Name: Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die kleinmaßstäbliche Vermehrung menschlicher iPS-Zellen unter serumfreien Bedingungen für die routinemäßige immunzytochemische Charakterisierung. Diese Methode ermöglicht eine zeit- und kosteneffiziente Kultivierung auf Objektträgern.

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Finanzierungsquellen: Die Universität von Arizona, die Jim Himelic Foundation und das Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.

hiPSCs wurden aus humanen dermalen Fibroblasten isoliert von 4 mm Haut Stanzbiopsien und umprogrammiert im Haus über das Sendai - Virus-vermittelte Umprogrammierung 11 abgeleitet. Die University of Arizona Institutional Review Board genehmigt alle Verfahren für die Unterlagen zur Rekrutierung und Biopsie-Sammlung. 1. Herstellung von extrazellulärer Matrix beschichteten Oberfläche für iPSC Kultur <ol><li> Einen Tag vor der Einmündung der hiPSC Kulturen auf iMEFs wächst, bereiten extrazellulären Matrix (Matrigel) beschichteten Platten. </li><li> Langsam Tauwetter ein Aliquot der extrazellulären Matrix (Menge abhängig, folgen Sie den Anweisungen auf dem Datenblatt) auf Eis in 4 ° C für 2 h. </li><li> In einer Biosicherheit Kapuze, mit kaltem Pipettenspitzen (bei -20 ° C gelagert), 1 hinzufügen aliquote Menge von extrazellulären Matrix zu kalt Dulbecco modifiziertem Eagle Medium / Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F12 / HEPES) nach dem chargenspezifischen Verdünnungsfaktor . </li><li> Dispense ~ 60081; L der extrazellulären Matrix pro Vertiefung jeder neuen Zellkultur behandelt 12-Well-Platte benötigt. </li><li> Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für mehrere Stunden. Hier verwenden eine 3 Stunden Inkubationszeit. HINWEIS: Die Platten können sofort oder bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Transfer von hiPSCs Grown auf Imef Feeder-Zellen auf extrazellulären Matrix für die Vermehrung <ol><li> Am Tag der Passagierung, entfernen Sie die Matrix-beschichtete Platte von 4 ° C und lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur für 1 h in der Gewebekultur Haube zu akklimatisieren. </li><li> Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte von hiPSC Kultur auf iMEFs wachsen und ersetzen mit 500 &amp; mgr; l Kollagenase Dissoziation Reagenz (1 mg / ml in basalen Kulturmedium). </li><li> bei 37 ° C bebrütet ~ 10 bis 30 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien leicht zu heben erscheinen. Hinweis: Die Inkubationszeit ist Linie abhängig und variiert. Monitor-Dissoziation unter dem Mikroskop. </li><li> Autoaspirieren efully die Dissoziation Reagenz und danach vorsichtig waschen 2 mal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4). </li><li> 1 ml Raumtemperatur mTeSR1 Komplettmedium mit 10 ng / ml Rho-assoziiertes Protein-Kinase-Inhibitor (Y-27632 ROCK-Inhibitor) auf den Brunnen. HINWEIS: Unter Verwendung einer 50:50 Mischung aus Imef-konditioniertes Medium und mTeSR1 während dieses anfänglichen Durchgang wird vorgeschlagen und kann für das Überleben der hiPSCs während dieser Medienübergang von Vorteil sein. </li><li> Mit einem kleinen Phasenkontrastmikroskop teilweise im Inneren der Haube platziert, manuell Partitur und Pick 1-2 hiPSC Kolonien (~ 700 - 1000 um im Durchmesser) mit einer Spritze und Nadel (25 G, 1 ½ in). Schieben Sie die Stücke erzielte der Kolonie in das Medium mit einer P200 Pipettenspitze ab. </li><li> Absaugen und entsorgen Sie die Matrix von der neuen Platte, wobei darauf geachtet, die Beschichtung nicht zu stören. </li><li> 1 ml der Zellsuspension aus der alten Brunnen, die erzielte iPSCs in die neue Matrix beschichtete Vertiefung enthält. </li><li> PlaCE , um die Platte in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. Rock the Platte in mehreren schnell, zurück und nach vorne und von Seite zu Seite Bewegungen gleichmäßig die Zellen verteilt. Sie nicht die Platte für 24 h stören. </li><li> Führen Sie täglich vollständige