Name: Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Lernen Sie die Isolierung intakter Mitochondrien aus Skelettmuskel durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Respirationsmessungen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der mitochondrialen Funktion.

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Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (Grant 32003B_127619) unterstützt.

Die Quadrizeps Muskelbiopsie aus einem narkotisierten Schwein genommen, aus denen Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden. Das Schwein wird danach für ein anderes Experiment verwendet. Die Studie wird in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Zustimmung des Animal Care Committee des Kantons Bern, Schweiz durchgeführt. 1. Skelettmuskel Homogenisieren und Mitochondriale Isolation <ol><li> Excise 5-10 g Quadrizeps Probe von einem narkotisierten Schwein. Im vorliegenden Test verwenden Schweineskelettmuskel. Dieses Protokoll kann auch von anderen Spezies Mitochondrien zu isolieren , verwendet werden (zB Ratten, Mäuse, Mensch, etc.). HINWEIS: Dieser Schritt ist von einem Facharzt mit Erfahrung in der Chirurgie durchgeführt wird. <ol><li> Sedate Schweine mit intramuskulär Ketamin (20 mg / kg) und Xylazin (2 mg / kg), vor der Narkose mit intra induziertvenöse Midazolam (0,5 mg / kg, sowie Atropin 0,02 mg / kg). Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit kontinuierlicher intravenöser Infusion von Propofol (4-8 mg / kg pro h) und Fentanyl (30 &amp; mgr; g / kg pro h) während der Operation. </li></ol></li><li> Sofort tauchen in ein Becherglas mit 20 ml eiskaltem mitochondrialen Isolationspuffer (Tabelle 1) , um die Gewebeprobe. HINWEIS: Die Puffer während der Homogenisierung verwendet und Zentrifugationen sollte mit Cytosol kompatibel mit einer ionischen und osmotische Stärke eine physiologisch relevanten pH eiskalt und haben sein. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe in das Becherglas auf einer analytischen tarierten Balance. Tarieren mit dem Becher 20 ml Isolationspuffer enthält. </li><li> Das Becherglas auf einem Eiskübel. HINWEIS: alle nächsten Schritte aus, um für die Homogenisierung Verfahren bei der Eiskübel Temperatur und halten alle Puffer auf dem Eis Eimer. </li><li> Mince die Skelettmuskulatur in den Becher (auf Eis halten) in 1-2 mm kleine Stücke für 3-4 min mit feinen scissors. </li><li> Spülen Sie das zerkleinerte Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Suspendieren des Gewebes in 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), die 5 mg Protease / g Gewebe. </li><li> Das Becherglas in einem Eisbad auf den Magnetrührer und unter Rühren für 10 min. </li><li> Verdünne die Suspension in dem Becherglas mit zusätzlichen 10 Volumina des Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) entfettetes Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Dekantieren alle der Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt und spülen das Gewebe im Becherglas zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer mit 0,2% BSA ergänzt war (jeweils 20 ml Waschschritt). </li><li> Resuspendieren des Gewebes in 10 Volumina Isolationspuffer pro Gewebegewicht (g) mit 0,2% BSA ergänzt mit entfetteter. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator (auf Eis gehalten) mit einem locker sitzende Stößel (10 Schläge). HINWEIS: Homogenize die Gewebe immer in der gleichen Weise (gleiche Anzahl von Schlägen, beispielsweise 10 Hübe). Eine höhere Anzahl von Hüben beschädigen und entkoppeln kann die Mitochondrien. Vorzugsweise homogenisieren das Gewebe eines automatisierten Homogenisator. Manuell (und subjektiv) homogenisierte Gewebeproben in Glas Homogenisatoren können unterschiedliche Qualitäten von isolierten Mitochondrien produzieren. </li><li> Zentrifuge das homogenisierte Gewebe bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x g. HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden in Zentrifugen mit Festwinkelrotoren ausgeführt. </li><li> Überstand verwerfen eine serologische Pipette und das Pellet in BSA-ergänzt eiskaltem Isolationsmedium (10 ml / g Gewebe). </li><li> Zentrifugiere die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 350 x g. </li><li> Reservieren Sie den Überstand eine