 10 µL 0,05 M ADP injizieren. Die zelluläre Atmung aufzeichnen, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist. Anschließend 10 µL 1 M Natriumazid injizieren.

Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal abnimmt und sich anschließend stabilisiert. In dieser Studie werden intakte Mitochondrien aus Skelettmuskel isoliert. Anschließend werden die komplex I-abhängigen Atmungsrate mittels hochauflösender Respirometrie gemessen.

Wie zu sehen ist, steigt die mitochondriale Atmungsrate unmittelbar nach der Zugabe von ADP an. Nach der Erschöpfung von ADP nimmt die Atmungsrate wieder auf Werte ab, die denen vor der ADP-Zugabe ähneln. Dies zeigt an, dass das Verhältnis von Zustand 3 zu Zustand 4 – bekannt als respiratorisches Kontrollverhältnis oder RCR – hoch ist und dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.

Anschließend werden die von Komplex II abhängigen Atmungsraten beobachtet, indem die durch Komplex I vermittelte Atmung mit Rotenon gehemmt und das Substrat Succinat für Komplex II zugegeben wird. Die Zugabe von ADP führt zu einem unmittelbaren Anstieg der Atmung. Sobald das ADP verbraucht ist, sinkt die Atmung auf Werte ab, die denen vor der ADP-Zugabe ähneln, was auf ein hohes RCR hinweist und darauf, dass die mitochondriale Integrität während der Isolierung gut erhalten blieb.

Die Atmungsrate, die von Komplex IV abhängt, wird durch Zugabe von Ascorbat, TMPD und ADP beobachtet. Anschließend wird Natriumazid zugegeben, um Komplex IV zu hemmen. Die Differenz im Sauerstoffverbrauch vor und nach der Zugabe von Natriumazid wird als die eigentliche Atmung über Komplex IV interpretiert. Die hohe, von Komplex IV abhängige Atmungsrate, die im Zustand 3 beobachtet wird, zeigt an, dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als eineinhalb Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Sauerstoffsensoren vor der Homogenisierung kalibriert zu haben. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung des zellulären ADP-Gehalts, des mitochondrialen Membranpotentials oder der enzymatischen Aktivität der ATP-Synthase in Abhängigkeit von Substratkonzentrationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Veränderungen der Atmungsrate auf einem Mangel an mitochondrialem Substrat, am Membranpotential oder an einer verminderten enzymatischen Aktivität der ATP-Synthase beruhen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien aus einer Skelettmuskulatur durch Differenzialzentrifugation isoliert und wie man die Atmungsraten der mitochondrialen Komplexe I, II und IV mithilfe einer hochauflösenden Respirometrie misst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich des mitochondrialen Energiestoffwechsels die energetische Funktion von Mitochondrien in Bereichen wie genetischen mitochondrialen Erkrankungen, Myopathien und Ischämie-Reperfusionsschäden an isolierten Mitochondrien untersuchen konnten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Antimycin A, Rotenon, Natriumazid und FCCP äußerst gefährlich sein kann.

Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.