Medienwechsel mit mTeSR1 Vollmedium (Zugabe von Y-27632 ROCK-Inhibitor wird nicht nach dem anfänglichen Plattierung in Schritt erforderlich 2.5). </li></ol> 3. Kleines Passagierung von hiPSCs auf Matrix beschichteten Platten HINWEIS: In der Regel nach der anfänglichen Übertragung der hiPSCs beschichteten Platten zu Matrix sollten die Zellen erneut in ähnlicher Weise agiert werden alle iMEFs um sicherzustellen, wurden eliminiert, und die Zellen angepasst zufuhrfreien Bedingungen. <ol><li> Einen Tag vor der iPSC Konfluenz prepare frisch beschichtete Matrixplatten, wie in Abschnitt 1 diskutiert. </li><li> Am Tag der Passage, entfernen Sie die Matrix-beschichtete Platte von 4 C-Inkubation ° und lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur für 1 h im Gewebe cul akklimatisierenture Kapuze. </li><li> Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte von hiPSCs (ursprünglich vom Anleger bis zur Matrix umgestellt) und ersetzen mit 500 &amp; mgr; l Zelldissoziationspuffer. HINWEIS: Die kommerzielle Zellenpuffer Dissoziation verwendet hier (siehe Materialien Tabelle) ist besser geeignet für den Einsatz mit mTeSR1 Medium im Vergleich zu Kollagenase. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 bis 7 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien leicht zu heben erscheinen. Wie bereits erwähnt, ist die Inkubationszeit Linie abhängig und variabel. Daher überwacht die zelluläre Dissoziation unter einem Mikroskop, die optimale Zeit zu bestimmen. </li><li> aspirieren vorsichtig die Dissoziationspuffers und vorsichtig waschen 2-mal mit PBS. </li><li> In 500 ul Raumtemperatur mTeSR1 komplettes Medium mit 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Hemmstoff, um den Brunnen. </li><li> Statt der Scoring-Kolonien wie in Schritt 2.6, drücken Sie die gewünschte Anzahl der Kolonien in den Medien eine P200 Spitze mit und sanft die Zellsuspension 2 mal ag verreiben200 &amp; mgr; m in der Größe - ainst einer Ecke des gut die hiPSC Kolonien in Klumpen von ~ 50 zu brechen. Zum Beispiel für eine 12-Well-Platte, Pick 1-2 Kolonien in jeweils 1 neue gut zu übertragen. Übertragen Sie die Zellsuspension aus dem alten Brunnen in einem einzigen neuen Vertiefung einer 12-Well-Platte. </li><li> Rock the Platte in mehreren schnell, zurück und nach vorne und von Seite zu Seite Bewegungen gleichmäßig die Zellen verteilt, und lassen Sie die Platte Rest für 24 h in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Führen Sie täglich vollständige Medienwechsel mit mTeSR1 komplettes Medium. Wie bereits erwähnt, ist es nicht notwendig Y-27632 ROCK Inhibitor nach dem anfänglichen Plattieren hinzuzufügen. HINWEIS: Nicht benutzte iPSC Kolonien aus Schritt 3.7 kann an dieser Stelle leicht kryokonserviert werden. </li></ol> 4. Herstellung von Kammer Folien und Deckgläser für Seeding von hiPSCs für Immunzytochemie HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet 4-Well-Plastikkammer Dias und 12 mm Glasplättchen mit appropriate Volumina von Medien in den Multi-wells kostengünstiger Immuncytochemie zu unterstützen. Jedoch können Medienvolumen erhöht werden, wenn die Verwendung größerer gut und Deck Größen gewünscht wird. <ol><li> Einen Tag vor der hiPSC Einmündung bereiten Kammer gleitet frisch mit der extrazellulären Matrix beschichtet ist, wie in Abschnitt 1. Fügen Sie genug Matrix-Lösung (~ 300 bis 500 &amp; mgr; l pro Vertiefung einer 4-Well-Kammer-Folie) zu voll Mantel jeweils gut ohne Sorge Verdunstung. Alternativ nach dem Platzieren 1 gereinigt und sterilisiert Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, Mantel mit 500 &amp; mgr; l der extrazellulären Matrix und stellen Sie sicher, dass das Deckglas nicht oben auf der Lösung schwimmt. </li><li> Am Tag der Passage, entfernen Sie die beschichtete Kammer Dias / Deckgläser von 4 ° C und erlauben Akklimatisierung auf Raumtemperatur für 1 h in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Saugen Sie das Medium von 1 Vertiefung