serologische Pipette und verwerfen das Pellet (Zelltrümmer). </li><li> Filtriere den Überstand in einen Becher (auf Eis gehalten) durch zwei Lagen Gaze (17 Fäden / cm 2) zu entfernen Zelle DEBRist. </li><li> Zentrifuge die filtrierte Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in dem Isolationspuffer (5 ml / g Gewebe), supplementiert mit 0,2% (Gewicht / Volumen) BSA und zentrifugiert die Suspension bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer (Tabelle 1). Zentrifugiere die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7.000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in Waschpuffer und Zentrifugieren Sie die Suspension wieder bei 4 ° C für 10 min bei 7000 x g. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren das rohe mitochondriale Pellet in 1,0 ml Waschpuffer. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Mitochondrien-Suspension und halten Sie die konzentrierte mitochondriale Suspension auf Eis. HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann mit jedem Standard-Methode gemessen werden. </li><li> Grade bevorzu Respirationstest Assays resuspendieren in dem Atmungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,4 mg / mL mitochondrialen Protein die mitochondriale Suspension. </li></ol> 2. Hochauflösende Respirationstest <ol><li> Pipette 2,1 ml Atmungspuffer (Tabelle 1) 16 in eine hochauflösende Oxygraph Kammer und rühren Sie den Puffer kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer unter Verwendung von (700 rpm) bei 37 ° C für 1 h , bis eine stabile Sauerstofffluss Signal der polarographischen Sauerstoffsensor erhalten wird. HINWEIS: Polarographische Sauerstoffelektroden in jeder Oxygraph Kammer, um die Sauerstoffkonzentration zu messen und den Sauerstoffverbrauch (Fluss) in jeder Kammer zu berechnen. Die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstoffverbrauch Raten (Fluss) sind Echtzeit-Online in einem Computer zur Datenerfassung und Analyse unter Verwendung von Software angezeigt. Darüber hinaus, um genaue und zuverlässige Ergebnisse, instrumental Sauerstoff Hintergrundkorrektur sollte, um sicherzustellen seinnach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. HINWEIS: Genau 2,1 ml Atmungspuffer wird für die Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Führen Sie eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors nach Protokollen des Herstellers 17. HINWEIS: Während der Luftkalibrierung, mit einer Gasphase vorhanden ist, die Medien Sauerstoffkonzentration in der Größenordnung von 15-20 min ins Gleichgewicht wird. Je nach Temperatur, Luftdruck und die Löslichkeit von Medien -Sauerstoff-Konzentration kann berechnet werden. </li><li> die Atmung Medium aus der Oxygraph Kammer Nach Luftkalibrierung, absaugen und 2,1 ml isolierter Mitochondrien-Suspension (0,4 mg / ml mitochondriale Protein) aus Schritt 1.24 zu einer Kammer des Oxygraph hinzuzufügen. HINWEIS: Das Volumen der Atmungspuffer ist abhängig von der Geräteeinstellung und Hersteller. Für hochauflösende Respirometrie, die 2,1 ml der Atmung buffer zur Kalibrierung eines abschließenden Kammervolumen von 2,0 mL in die Kammer hinzugefügt, nachdem die Stopfen verschließen. </li><li> Schließen der Oxygraph Kammer durch Einführen des Stopfens. </li><li> Rühren Sie die mitochondriale Suspension kontinuierlich einen magnetischen Rührstab in der Kammer (700 Umdrehungen pro Minute) bei 37 ° C und Aufzeichnung der Zellatmung zu Beginn der Studie unter Verwendung von 3-5 min, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. HINWEIS: Die Sauerstoffkonzentration und Sauerstofffluss - Signal in Echtzeit online in einem Computer angezeigt unter Verwendung von Software zur Datenerfassung und Analyse 17. </li><li> Anschließend injizieren Substrate und Inhibitoren für die mitochondriale Atmung durch die Titan-Injektionsöffnungen der Anschläge die folgenden Standardprotokolle verwenden. </li></ol> 3. Komplexe I-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer die isolierte mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren enthält, in den Schritten von 2,1 bis 2,5 undwarten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Oxygraph enthaltenden Kammer getrennt mitochondriale Suspension (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung der Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. Hinweis: alle Injektionen in den folgenden Schritten werden durch die Titan-Injektionsöffnungen von Anschlägen durchgeführt Spritzen verwenden. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen erhöht mitochondrialen Atmung, bis die Sauerstoffflusssignal, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Das Plateau der Atmung nach ADP hinaus zeigt an, dass ADP-Konzentration hoch und sättigenden war. Je nach der Menge der Mitochondrien während der Atmung verwendet wird, sollte ADP-Konzentration titriert werden,für einen stabilen Zustand 3 Sauerstoffverbrauch (maximale Atmung). Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal erhöht (Zustand 3 Atmung) induzieren. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 4. Komplexe II-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem in den Schritten beschriebenen Verfahren 2,1-2,5 und für ein stabiles Signal warten. </li><li> Injizieren 2 ul 0,2 mM Rotenon (0,2 uM), &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Stopfens unter Verwendung einer Spritze und die Zellatmung für 3-5 min, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal aufzuzeichnen erreicht. HINWEIS: Rotenon ist ein gefährliches Gift und kann erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. </li><li> Einzuspritzen 20 ul 1 M Succinat (10 mM) in die Oxygraph chBernstein und Rekord mitochondriale Atmung für 3-5 Minuten, bis eine stabile Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Kammer durch die Oxygraph Titan Injektionsöffnung der Kammer Topfen und aufzuzeichnen Zellatmung, bis der Sauerstoffflusssignal ansteigt, stabilisiert, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). HINWEIS: Die Zugabe von ADP in der mitochondrialen Suspension wird eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs und der Sauerstoffflusssignal auslösen wird (Zustand 3 Atmung) erhöhen. Nachdem der ADP verbraucht wird, wird der Sauerstofffluss Signal (Zustand 4 Atmung) zu verringern. </li></ol> 5. Komplex IV-abhängige Respiration <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Dann injizieren 2,5 ul von 0,8 mM Ascorbat (1 mM). Unmittelbar danach 2,5 &amp; mgr; l von 0,2 injizierenM TMPD (0,25 mM) und 10 &amp; mgr; l von 0,05 M ADP (0,25 mM) in die Oxygraph Kammer und Aufzeichnung der Zellatmung, bis das Signal erhöht Sauerstofffluss und stabilisiert (3-5 min). </li><li> injizieren schließlich 10 &amp; mgr; l von 1 M Natriumazid (5 mM) &quot;Vorsicht&quot; in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung, bis die Sauerstoffflusssignal ab und stabilisiert. HINWEIS: Natriumazid ein gefährliches Gift ist und einen erheblichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben kann. </li></ol> 6. Cytochrome C-Test <ol><li> Bereiten Sie eine Oxygraph Kammer isolierte mitochondriale Suspension, die (0,4 mg / ml) nach dem Verfahren in den Schritten 2.1 bis 2.5 des Protokolls und warten auf ein stabiles Signal. </li><li> Injizieren von 12,5 &amp; mgr; l von 0,8 M Malat (5 mM Endkonzentration) und 10 &amp; mgr; l 2 M Glutamat (10 mM Endkonzentration) in die Kammer Oxygraph isoliert mitochondriale Suspension mit (0,4 mg / ml) durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer stopperund notieren Sie die Zellatmung für 3-5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li><li> Einzuspritzen 10 ul 0,5 M ADP (2,5 mM) in die Oxygraph Kammer durch die Titaninjektionsöffnung der Kammer Topfen und Aufzeichnung mitochondrialen Atmung, bis der Sauerstoffflusssignal zunimmt, nimmt dann ab und stabilisiert (3-5 min). </li><li> Schließlich injizieren 5 ul 4 mM Cytochrom c (10 &amp; mgr; M) in die Oxygraph Kammer und aufzuzeichnen Zellatmung für 5 Minuten, bis ein stabiler Sauerstoffflusssignal erreicht wird. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll hoher Qualität, intakt und eng gekoppelten Skelettmuskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation isoliert werden, die für funktionelle Studien wie hochauflösenden Respirometrie verwendet werden kann. Um intakt und eng gekoppelten Mitochondrien zu isolieren, gibt es einige kritische Punkte im Rahmen der vorliegenden Protokoll berücksichtigt werden. Nach dem Skelettgewebe Ernte, sollte es sofort in eiskaltem mitochondrialen Iso...

