Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1 ⁺ Pancreatic Vorläufern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, NKX6.1-exprimierende Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in vitro effizient zu erzeugen, indem die Zellen durch vier Schlüsselstadien der Pankreasentwicklung differenziert werden. Durch die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen durch vier Schlüsselstadien der Pankreasentwicklung bietet dieses Protokoll ein Modell zur Untersuchung der Entwicklung der menschlichen Bauchspeicheldrüse in vitro. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen besteht darin, dass wir in der Lage sind, einen hohen Prozentsatz an NKX6.1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Verwendung einer Vielzahl von humanen pluripotenten Stammzelllinien zu erzeugen.

Angesichts der Tatsache, dass Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse das Potenzial haben, insulinproduzierende Beta-ähnliche Zellen zu erzeugen, wird uns diese Technik die Möglichkeit geben, Zellen für die Diabetesbehandlung, für die Wirkstoffforschung und für die Modellierung von Krankheiten zu entwickeln. Beginnen Sie am Tag Null mit der Differenzierung, indem Sie das KnockOut-Serumersatzmedium durch das Differenzierungsmedium am Tag Null ersetzen. Schütteln Sie dann an einem und zwei Tagen die Platte vorsichtig, um abgestorbene Zellen von der Monoschicht zu entfernen, bevor Sie das Medium ansaugen.

Ersetzen Sie es anschließend durch Differenzierungsmedien vom ersten bis zweiten Tag. Am dritten Tag ernten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie. Wenn die Zellen mehr als 90% von CXCR4 und CD117 exprimieren, ist die Effizienz erreicht.

Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig, um abgestorbene Zellen aus der Monoschicht vor der Aspiration zu entfernen, und ersetzen Sie sie durch Differenzierungsmedien für den dritten bis fünften Tag. Es ist wichtig, eine effiziente Induktion der definitiven Unterhaut bis zum dritten Tag durch Durchflusszytometrie sicherzustellen. Wenn der Prozentsatz der Zellen, die sowohl CXCR4 als auch CD117 exprimieren, weniger als 90 % beträgt, wird die Differenzierung zu den Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse wahrscheinlich beeinträchtigt.

Ersetzen Sie an den Tagen sechs und sieben das Medium durch das Differenzierungsmedium vom sechsten bis siebten Tag. Ersetzen Sie an den Tagen acht, 10 und 12 das Medium durch das Differenzierungsmedium vom achten bis 12. Tag. Ernten Sie dann am 13. Tag die Zellen für die Durchflusszytometrie, um die PDX1- und NKX6.1-Expression zu bestimmen.

Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse zu ernten, dissoziieren Sie die Zellen mit handelsüblicher Trypsin-Lösung gemäß dem Protokoll des Herstellers und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach drei Minuten die Trypsin-Lösung und suspendieren Sie die einzelnen Zellen erneut in 1.000 Mikrolitern Faxpuffer mit 30 Mikrolitern DNA One. Filtrieren Sie dann die Zellen mit einem 35-Mikrometer-Nylonnetz-Zellsieb und überführen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 455-mal g, bevor Sie die Zellen für die Lebend- oder fixierte Färbung vorbereiten. Suspendieren Sie nun die Zellen erneut in 1.000 Mikrolitern Faxpuffer. Übertragen Sie 200 Mikroliter in zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte für ungefärbte und gefärbte Proben.

Anschließend zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g, entfernen Sie anschließend den Überstand durch Umdrehen der Platte, färben Sie die Zellen mit primären konjugierten Antikörpern in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern für 30 Minuten bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g, nach zwei Minuten entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. Suspendieren Sie die Proben anschließend erneut in 100 Mikrolitern Faxpuffer.

Dann zentrifugieren Sie die Platte 931 mal g für zwei Minuten. Und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen. Anschließend werden die Proben in 300 bis 500 Mikrolitern Faxpuffer erneut suspendiert, in die Ein-Milliliter-Mikroreagenzgläser oder die Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden überführt und die Proben auf einen Durchflusszytomtor geführt.