einer 12-Well-Platte von hiPSCs und ersetzen mit 500 &amp; mgr; l Dissoziationspuffers. </li><li> Inkubieren bei Raum temperature für ~ 3 bis 7 min, bis die Ränder der iPSC Kolonien erscheinen leicht zu heben. </li><li> aspirieren vorsichtig den Dissoziationspuffers und 1 mL Raumtemperatur mTeSR1 komplettes Medium mit 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Hemmstoff, um den Brunnen. </li><li> einen kleinen Phasenkontrastmikroskop in der Gewebekultur Haube platziert Unter Verwendung manuell 1 Kolonie / neue Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger oder ein neues Deckglas zu plattierenden Pick (~ 1000 - 1500 &amp; mgr; m im Durchmesser) eine P200 Pipettenspitze mit durch Drücken es die Plattenoberfläche in das Medium ab. </li><li> Absaugen die Matrix aus dem neuen Kammer Schiebe- / Deckglas, darauf achten, daß die Beschichtung zu stören. </li><li> verreiben sanft die Zellsuspension 2 mal gegen eine Ecke des gut die hiPSC Kolonien in Klumpen von ~ 50 zu brechen - 200 &amp; mgr; m groß. Übertragen Sie 250 ul der Zellsuspension aus dem alten Brunnen in jede neue Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger / Deckglas. </li><li> Bringen Sie die Lautstärke der einzelnen neuen und bis zu 500 &amp; mgr; l mit mTeSR1 containing 10 ng / ml Y-27632 ROCK-Inhibitor. </li><li> Platzieren Sie die Kammer Schiebe- / Deckgläser in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach 24 h führen täglich volle Medienwechsel mit mTeSR1 komplettes Medium. Wiederum, wie zuvor erwähnt, ist die Zugabe von Y-27632 ROCK Inhibitor nicht notwendig, nach dem anfänglichen Plattieren. </li></ol> 5. Herstellung von iPS-Zellen für Immunzytochemie <ol><li> Sobald konfluent, bewahren die hiPSC Kolonien über Fixierung durch die Medien aus den Vertiefungen Entfernen und Hinzufügen von vorgewärmten VORSICHT 4% Paraformaldehyd (~ 300 &amp; mgr; l / Vertiefung einer 4-Well - Kammerobjektträger / Deckglas). für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Entsorgen Sie die Paraformaldehyd in geeigneter Weise entsprechend institutionellen Biohazard und chemischen Sicherheitsrichtlinien. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3-mal für jeweils 5 Minuten auf einem Tischschüttler mit PBS. Hinweis: Zellen auf chamber slides / Deckgläser können auf unbestimmte Zeit in diesem Stadium mit reichlich PBS bei 4 ° C gelagert werden.Alternativ können sie sofort für die ICC verwendet werden. </li></ol> 6. Immunostaining von hiPSCs mit Pluripotenz Marker HINWEIS: immunostain hiPSCs mit Standard Pluripotenz Antikörpern. Als Beispiel sind hier Zellen doppelt gefärbt mit Antikörpern Targeting eine 1 Oberfläche und 1 intrazelluläres Antigen in einer sequentiellen Weise wie folgt: Anti-stadienspezifische Embryonic Antigen-4 (SSEA4) mit Anti-Octamer-bindendes Protein 4 (oct- 4) und Anti-Tra-1-60 mit anti-SRY Zusammenhang HMG-Box-Gen 2 (SOX2) (Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für die Antikörper-Details). <ol><li> Saugen Sie das PBS aus den Vertiefungen und fügen Sie in 500 &amp; mgr; l / Vertiefung Blocking-Lösung ohne Triton-X-100. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie eine vorgegebene Konzentration (hier verwenden 1: 200) der Oberfläche Antikörper, entweder SSEA4 oder Tra-1-60, durch Verdünnung in Blockierungslösung ohne Triton X-100. <ol><li> Für Kammer gleitet, bereiten 300 &amp; mgr; l / Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträgerdurch Mischen von 298,5 ul Blocking Solution oben und 1,5 ul anti-SSEA4 oder Tra-1-60 primären Antikörper. </li><li> Für Deck, bereiten 40 &amp; mgr; l / Deckglas durch Mischen von 199 &amp; mgr; l Blockierungslösung und 1 &amp; mgr; l anti-SSEA4 oder Tra-1-60 primären Antikörper. </li></ol></li><li> Absaugen Die Blockierungslösung aus der Kammer Rutsche und verzichtet den primären Antikörper in die entsprechenden Wells. Für Deck, legen Sie ein Stück Parafilm fest in einer Petrischale und verzichtet werden 40 ul des primären Antikörpers auf der Oberseite als ein Tröpfchen. Mit Hilfe eines gebogenen Spritzennadel und Zange, heben Sie vorsichtig das Deckglas aus der Kultur gut und legen Sie es Zellenseite nach unten auf den Tropfen Antikörper auf dem Parafilm. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Morgen, waschen Sie die Zellen 3 mal 5 - 10 min jeweils, durch den Antikörper aus der Kammer Dia Entfernen und Hinzufügen von in PBS. Für Deckgläser, heben sich ein aus dem Parafilm und setzen Sie ihn wieder in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, Zellseite nach oben. Sorgfältig P hinzufügenBS. </li><li> Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörper bei 1: 500 in der Blockierungslösung. <ol><li> Für Kammer gleitet, bereiten 300 &amp; mgr; l / Vertiefung einer 4-Well-Kammerobjektträger von 499 &amp; mgr; l Blockierlösung und 1 ul Ziege-anti-Maus-IgG3 Alexa Fluor 488 (zum SSEA4) oder 1 &amp; mgr; l Ziegen-anti-Maus-IgM-Alexa Fluor Misch 488 (für Tra-1-60). </li><li> 40 &amp; mgr; l / Deck Für Deck, bereiten durch Mischen von 499 &amp; mgr; l Blockierlösung und 1 ul Ziege-anti-Maus-IgG3 Alexa Fluor 488 (zum SSEA4) oder 1 &amp; mgr; l Ziegen-anti-Maus-IgM-Alexa Fluor 488 (zum Tra-1-60 ). </li></ol></li><li> Saugen Sie das PBS aus der Kammer Rutsche und verzichtet die sekundären Antikörper in die entsprechenden Wells. Für Deckgläser, folgenden Schritt 6.2, invertieren die Deckgläser auf die Antikörperlösung auf Parafilm bei Raumtemperatur für 2 h gegeben. HINWEIS: Bei der Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper markiert, müssen die Zellen vor Licht geschützt werden. Legen Sie die Kammer gleitet und die Deckgläser in einem dunklen environment während Inkubationen und Waschungen. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3-mal 5 - 10 min jeweils durch den Antikörper aus der Kammer slide Entfernen und Hinzufügen von in PBS. Für Deckgläser, heben sich diese sorgfältig aus dem Parafilm und legen Sie zurück in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, Zellseite nach oben. fügen Sie vorsichtig PBS während Wäschen. </li><li> Stand der für das zweite Antigen Sondieren, intrazellulärem Oct-4 oder SOX2 in diesem Fall erneut inkubieren in Blocking-Lösung mit Permeabilisations-Reagenz (Triton-X-100) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Um Immunfärbung für die OCT-4 oder SOX2, folgen Sie einfach die Methodik in den Schritten beschrieben 6,1-6,6 für die primären und sekundären Antikörper anwenden. Für die Zwecke dieses Protokoll verwenden, Oct-4 und SOX2 bei einer Konzentration von 1: 200 und der sekundäre Antikörper Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Alexa Fluor 594 bei 1: 500. </li><li> Nach den oben genannten Antikörper-Behandlungen primären und sekundären, waschen Sie die Zellen 3 mal 5 - 10 min jeweils mit PBS und Gegenfärbung mit 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI) nach Standardprotokollen, wenn die Kern Visualisierung gewünscht wird. </li></ol> 7. Vorbereitung für Viewing <ol><li> Für Kammer gleitet, entfernen Sie vorsichtig die obere Kammer von der Folie, nach den Anweisungen des Herstellers. Dann spülen in destilliertem Wasser, und fügen Sie Medium und ein Abdeckglas Montage Mikroskopie zu ermöglichen. </li><li> Für Deck, kehren Sie die Deckgläser auf einem Tropfen auf einem Glasobjektträger Medium platziert Montage. </li><li> Bild unter einem Standard-oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die systematische Protokoll präsentiert hier bietet eine zeitsparendes und kostengünstiges Verfahren, in Form einer abgespeckte Kulturtechnik, die speziell zur Unterstützung der wirksamen Pluripotenz Analyse über Immunzytochemie gestaltet. Die Hauptvorteile der beschriebenen Methode sind wie folgt. Traditionell mehr als 3 bis 4 Durchgänge benötigt iPSCs von Feeder - Schichten , um den Übergang zu Feeder freien Kulturbedingungen, um Rest iMEFs , die nach der Verwendung von Bulk - Dissoziation...

