Name: Gezielt In Situ Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Lernen Sie die gezielte In-situ-Mutagenese von Histon-Genen in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Funktion spezifischer Histon-Reste in Chromatin-Prozessen.

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Wir danken Reine Protacio für hilfreiche Kommentare während der Erstellung dieses Manuskripts. Wir danken der National Science Foundation (Stipendien Nr. 1243680 und 1613754) und dem Hendrix College Odyssey Program für die finanzielle Unterstützung.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die hohe Sequenzhomologie zwischen den zwei nicht allele Gene , die für jeden der vier Kern Histon - Proteine in haploiden S. cerevisiae - Zellen eine Herausforderung für die Forscher darstellen können , die wünschen speziell für die Mutagenese eines der beiden Gene abzuzielen. Zuvor Hefe Mutagenese Methodologien beschrieben, einschließlich der Delitto Perfetto, ortsspezifischen genomischen (SSG) Mutagenese und Klonierung freien PCR-basierten Allelaustausch Methoden 5,</sup...

Die vier Kern Histonproteine ​​H2A, H2B, H3 und H4 spielen eine zentrale Rolle in der Verdichtung, die Organisation und Funktion von eukaryotischen Chromosomen. Zwei Sätze von jeder dieser Histone bilden die Histonoktamer, ein Molekular Spule, die die Verpackung von ~ 147 Basenpaaren der DNA um sich ergeb leitet schließlich in der Bildung einer Nukleosomen 1. Nukleosomen sind aktive Teilnehmer in einer Vielzahl von Chromosom-basierte Prozesse, wie zum Beispiel die Regulation der Gen-Transkription und die Bildung von Euchromatin und Heterochromatin über Chromosomen, und als solche im Mittelpunkt intensiver Forschung im Laufe der vergangenen Jahrzehnte. Eine Anzahl von Mechanismen wurden durch die Nukleosomen beschrieben kann in einer Weise manipuliert werden, die Ausführung bestimmter Prozesse erleichtern können - diese Mechanismen posttranslationaler Modifikation von Histon-Reste, ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling und ATP-unabhängige Nukleosom Reorganisation umfassenund Montage / Demontage 2, 3. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein besonders leistungsfähiges Modellorganismus für das Verständnis der Histon - Funktion in Eukaryoten. Dies kann weitgehend auf dem hohen Grad der evolutionären Konservierung der Histon - Proteine in der gesamten Domäne Eukarya und amenability von Hefe von genetischen und biochemischen experimentelle Ansätze 4 auf eine Vielzahl zurückzuführen. Reverse genetische Ansätze in Hefe wurden weitgehend verwendet, um die Auswirkungen der spezifischen Histon-Mutationen zu verschiedenen Aspekten der Chromatin Biologie zu studieren. Für diese Arten von Experimenten ist es oft bevorzugt, Zellen zu verwenden, bei dem die mutanten Histone aus ihren nativen genomischen Loci exprimiert werden, als Ausdruck von autonomen Plasmide zu abnormal intrazellulären Spiegel von Histon-Proteinen (durch eine unterschiedliche Anzahl von Plasmiden in Zellen) führen kann, und gleichzeitige Veränderung der Chromatinstruktur engebungen, die letztlich die Interpretation der Ergebnisse durcheinander bringen kann. Hier beschreiben wir eine PCR-basierte Technik, die zur gezielten Mutagenese von Histon-Gene in ihrer nativen genomischen Stellen ermöglicht, die keine Klonierungsschritt und führt zur Erzeugung der gewünschten Mutation (en) ohne Überbleibsel exogenen DNA-Sequenzen in das Genom erfordert. Diese Technik nutzt die effiziente homologe Rekombinationssystem in Hefe und gemeinsam hat mehrere Funktionen mit anderen ähnlichen Techniken , die von anderen Gruppen entwickelt - insbesondere der Delitto Perfetto, ortsspezifischen genomischen (SSG) Mutagenese und Klonierung freien PCR-basierte Allel Ersatzmethoden 5, 6, 7. Jedoch hat die Technik, die wir beschreiben, einen Aspekt, dass es besonders gut geeignet für die Mutagenese von Histon-Gene macht. In haploiden Hefezellen, ist jeder der vier Core-Histone durch zwei nicht-a codiertllelic und hoch homologe Gene: zum Beispiel wird Histon H3 durch die HHT1 und HHT2 Gene kodiert, und die offenen Leserahmen (ORFs) der beiden Gene sind mehr als 90% in - Sequenz identisch. Dieser hohe Grad an Homologie kann Experimente komplizieren spezifisch eine der beiden für die Mutagenese Histon-kodierenden Gene entworfen abzuzielen. Während oft die oben genannten Verfahren die Verwendung von mindestens einigen Sequenzen innerhalb des ORF des Zielgens erfordern homologe Rekombination zu treiben, beschreiben die Technik, die wir hier macht die Verwendung von Sequenzen, die die ORFs der Histon-Gene flankieren (die viel weniger Sequenzhomologie teilen) für die Rekombinationsschritt, Steigerung somit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Ausrichtung der Mutagenese an den gewünschten Ort. Darüber hinaus sind die homologen Regionen, die Rekombination fahren kann sehr umfangreich sein, weiter zu einer effizienten gezielte homologe Rekombination beiträgt.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA-Leiter (DNA-Standards)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mischung (je 10 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA-Polymerase (High Fidelity DNA-Polymerase)&nbsp; und 5x Puffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Lachsspermien DNA-Lösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (Tris-Base, Pulverform)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (niedrige Temperatur-Agarose)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq-Polymerase und 10x Puffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Zahnstocher</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>a-d(+)-Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>für Hefemedien</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>für Hefemedien</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>für YPD-Medium</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>für YPD-Medium</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoesäure</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>für vollständiges Medium mit minimalem Dropout&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>für vollständig minimalen Aussetzer</td></tr><tr><td>Glycinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>für vollständig minimalen Ausfall Medium</td></tr><tr><td>L-Arginin-Monohydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparagin-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure-Natriumsalz-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Cysteinhydrochlorid-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäurehydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Histidin-Monohydrochlorid-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Isoleucin</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>für vollständiges Minimalaussetzermedium</td></tr><tr><td>L-Lysin-Monohydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>für vollständiges Minimum-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>für ein vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>für vollständiges Minimalaussetzermedium</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>für vollständig minimalen Ausfall</td></tr><tr><td>L-Threonin</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>für vollständiges Minimalaussetzermedium</td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>für vollständig minimales Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>für vollständiges Minimal-Dropout-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>5-Fluororotsäure (5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>für 5-FOA-Medium</td></tr></tbody></table>