Wenn die Proben nicht sofort durchgeführt werden können, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius und schützen Sie sie vor Licht. Bei diesem Verfahren wird das Zellpellet in handelsüblicher Fixierungslösung und durchlässiger Isierungslösung für 24 Stunden bei vier Grad Celsius resuspendiert. Nach 24 Stunden zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 455 mal g und suspendieren Sie sie dann erneut in 400 Mikrolitern handelsüblicher Dauerwellenwaschlösung.

Übertragen Sie anschließend 200 Mikroliter der Probe in zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte für die IGG-Kontrolle und die PDX1-, NKX6.1-Färbung und zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g. Suspendieren Sie dann die Zellpellets erneut in 100 Mikrolitern handelsüblicher Dauerwellenwaschlösung, die Anti-PDX1- und Anti-NKX61-Primär- oder Isotopenkontrollantikörper enthält. Inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g, entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte und suspendieren Sie die Proben erneut in 100 Mikrolitern der handelsüblichen Dauerwellenwaschlösung. Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen.

Anschließend werden die Proben in 100 Mikrolitern Dauerwellenwaschlösung mit Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur eine Stunde lang erneut suspendiert und vor Licht geschützt. Nach einem Haus zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang 931 mal g, entfernen Sie dann den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen, danach suspendieren Sie die Proben erneut in 100 Mikrolitern handelsüblicher Dauerwellenwaschlösung, zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 931 mal g und entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. Suspendieren Sie dann die Probe erneut in 100 Mikrolitern handelsüblicher Dauerwellenwaschlösung und zentrifugieren Sie die Platte erneut zwei Minuten lang bei 931 mal g, bevor Sie den Überstand entfernen.

Anschließend werden die Proben in 300 bis 500 Mikroliter Faxpuffer erneut suspendiert und in die separaten Ein-Milliliter-Reagenzgläser oder fünf Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden für die Durchflusszytometrie überführt. Hier ist ein Sematik der Induktion von Pankreas-Vorläuferzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen gezeigt, das den Tag der Differenzierung, das Entwicklungsstadium, das Basismedium und die in jedem Stadium hinzugefügten Zytokine anzeigt. Und hier sind die Phasenkontrastbilder in den Schlüsselphasen der Pankreasdifferenzierung.

Die H1-Zellen wurden nach dem abgebildeten vierstufigen Differenzierungsprotokoll differenziert. Mit undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen am Tag Null, definitivem Endoderm im ersten Stadium, hinterem Darm im vierten Stadium im zweiten Stadium, Pankreas-Endoderm im dritten Stadium und NKX6.1 positiven Endoderm-Pankreasvorläufern im vierten Stadium. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Durchflusszytometrie-Diagramme des dritten Tages für die CXCR4 PE- und CD117 APC-Antikörperfärbung.

Hier ist die ungefärbte Probe und hier ist die gefärbte Probe. Und diese Abbildung zeigt repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von Tag 13 für abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen im vierten Stadium, die NKX61 und PDX1 exprimieren. Dies ist die IGG-Kontrolle und dies ist die gefärbte Probe.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 13 Tagen durchgeführt werden. Dies kann jedoch je nach verwendeter Zelllinie variieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Agenten aufgrund der Variabilität von Charge zu Charge zu testen.

Nach Befolgung des Verfahrens können die NKX6.1-positiven Pankreas-Vorläuferzellen unter Verwendung anderer veröffentlichter Protokolle weiter zu insulinproduzierenden Beta-ähnlichen Zellen differenziert werden. Dies bietet eine Plattform für die Untersuchung der Reifung und Entwicklung von Betazellen in vitro. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie menschliche pluripotente Stammzellen effizient von Pankreasvorläuferzellen unterscheiden können, indem Sie die Zellen durch vier Schlüsselstadien der Entwicklung führen.