Reprogrammierung adulter menschlicher Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS - Zellen) bietet eine Möglichkeit , eine potenziell unbegrenzte Versorgung von Patienten-spezifischen Zellen zu erhalten , zu studieren Krankheit 1, 2. Eine Krankheits - Phänotyp in vitro zusammenfassend würde es 3 mit der Krankheit assoziiert zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen und Wirkstoffforschung verbessern und personalisierte Medizin plausibel machen. Darüber hinaus bieten die menschliche iPS - Zellen (hiPSCs) die Möglichkeit , bestimmte Zelltypen ableiten , die als einzigartige Ressource verwendet werden kann , tot oder dysfunktionalen Zellen und Restore - Funktion im Rahmen von mehreren Störungen 4, 5 zu ersetzen. Eine wichtige Voraussetzung iPSCs in den oben genannten Anwendungen verwendet wird, um sicherzustellen, dass ihre pluripotenten und undifferenzierten Zustand während der Expansion in Kultur gehalten wird. Typischerweise techniques wie Durchflußzytometrie, Western Blotting, Polymerasekettenreaktion und funktionellen Assays, die große Mengen an Zellen und Spezialausrüstung erforderlich ist , werden für die detaillierte Analyse der iPSC Pluripotenz 6, 7, 8, 9, 10 verwendet wird . Allerdings Routine Beurteilung der undifferenzierten Zustand &quot;iPS-Zellen könnte wirksam durch die begrenzte Vermehrung dieser Zellen speziell für Immunzytochemie (ICC) erreicht werden, somit reduziert Zeit und Ressourcen beteiligt sind. Jüngste Fortschritte ermöglichen das Wachstum von iPSCs in definiertem serumfreien Bedingungen, was eine erhebliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Kultursystemen, die murine Fibroblasten-Feeder-Schichten und serumhaltigen Medien erfordern. Allerdings ist die aktuelle Literatur nicht klar schrittweise Protokolle umfassen, die beschreiben, wie iPSCs von der Zufuhr für den ÜbergangSchicht Feeder freie Systeme. In diesem Zusammenhang detailliert die vorliegende Protokoll systematisch wie hiPSCs auf bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (Imef) Schichten sein Feeder gewachsen können (1), der in Serum-freiem Medium zu verbreiten, und (2) kultiviert auf einem kleinen speziell robust zu unterstützen immunzytochemische Analyse. Insgesamt stellt diese Methode eine zeit- und kostengünstiges Verfahren für den menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen ausbreitende für ihre Pluripotenz auf einer Routinebasis bestätigt Immunzytochemie verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life</td> Technologies <td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF-Basiszellwissenschaften</td><td></td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK-Inhibitor</td><td>R& D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualifizierte Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basalmedium</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Ergänzung</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Sanfter Zelldissoziationspuffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M PO4 Buffer</td><td>In-house</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, prill</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Kaninchen mAb, Sox2 (D6D9) Kaninchen mAb, SSEA4 (MC813) Maus mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Maus mAb</td><td>Zellsignalisierung Zellsignalisierung Zellsignalisierung Zellsignalisierung</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternativ kann eine Kombination von 6 Pluripotenz-Primärantikörpern zusammen als Kit im Katalog #9656</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ms-IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Rb-IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Zellkulturplatten</td> <td>erworben werdenFisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>Erhältlich in den Größen 6, 12, 24, 48, 96</td></tr><tr><td>Chamber Slides</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>Erhältlich in Glas oder Permanox-Kunststoff in den Größen 1, 2, 4, 8, 16 Wells</td></tr><tr><td>Deckglas für das Wachstum</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>Erhältlich in den Größen 12, 15, 18, 22 und 25 mm</td></tr></tbody></table>