Mitochondriale Bioenergetik und Atemkapazitäten können in permeabilisierten Zellen oder Fasern nicht nur untersucht werden, sondern auch in isolierten Mitochondrien. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll intakten Skelettmuskel Mitochondrien mit differenzieller Zentrifugation für hochauflösende Respirometrie Messungen zu isolieren. Zur Isolierung intakte Mitochondrien für Respirometrie wird das Gewebe homogenisiert und Mitochondrien werden durch ein herkömmliches Verfahren isoliert differentielle Zentrifugation. Die differentielle Zentrifugation Methode basiert auf sequenzielle Zentrifugationen basiert (in einer Reihe von zunehmenden Geschwindigkeit) von Gewebe - Homogenate wurde durch Pallade und Mitarbeiter zuerst eingeführt fast 70 Jahre vor 1. Das Gewebe wird zunächst mit einer Schere zerkleinert und mechanisch in einem Glas-Homogenisator mit einem locker sitzende Stößel homogenisiert. Danach wird das Homogenisat bei niedriger Geschwindigkeit und das resultierende Pellet zentrifugiert, das ununterbrochene Gewebe enthält, zelluläreTrümmer und Kerne wird verworfen. Dann wird der Überstand mehrmals mit hoher Geschwindigkeit und die mitochondriale angereicherte Fraktion wird gesammelt zentrifugiert. Die Vorteile der differentiellen Zentrifugationsverfahren zu isolieren Mitochondrien sind, dass: i) das Verfahren ist schnell und Mitochondrien innerhalb 1-1,5 h (respiratorische Experimenten isoliert werden sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden); ii) es ist preiswert; und iii) es ist sehr leistungsfähig und die durch differentielle Zentrifugation erhalten Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie Assays. Die Nachteile der differentielle Zentrifugation Methode zur Isolierung Mitochondrien sind, dass i) die Mitochondrien beschädigt werden könnte und abgekoppelt während der Homogenisierung; ii) die Verunreinigung der Mitochondrien mit anderen zellulären Komponenten (könnte die mitochondriale Pellet mit weiteren Zentrifugationsschritte) durch weiteres Waschen gelöst werden; iii) die Möglichkeit , verschiedene mitochondriale Subpopulationen von der Auswahl, zum Beispiel während einer differenziellen Zentrifugationen Schritte, mitochondria mit niedriger Dichte kann 7 ausgeschlossen werden; und iv) die mitochondriale Zell umgebenden fehlt und nur die theoretische maximale Atmung gemessen werden. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung Mitochondrien für Respirometrie Assays ist die Dichtegradientenzentrifugation 2. Bei dieser Technik wird der Gewebeextrakt über eine Lösung von Sucrose oder einem Percoll-Gradienten überlagert (mit höherer Dichte auf dem Boden des Zentrifugenröhrchen) und mit einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, die Mitochondrien verursacht von anderen zellulären Bestandteilen isoliert werden entsprechend ihrer Dichten. Diese Methode wird häufig verwendet, Gehirn Mitochondrien aus Synaptosomen mit sehr geringer Kontamination zu isolieren. Jedoch werden die Rattenleber - Mitochondrien isoliert durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit anderen Zellorganellen 3 stark verunreinigt. Eine der Beschränkungen dieses Verfahrens besteht darin, daß die vorliegende Sucrosegradienten in dem Zentrifugationsröhrchen bersten könnte somich Mitochondrien (osmotischer Schock). Je nach der Art des Gewebes; gibt es einige wichtige Faktoren für die Isolierung von intakten Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu betrachten. Die erste Notwendigkeit ist Gewebe auf sanfte Weise zu homogenisieren. Weiches Gewebe wie Niere, Gehirn und Leber erfordern sanfte mechanische Kräfte während der Homogenisierung angewendet. Dies steht im Gegensatz zu Hartgewebe wie Herz- und Skelettmuskel, die viel stärkere mechanische Kräfte erfordern. Das zerkleinerte Gewebe wird in der Regel mit Proteinase vor der Homogenisierung behandelt, um das Gewebe zu erweichen. Alle Puffer während der Homogenisierung und Zentrifugation verwendet werden , sollten mit Cytosol mit einer ionischen und osmotische Stärke kompatibel einen physiologisch relevanten pH eiskalt sein und haben 4, 5. Einer der Vorteile von isolierten mitochondrialen bioenergetischen studieren ist, dass zelluläre Plasmamembranen brauchen nicht permeabi seinlized mit Detergenzien wie Saponin Digitonin oder 4, 6, die den mitochondrialen Außenmembran Integrität beeinträchtigen könnten. Ein weiterer Vorteil der isolierten Mitochondrien ist das Fehlen von anderen cytosolische