Name: Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1 + Pancreatic Vorläufern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1+ Pankreas-Vorläufern in vier Stufen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung hoher Anteile positiver Zellen für Diabetes-Forschung.

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Das Manuskript wurde durch Mittel aus dem Toronto General und West-Stiftung und der Banting &amp; Best Diabetes-Zentrum-Universität Health Network Graduate-Award unterstützt.

1. Herstellung von Lösungen und Medien HINWEIS: Bereiten Sie alle Medien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Medien muss sofort hergestellt und verwendet werden. Reagenz Details sind in der Werkstoff - Tabelle zur Verfügung gestellt. <ol><li> Differenzierung Medien <ol><li> Bereiten Sie Tag 0 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG. </li><li> Bereiten Sie Tag 1-2 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml Ascorbinsäure. </li><li> Bereiten Sie Tag 3-5 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Vorbereitung Tag 6-7 Differenzierungsmedium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM Retinsäure, 50 ng / ml NOGGIN. HINWEIS: RetinoicSäure sollte zuletzt zu den Medien hinzugefügt werden und Medien sollten vor Licht geschützt werden oxidativen Abbau 15 zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie Tag 8-12 Differenzierung Medium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM Nicotinamid. </li></ol></li><li> Bereiten FACS-Puffer: 10% FBS in PBS, minus Calcium und Magnesium. </li></ol> 2. HESC Differenzierung HINWEIS: HESC werden aufgetaut, passagiert und erweitert auf bestrahlte embryonalen Maus - Fibroblasten in Gegenwart eines KOSR basierte Medien , ergänzt mit 16 bFGF. HESCs sind bereit für die Differenzierung, wenn die Zellen 80-95% Konfluenz erreichen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Kolonien groß sein , mit definierten Grenzen und einer &quot;kuppelartigen&quot; Struktur (1A). Alle Zellkultur wird in Flachboden-Gewebekultur behandelten Platten, beschichtet mit 0,1% Gelatine durchgeführt. Typischerweise werden die Zellen in 6 angebaut oderPlatten mit 12 Vertiefungen, in Medienvolumen von 2 ml oder 1 ml. <ol><li> Am Tag 0 beginnen Differenzierung durch die KOSR basierte Medien mit Tag 0 Differenzierungsmedium ersetzt. </li><li> An den Tagen 1 und 2, sanft die Platte schütteln alle toten Zellen aus der Monoschicht zu entfernen, bevor Absaugen. Ersetzen Sie mit Tag 1-2 Differenzierung Medien. </li><li> Am Tag 3 Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie. Wenn die Zellen mehr als 90% CXCR4 + / CD117 + ausdrücken, gehen 2.4 zu treten. </li><li> An den Tagen 3 und 5, vorsichtig auf die Platte schütteln alle toten Zellen von der einschichtigen vor dem Absaugen zu entfernen. Ersetzen Sie mit Tag 3-5 Differenzierung Medien. </li><li> An den Tagen, 6 und 7, mit Tag 6-7 Differenzierung Medien ersetzen. </li><li> An den Tagen 8, 10 und 12, ersetzen mit Tag 8-12 Differenzierung Medien. </li><li> Am Tag 13, für die Durchfluss Ernte Zellen Zytometrie PDX1 und NKX6-1 Ausdruck zu bestimmen. </li></ol> 3. Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Distanzieren Zellen mit1x Handels Trypsinlösung nach dem Protokoll des Herstellers und inkubieren bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Entfernen Sie kommerzielle Trypsin-Lösung und resuspendieren einzelne Zellen in 1000 ul FACS-Puffer mit 30 ul DNase I. </li><li> Filterzellen unter Verwendung einer 35 &amp; mgr; m Nylon-Mesh-Zelle Sieb und in ein Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 455 xg für 5 min. Vorbereitung der Zellen für entweder live oder feste Färbung. </li></ol> 4. Die Färbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Ablauf Vorbereitung für Live - Färbung am Tag 3 <ol><li> Die Zellen in 1000 ul FACS-Puffer. Transfer 200 ul (ungefähr 1-3 x 10 5 Zellen) in zwei Vertiefungen einer 96-Well - Platte (für beide ungefärbten und gefärbten Proben). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Fleck mit primär-konjugierte Antikörper, CXCR4: APC und CD117: PE (siehe M aterialien Tabelle) für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Resuspendieren Proben in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen. </li><li> Führen Proben auf dem Durchflusszytometer 17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li></ol></li><li> Ablauf Vorbereitung für feste Färbung am Tag 13 <ol><li> Resuspendieren des Zellpellets in kommerziellen Fixierung / Permeabilisierung Lösung 24 h bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 455 g für 5 min. Resuspendieren in 400 ul Perm / Wash-Lösung. </li><li> Übertragung von 200 &amp; mgr; l der Probe (etwa 0,5-1 × 10 6 Zellen) zu two Vertiefungen einer 96-Well-Platte (für IgG-Steuerung und PDX1 / NKX6-1 Färbung). Zentrifuge bei 931 × g für 2 min. </li><li> Resuspendieren der Zellpellets in 100 &amp; mgr; l Perm / Wash - Lösung Anti-PDX1 und anti-NKX6-1 primären oder Isotyp - Kontrolle - Antikörper (siehe Materialien Tabelle) enthält. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Wash-Lösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Resuspendieren der Proben in 100 ul Perm / Wash enthaltenden lichtgeschützt Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Waschlösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Vertreteressen Schritt 4.2.9 und 4.2.10. </li><li> Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen. </li><li> Führen Proben auf dem Durchflusszytometer 17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li></ol></li></ol>