kleines vermehrung von menschlichen ips-zellen in serum-freien bedingungen für die routine immunzytochemische charakterisierung

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Es besteht ein großes Interesse an der Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) für die Krankheitsmodellierung und Zelltherapeutika aufgrund ihrer Patientenspezifität und charakteristischen Stammzelle. Die Pluripotenz von iPSCs, die für ihre Funktionalität unerlässlich ist, muss jedoch bestätigt werden, bevor diese Zellen in solchen Anwendungen eingesetzt werden können. Während eine rigorose Charakterisierung von iPSCs durch verschiedene zelluläre und funktionelle Assays erforderlich ist, um ihre Pluripotenz zu bestimmen, kann die routinemäßige Beurteilung der Pluripotenzerhaltung durch immunzytochemische Techniken einfacher und effektiver erreicht werden. In dieser Arbeit stellen wir ein systematisches Protokoll für die Kultivierung von hiPSCs vor, in einer verkleinerten Weise, um insbesondere die Überprüfung ihres pluripotenten Zustands mittels Immunzytochemie zu erleichtern. Genauer gesagt umfasst diese Methodik eine effiziente und kostengünstige Möglichkeit, iPS-Zellen unter serumfreien Bedingungen zu züchten und sie auf kleine Kammerobjektträger oder Glasdeckgläser zu plattieren, die sich ideal für die Immunzytochemie eignen.

Dieses Protokoll stellt eine schrittweise Beschreibung, wie die menschliche iPS-Zellen können von Feeder-Schicht übertragen werden, um Bedingungen zu Zubringer frei und anschließend in einer begrenzten Art und Weise vermehrt speziell kosteneffektive Immunzytochemie zu ermöglichen Pluripotenz Wartung für die Bestätigung. Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung dieses Protokolls. 2A zeigt hiPSC Kolonien wachsen auf iMEFs in 6-Well - Platten. Diese Kolo...

Die regelmäßige Charakterisierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um die Aufrechterhaltung ihres pluripotenten Zustands zu gewährleisten, ist ein wichtiger Schritt, bevor diese Zellen für andere Anwendungen verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur kleinskaligen Vermehrung von humanen iPSCs, die speziell entwickelt wurde, um ihre einfache und routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie zu ermöglichen.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Das übergeordnete Ziel dieser Kulturmethode besteht darin, humane induzierte pluripotente Stammzellen, oder humane iPSCs, im kleinen Maßstab zu vermehren, um ihre routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie gezielt zu ermöglichen. Dieses Protokoll aus meinem Labor stellt eine Verkleinerungstechnik vor, um humane induzierte pluripotente Stammzellen von der darunterliegenden fetalen Schicht auf ein Substrat umzusetzen, das besser für die Antigenerkennung unter Verwendung spezifischer Pluripotenz-Antikörper geeignet ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode bietet, um pluripotente Zellen in kleinen Kammerobjektträgern oder auf Deckgläsern zu kultivieren, was sich besonders für die Immunzytochemie eignet.Am Tag des Passagierens entnehmen Sie die mit Matrix beschichtete Platte aus vier Grad Celsius und lassen Sie die Platte eine Stunde lang im Zellkulturwerkbank auf Raumtemperatur akklimatisieren. Danach aspirieren Sie das Medium aus einem Wells einer sechswelligen Platte mit humanen iPSC-Kulturen, die auf iMEFs wachsen, und ersetzen es durch 500 Mikroliter Kollagenase-Dissociationsreagenz. Anschließend inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 10 bis 30 Minuten, bis die Ränder der iPSC-Kolonien unter dem Mikroskop leicht angehoben erscheinen, aspirieren vorsichtig das Dissociationsreagenz und waschen die Zellen zwei Mal vorsichtig mit PBS.Da das Differenzierungsprofil jeder spezifischen iPSC-Linie variieren kann, ist es wichtig, die Ablösung der Kolonien unter dem Mikroskop zu überwachen, um die optimale Inkubationszeit mit dem Dissoziationsreagenz zu bestimmen. Geben Sie ein Milliliter mTeSR-Vollmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter ROCK-Inhibitor bei Raumtemperatur in die Vertiefung. Bewerten und isolieren Sie