Faktoren, die mit der Analyse des mitochondrialen Funktionen wie Sauerstoffverbrauch stören können. Die Nachteile der isolierten Mitochondrien verwenden , sind die mögliche Auswahl bestimmter mitochondrialer Populationen während der Zentrifugationsschritte, Schäden an den Mitochondrien während der Homogenisierung und die Voraussetzung für die hohe Mengen an biologischen Proben , um eine gute Ausbeute an isolierten Mitochondrien 7, 8 zu erhalten. Nach dem Isolierungsverfahren, die Atemfrequenz der mitochondrialen Komplexe I-, II- und IV-abhängige (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie ermittelt. Für komplexe I-driven Atmung, Glutamatund Malat werden zugegeben, gefolgt von Adenosindiphosphat (ADP), gefolgt. Für komplexe II-driven Atmung wird Succinat zugegeben, gefolgt von ADP gefolgt. Für komplexe IV gesteuerte Atmung, Ascorbat und tetramethylphenylendiamine (TMPD) zugegeben , gefolgt von ADP 9, 10, 11, 12. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart von Substraten allein. Zustand 3 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in Gegenwart von Substraten und ADP. Zustand 4 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch nach der ADP Verarmungs. Die Atemkontrolle Verhältnis (RCR) ist ein Index der Kopplung von ATP - Produktion Sauerstoffverbrauch und wird als das Verhältnis zwischen dem Zustand 3 und Zustand 4 13 berechnet, 15. Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll funktionale und intakte Skelett-Muskel Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation zu isolieren und verwenden diese isoliert mitochondria für funktionelle und bioenergetischen Studien wie hochauflösenden Respirometrie.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemikalie, gelöst in Ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbat</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma,G</td> <td>1626</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>K-Lactobionat</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Chemischer</td></tr><tr><td>O2k-Kern: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Hochauflösendes Respirometrie-Gerät</td></tr><tr><td>Proteinase, bakteriell</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemikalie, in Ethanol lösen</td></tr><tr><td>Succinat</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Schütt homogen-plus halbautomatischer Homogenisator&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Gewebehomogenisator</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemie</td></tr></tbody></table>

isolation of intact mitochondria von skeletal muscle durch differentielle zentrifugation für hochauflösende messungen respirationstest

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondrien sind am zellulären Energiestoffwechsel beteiligt und nutzen Sauerstoff, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren. Die differentielle Zentrifugation bei niedriger und hoher Geschwindigkeit wird häufig verwendet, um Mitochondrien aus Geweben und kultivierten Zellen zu isolieren. Rohe mitochondriale Fraktionen, die durch Differenzzentrifugation gewonnen werden, werden für respirometrische Messungen verwendet. Die Differentialzentrifugationstechnik basiert auf der Trennung von Organellen nach ihrer Größe und Sedimentationsgeschwindigkeit. Die Isolierung der Mitochondrien erfolgt unmittelbar nach der Gewebeentnahme. Das Gewebe wird in ein eiskaltes Homogenisierungsmedium getaucht, mit einer Schere zerkleinert und in einem Glashomogenisator mit einem locker passenden Stößel homogenisiert. Die Differenzialzentrifugationstechnik ist effizient, schnell und kostengünstig und die durch Differenzzentrifugation gewonnenen Mitochondrien sind rein genug für Respirometrie-Assays. Einige der Einschränkungen und Nachteile isolierter Mitochondrien, die auf der differentiellen Zentrifugation basieren, bestehen darin, dass die Mitochondrien während des Homogenisierungs- und Isolierungsverfahrens geschädigt werden können und dass große Mengen der Gewebebiopsie oder kultivierter Zellen für die mitochondriale Isolierung erforderlich sind.

Komplexe I-abhängige Atmung Isolierte mitochondrialer Komplex I abhängigen Atemfrequenzen (Zustände 2, 3 und 4) sind hochauflösende Respirometrie bestimmt (Abbildung 1 ist ein repräsentatives Diagramm). Mitochondriale Komplex I Substrate, Glutamat und Malat, werden durch die Zugabe von ADP zugegeben. Zustand 2 bezieht sich auf den Sauerstoffverbrauch in der Gegenwart der Substrate allein. Zust...

Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe durch Differenzzentrifugation zu isolieren und die Atmungsraten der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mitochondrialen Bioenergetik zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit Erkrankungen und Syndromen, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiert sind, wie vielfältige neurologische Erkrankungen, Sepsis und altersbedingte Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Abwesenheit der meisten zytoplasmatischen Faktoren in der isolierten mitochondrialen Präparation, die die Analyse der mitochondrialen Funktionen stören könnten. Die Durchführung des Verfahrens wird Sandra Nansoz, die Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen Becher mit Skelettmuskelproben gemäß dem schriftlichen Protokoll beschaffen. Stellen Sie den Becher auf einen Eisbehälter. Zerkleinern Sie das Muskelgewebe mithilfe einer feinen Schere in Stücke von ein bis zwei Millimetern Größe.Anschließend wird das zerkleinerte Gewebe zweimal mit jeweils 20 Milliliter eiskaltem Isolationspuffer gewaschen. Das gewaschene Gewebe wird in 10 Milliliter Isolationspuffer pro Gramm Gewebe suspendiert und anschließend 5 Milligramm Protease-G-Gewebe zugegeben. Danach wird das Becherglas in ein Eisbad mit einem magnetischen Rührer gestellt und 10 Minuten gerührt.Danach die Suspension mit weiteren 10 Millilitern Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % entfettetem BSA pro Gramm Gewebe, verdünnen. Anschließend den gesamten Isolationspuffer aus dem Becher abgießen. Das Gewebe zweimal mit eiskaltem Isolationspuffer, ergänzt mit 0,2 % BSA, waschen, wobei jeweils 20 Milliliter pro Waschgang verwendet werden.Anschließend das Gewebe in 10 Milliliter BSA-haltigem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe erneut suspendieren. Das Gewebe mit einem halbautomatischen Glas-Homogenisator und einem locker sitzenden Stößel homogenisieren. Danach das Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen überführen und bei 10.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Verwerfen Sie den Überstand mithilfe einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 Milliliter eiskaltem, mit BSA angereichertem Isolationsmedium pro Gramm Gewebe. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 350 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie danach eine serologische Pipette, um den Überstand aufzubewahren, und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie den Überstand durch zwei Lagen Gaze in einen auf Eis stehenden Becher. Überführen Sie die filtrierte Suspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 7.000 × g und vier Grad Celsius.Danach den Überstand verwerfen. Das rohe mitochondriale Pellet in fünf Milliliter BSA-supplementiertem Isolationspuffer pro Gramm Gewebe resuspendieren. Diese Suspension bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 7.000 × g zentrifugieren.Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Waschpuffer. Zentrifugieren Sie bei 7.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Resuspensions- und Zentrifugationsvorgang ein weiteres Mal.Danach die Überstände verwerfen und das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer erneut suspendieren. Die Proteinkonzentration mit einer gängigen Methode bestimmen. Den konzentrierten mitochondrialen Suspension anschließend auf Eis lagern, bis die Respirometrie-Assays durchgeführt werden.Als Erstes das mitochondriale Konzentrat im Atmungspuffer suspendieren, um eine Endkonzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter mitochondrialem Protein zu erreichen. Anschließend das Atmungsmedium aus der luftkalibrierten Oxygraphkammer absaugen. 2,1 Milliliter der isolierten mitochondrialen Suspension hinzufügen.Setzen Sie einen Stopfen ein, um die Oxygraphiekammer zu verschließen. Rühren Sie die mitochondriale Suspension anschließend kontinuierlich mit 700 U/min bei 37 Grad Celsius um. Registrieren Sie die zelluläre Atmung zunächst über drei bis fünf Minuten, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.Um die Atmung über Komplex I zu starten, injizieren Sie 12,5 Mikroliter einer 0,8-molaren Malat-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit der isolierten mitochondrialen Suspension vorbereitet wurde, durch den Titan-Injektionshafen des Stopfens. Anschließend injizieren Sie 10 Mikroliter einer zwei-molaren Glutamat-Lösung. Registrieren Sie die zelluläre Atmung drei bis fünf Minuten lang, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist.Danach injizieren Sie 10 Mikroliter einer 0,05-molaren ADP-Lösung über die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die zelluläre Atmung auf, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal ansteigt, dann abfällt und sich stabilisiert. Für die Atmung, die von Komplex II abhängt, injizieren Sie zwei Mikroliter einer 0,2-Millimolaren Rotenon-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit einer Suspension isolierter Mitochondrien vorbereitet wurde.Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist. Dann injizieren Sie 20 Mikroliter einer einmolarigen Succinatlösung. Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis ein stabiles Sauerstoff-Fluss-Signal erreicht ist.Danach injizieren Sie 10 Mikroliter einer 0,05-molaren ADP-Lösung über die Injektionsöffnung in die Kammer. Zeichnen Sie die zelluläre Atmung auf, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal ansteigt, dann abfällt und sich stabilisiert. Für die Atmung, die von Komplex IV abhängt, injizieren Sie 2,5 Mikroliter einer 0,8-millimolaren Ascorbat-Lösung in eine Oxygraphiekammer, die mit einer Suspension isolierter Mitochondrien vorbereitet wurde.Als Nächstes sofort 2,5 µL 0,2 M TMPD und 10 µL 0,05 M ADP injizieren. Die zelluläre Atmung aufzeichnen, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist. Anschließend 10 µL 1 M Natriumazid injizieren.Notieren Sie die zelluläre Atmung, bis das Sauerstoff-Fluss-Signal abnimmt und sich anschließend stabilisiert. In dieser Studie werden intakte Mitochondrien aus Skelettmuskel isoliert. Anschließend werden die komplex I-abhängigen Atmungsrate mittels hochauflösender Respirometrie gemessen.Wie zu sehen ist, steigt die mitochondriale Atmungsrate unmittelbar nach der Zugabe von ADP an. Nach der Erschöpfung von ADP nimmt die Atmungsrate wieder auf Werte ab, die denen vor der ADP-Zugabe ähneln. Dies zeigt an, dass das Verhältnis von Zustand 3 zu Zustand 4 – bekannt als respiratorisches Kontrollverhältnis oder RCR – hoch ist und dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.Anschlie&szlig;end werden die von Komplex II abh&auml;ngigen Atmungsraten beobachtet, indem die durch Komplex I vermittelte Atmung mit Rotenon gehemmt und das Substrat Succinat f&uuml;r Komplex II zugegeben wird. Die Zugabe von ADP f&uuml;hrt zu einem unmittelbaren Anstieg der Atmung. Sobald das ADP verbraucht ist, sinkt die Atmung auf Werte ab, die denen vor der ADP-Zugabe &auml;hneln, was auf ein hohes RCR hinweist und darauf, dass die mitochondriale Integrit&auml;t w&auml;hrend der Isolierung gut erhalten blieb.Die Atmungsrate, die von Komplex IV abhängt, wird durch Zugabe von Ascorbat, TMPD und ADP beobachtet. Anschließend wird Natriumazid zugegeben, um Komplex IV zu hemmen. Die Differenz im Sauerstoffverbrauch vor und nach der Zugabe von Natriumazid wird als die eigentliche Atmung über Komplex IV interpretiert. Die hohe, von Komplex IV abhängige Atmungsrate, die im Zustand 3 beobachtet wird, zeigt an, dass die mitochondriale Integrität während des Isolationsverfahrens gut erhalten bleibt.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als eineinhalb Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Sauerstoffsensoren vor der Homogenisierung kalibriert zu haben. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung des zellulären ADP-Gehalts, des mitochondrialen Membranpotentials oder der enzymatischen Aktivität der ATP-Synthase in Abhängigkeit von Substratkonzentrationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Veränderungen der Atmungsrate auf einem Mangel an mitochondrialem Substrat, am Membranpotential oder an einer verminderten enzymatischen Aktivität der ATP-Synthase beruhen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien aus einer Skelettmuskulatur durch Differenzialzentrifugation isoliert und wie man die Atmungsraten der mitochondrialen Komplexe I, II und IV mithilfe einer hochauflösenden Respirometrie misst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich des mitochondrialen Energiestoffwechsels die energetische Funktion von Mitochondrien in Bereichen wie genetischen mitochondrialen Erkrankungen, Myopathien und Ischämie-Reperfusionsschäden an isolierten Mitochondrien untersuchen konnten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Antimycin A, Rotenon, Natriumazid und FCCP äußerst gefährlich sein kann.Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano...

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit &lt;30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselorganellen, die eine hohe phänotypische Plastizität in der Skelettmuskulatur aufweisen. Der Import von Proteinen aus dem Zytosol ist ein kritischer Weg für die Organellenbiogenese, der für die Expansion des Retikulums und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion unerlässlich ist.  Daher dient der Proteinimport als Barometer für die Zellgesundheit.

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Lernen Sie die Isolierung intakter Mitochondrien aus Skelettmuskel durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Respirationsmessungen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der mitochondrialen Funktion.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest (Video) | JoVE Journal

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

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