gezielt<em&gt; in situ</em&gt; mutagenese von histon-gene in bäckerhefe

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Wir beschreiben ein PCR- und homologes Rekombinationssystem zur Erzeugung gezielter Mutationen in Histon-Genen in knospenden Hefezellen. Die resultierenden mutierten Allele befinden sich an ihren endogenen genomischen Stellen und es verbleiben keine exogenen DNA-Sequenzen im Genom nach dem Verfahren. Da in haploiden Hefezellen jedes der vier Kern-Histonproteine von zwei nicht-allelischen Genen mit hochgradig homologen Open Reading Frames (ORFs) kodiert wird, kann es problematisch sein, die Mutagenese spezifisch auf eines von zwei Genen auszurichten, die für ein bestimmtes Histonprotein kodieren. Die Strategie, die wir hier beschreiben, umgeht dieses Problem, indem sie Sequenzen außerhalb und nicht innerhalb des ORF der Zielgene für den homologen Rekombinationsschritt verwendet. Ein weiteres Merkmal dieses Systems ist, dass die DNA-Regionen, die die homologen Rekombinationsschritte steuern, sehr ausgedehnt sein können, was die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Integrationsereignisse erhöht. Diese Eigenschaften machen diese Strategie besonders geeignet für die Mutagenese des Histon-Gens, kann aber auch für die Mutagenese anderer Gene im Hefegenom angepasst werden.

Wir beschreiben die Erzeugung eines hht2 Allel ein Histon H3 mutiertes Protein beherbergt eine Substitution an Position 53 von Arginin zu einem einer Glutaminsäure (H3-R53E - Mutante) als repräsentatives Beispiel für die gezielte in - situ - Mutagenese - Strategie exprimieren. Wir erzielten einen Stamm , in dem das gesamte ORF von HHT2 durch das URA3 - Gen ersetzt (Schritt 1 des Pro...

Eine Strategie zur Erzeugung von Mutationen in Histon-Genen an ihrer endogenen Stelle in Saccharomyces cerevisiae wird vorgestellt.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gezielte Mutationen in Histon-Genen an deren endogenen chromosomalen Positionen in Hefe-Zellen (Budding Yeast) zu erzeugen. Diese Methode kann verwendet werden, um den Beitrag spezifischer Histon-Reste bei einer Vielzahl von Prozessen zu bestimmen, die Chromatin als Substrat nutzen, wie beispielsweise die DNA-Transkription, jede Kombination. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass gezielt bestimmte Histon-Gene für die Mutagenese angegriffen werden können, obwohl in Hefe jedes Histonprotein durch zwei hochgradig homologe, nicht-allelische Gene kodiert wird.Nachdem ein Hefe-Stamm erzeugt wurde, bei dem das Zielhiston-Gen durch URA3 ausgeschaltet und ersetzt wurde, erzeugen Sie PCR-Produkte für zwei teilweise überlappende Fragmente des Zielhiston-Gens, indem Sie die folgende Reaktion für die erste Hälfte des Gens einrichten. Für die zweite Hälfte des Gens richten Sie eine ähnliche PCR-Reaktion mit anderen Primern ein. Stellen Sie die Reaktionen in einen Thermocycler und richten Sie das folgende Programm ein.Führen Sie 20 bis 50 Mikroliter der PCR-Ansätze auf einem 0,9 %igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt in TBE-P

targeted-in-situ-mutagenesis-of-histone-genes-in-budding-yeast

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Genetische Studien in Hefe kann eingesetzt werden, um die molekularen und zellulären Funktionen der menschlichen Gene in Zellen DNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Es werden Methoden für die genetische Charakterisierung des menschlichen...

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Die HO-stimulierte Translokation Assay überwacht Einzelstrang-Glühen nach der Gründung von DNA-Doppelstrangbrüche an mehreren Loci in...

Quantifizierung und Analyse der Bildung von HO-Endonuklease Stimulated chromosomalen Translokationen von Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae</em

Quelle: Bennett, S. A., et al., Charakterisierung posttranslationaler Modifikationsveränderungen in neurodegenerativen Proteinopathiemodellen für Hefe. J. Vis. Exp. (2019). Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung von Histonmodifikationen in Hefezellen, die neurodegenerative Proteine überexprimieren. Die Schritte umfassen Zelllyse, Zentrifugation, Elektrophorese, Membrantransfer und antikörperbasierten Nachweis modifizierter Histone.

Nachweis von Histonmodifikationen in Hefezellen mit neurodegenerativer Proteinüberexpression

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Lernen Sie die gezielte In-situ-Mutagenese von Histon-Genen in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Funktion spezifischer Histon-Reste in Chromatin-Prozessen.

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