mithilfe eines kleinen Phasenkontrastmikroskops, das teilweise in der Sicherheitswerkbank platziert ist, manuell eine bis zwei humane iPSC-Kolonien.Schieben Sie die angeritzten Koloniestücke mit einer P200-Pipettenspitze in das Medium. Danach saugen Sie die Matrix aus den neuen Vertiefungen ab, die beimpft werden sollen, wobei darauf geachtet werden muss, die Beschichtung nicht zu stören. Übertragen Sie ein Milliliter der Zellsuspension aus der alten Vertiefung, die die angeritzten iPSCs enthält, in die neue, matrixbeschichtete Vertiefung.Stellen Sie die Platte in den Inkubator und bewegen Sie sie mehrmals schnell vor und zurück sowie von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach der Übertragung der humanen iPSCs von iMEFs auf die extrazelluläre Matrix werden sie ähnlich wie bei den vorherigen Passagierungsschritten auf eine 12-Loch-Platte überführt.Dieser Schritt ermöglicht die Eliminierung eventuell verbliebener iMEFs aus der Kultur und gewährleistet, dass die Zellen sich an bedienerfreie Bedingungen anpassen. Drücken Sie die gewünschte Anzahl an Kolonien mit einer P200-Pipettenspitze in das Medium und pipettieren Sie die Zellsuspension sanft zweimal gegen eine Ecke des Wells, um die humanen iPSC-Kolonien in Klumpen von etwa 50 bis 200 Mikrometern Größe aufzubrechen. Bei einer 12-Loch-Platte lösen Sie eine bis zwei Kolonien vom Boden ab und überführen die Zellsuspension aus dem alten in einen einzelnen neuen Well einer 12-Loch-Platte.Bewegen Sie die Platte durch mehrere schnelle Vorwärts-Rückwärts- und Seitwärtsbewegungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie die Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius ruhen. Dieser Abschnitt beinhaltet das Passagieren der iPSCs in den 12-Loch-Platten und das Auftragen auf kleine Kammerobjektträger und Deckgläser, die sich besonders gut für die Immunzytochemie eignen. Aspirieren Sie in diesem Verfahren das Medium aus einem der Löcher einer 12-Loch-Platte mit humanen iPSCs und ersetzen Sie es durch 500 µL Dissoziationspuffer.Die Zellen etwa drei bis sieben Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bis sich die Ränder der iPSC-Kolonien leicht zu lösen beginnen. Anschließend den Dissoziationspuffer vorsichtig abpipettieren und ein Milliliter mTeSR-Vollmedium bei Raumtemperatur mit 10 Nanogramm pro Milliliter ROCK-Inhibitor in die Vertiefung geben. Mithilfe eines kleinen Phasenkontrastmikroskops, das sich innerhalb der Zellkulturwerkbank befindet, die gelösten Kolonien vorsichtig von der Plattenoberfläche abdrücken und in das Medium überführen. Danach die Matrix von der neuen 24-Loch-Platte mit Deckgläsern und Kammerobjektträger vorsichtig abpipettieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Beschichtung nicht gestört wird.Titrieren Sie die Zellsuspension vorsichtig zwei Mal gegen eine Ecke des Wells, um die humanen iPSC-Kolonien in Klumpen mit einer Größe von etwa 50 bis 200 Mikrometern zu zerlegen. Übertragen Sie 250 Mikroliter der Zellsuspension aus dem alten Well in jedes neue Well einer Vier-Well-Kammerplatte. Beim Ansäen auf Deckgläsern lösen Sie eine Kolonie aus dem ursprünglichen Well ab, titrieren diese und übertragen die Zellsuspension auf die Deckgläser in den neuen Wells einer 24-Well-Platte.Anschließend wird das Volumen jedes neuen Wells mit mTeSR1 unter Zusatz von 10 Nanogramm pro Milliliter Y27632 ROCK-Inhibitor auf 500 Mikroliter ergänzt. Danach werden die Kammerobjektträger und Deckgläser bei 37 Grad Celsius in den Inkubator gestellt. Sobald die humanen iPSCs Konfluenz erreichen, werden die Zellen für die Immunzytochemie vorbereitet, indem eine Standardfixierung mit Paraformaldehyd sowie eine Blockierung vor der Inkubation mit dem primären Antikörper durchgeführt wird.Bereiten Sie nun eine vorbestimmte Konzentration des Oberflächenantikörpers, entweder SSEA4 oder TRA-1-60, vor, indem Sie diesen in der Blockierungslösung ohne Triton X-100 verdünnen. Für Kammerobjektträger bereiten Sie ausreichend Antikörperlösung zu, indem Sie 298,5 µL Blockierungslösung mit 1,5 µL primärem Anti-SSEA4- oder TRA-1-60-Antikörper mischen, sodass jede Mulde 300 µL Antikörperlösung erhält. Saugen Sie die Blockierungslösung von dem Kammerobjektträger ab und geben Sie den primären Antikörper in die entsprechenden Mulden. Für Deckgläser geben Sie 40 Mikroliter Antikörperlösung auf eine mit Parafilm ausgelegte Schale. Drehen Sie das Deckglas vorsichtig mit der Zellseite nach unten in die Lösung und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Antikörperlösung von den vierkammerigen Objektträgern und waschen die Zellen dreimal, jeweils fünf bis zehn Minuten lang, mit PBS.Legen Sie die Deckgläser zurück in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte und waschen Sie sie mit PBS, anschließend verfahren Sie analog zur Inkubation mit dem primären Antikörper auch für die Inkubation mit dem sekundären Antikörper, bevor die immungefärbten Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet werden. Gezeigt ist die dichte iPSC-Kolonie, die auf iMEF-Fütterungszellen gezüchtet wurde. Nach dem ersten Umpassen auf eine matrixbeschichtete 12-Loch-Platte in serumfreiem Medium können noch vereinzelte iMEFs in der Kultur beobachtet werden.Dieses Bild zeigt die typische Morphologie einer monolayer iPSC-Kolonie, die ohne Fütterungszellen kultiviert wurde, wobei zu diesem Zeitpunkt keine iMEFs mehr in der Kultur vorhanden sind. Die repräsentativen Immunfluoreszenzbilder von iPSCs, aufgenommen mittels eines konfokalen Mikroskops, zeigen eine positive Expression der Pluripotenzmarker Oct-4 und SSEA4 mit dem Kernfärbemittel DAPI sowie Sox2 und TRA-1-60 mit DAPI. Beide Bilder stellen Überlagerungsaufnahmen dar.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, bietet sie eine kostengünstige Möglichkeit, iPSCs von iMEF-Füttererschichten auf Matrixoberflächen umzusetzen und Immunzytochemie durchzuführen, wodurch Zeit und teure Reagenzien gespart werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass sich jede primäre iPSC-Linie in der Kultur unterschiedlich verhält und während der Passagierung und des Ansäens überwacht werden muss. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane iPSCs wirtschaftlich im kleinen Maßstab kultiviert und passagiert, um sie routinemäßig immunzytochemisch zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.

Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Ein Protokoll wird präsentiert, um bereiten polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit, die mit und ohne Oligopeptide, aufgepfropft wurden, um zu untersuchen, die Wirkung der Steifigkeit von Biomaterialien auf die Differenzierung und Proliferation von Stammzellen. Die Steifigkeit der Hydrogele wurde dadurch die Vernetzung bestimmt.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für die Differenzierung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in jeder Somiten Derivat (Myotom, Sklerotom Dermatome und Syndetome) in chemisch definierten Bedingungen, die hat Anwendungen in zukünftigen Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien in der orthopädischen Chirurgie.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

Das Ziel des Protokolls ist es, verschiedene extrazelluläre Matrix-Beschichtungsbedingungen (ECM) zu vergleichen, um zu beurteilen, wie sich eine differentielle Beschichtung auf die Wachstumsrate von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auswirkt. Insbesondere wollen wir Bedingungen schaffen, um ein optimales Wachstum von iPSC-Kulturen zu erreichen.

Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Vorderhirn-spezifische Astrozyten erleichtert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Gliazellen bei der Pathogenese von neurologischen Entwicklungsstörungen, wie dem Fragile-X-Syndrom, und die Modellierung anderer Hirnerkrankungen.

Generierung und Charakterisierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten, denen das fragile X-Boten-Ribonukleoprotein fehlt

Lernen Sie die kleinmaßstäbliche Vermehrung menschlicher iPS-Zellen unter serumfreien Bedingungen für die routinemäßige immunzytochemische Charakterisierung. Diese Methode ermöglicht eine zeit- und kosteneffiziente Kultivierung auf Objektträgern.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

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