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<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erfolgreich Erzeugung NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern aus hPSCs in vitro beruht auf der Verwendung von hochwertigen Kulturen von hPSCs und gerichtet Differenzierung , die genaue Regelung spezifischer Signalwege beteiligt , die wichtige Entwicklungsstadien während der Pankreasentwicklung bestimmen. Obwohl dieses Protokoll kann verwendet werden , robuste Expression NKX6-1 in einer Vielzahl von HPSC Linien zu induzieren , wie zuvor 3 gezeigt, effiziente NKX6-1 Erzeugung die folgen...

Die Prävalenz von Diabetes nimmt und nach dem kanadischen Diabetes Association, wird geschätzt , dass mehr als 11 Millionen Menschen in Kanada sind Diabetiker oder prediabetic, mit 5-10% dieser Personen Typ - 1 - Diabetes (T1D) 1 mit. T1D ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen verursacht wird, die in den Langerhans-Inseln befinden. Derzeit Personen mit T1D benötigen Insulin exogenen Quellen von 2 leben. Trotz der Fortschritte in der Insulintherapie, weiterhin T1D Patienten eine schwierige Zeit haben, ihren Blutzuckerspiegel zu regulieren und auch weiterhin sowohl Hypo- und Hyperglykämie leiden. Eine vielversprechende Behandlungsform wiederherzustellen normoglycemia in T1D die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist, die verwendet werden könnte , eine unbegrenzte Zufuhr von insulinproduzierenden β - Zellen sowohl in vivo und in vitro 3 zu erzeugen , 4, 5, 6, 7. HESCs zu ß-ähnlichen Zellen differenzier könnte es ermöglichen , Diabetes in vitro zu untersuchen, so dass für die Identifizierung neuer therapeutischer Targets für Typ - 2 - Diabetes und Zellen zur Transplantation in T1D Patienten. Der erfolgreichste Versuch, Insulin zu erzeugen Zellen aus hES - Zellen in vitro , ist die embryonale Ereignisse zu rekapitulieren , die 4 während des Pankreasentwicklung auftreten, 5. Dabei geht es um die Manipulation von unterschiedlichen Signalwege genau entscheidenden Phasen der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse modellieren. Bauchspeicheldrüsenentwicklung beginnt mit der Induktion des definitiven Endoderms, die durch die Expression von CXCR4 und CD117 (c-KIT) 8, 9 gekennzeichnet ist. Präzise Regelung von definitive Endoderm Organisation für die Bildung des Darmrohr, erforderlich, die dann anterior-zu-posterior und ventral-dorsal Musterung unterzogen wird. Die dorsalen und ventralen Pankreas Knospen ergeben sich aus der Gegend des hinteren foregut, die die Pankreas- und Duodenal - Homeobox - Gen (Pdx1) zum Ausdruck bringt, die für Pankreas - Entwicklung 10 notwendig ist. Die dorsalen und ventralen Knospen Sicherung der Bauchspeicheldrüse zu bilden, die dann 11 umfangreiche epithelialen Umbau und Erweiterung erfährt. Engagement für die endokrine und exokrine Linie wird durch die Erzeugung von multipotenten Vorläuferzellen (MPL) begleitet , die zum Ausdruck bringen, unter anderem Faktoren die Transkription Pdx1, Nkx6.1 und PTF1A 12, 13. MPL , die endokrinen und duktalen Zellen werden weiterhin Nkx6-1 zum Ausdruck bringen , während PTF1A Ausdruck abnimmt. Im Gegensatz dazu verlieren exokrinen Linie Zellen expression von Nkx6-1 und PTF1A Ausdruck 12 erhalten. Der Transkriptionsfaktor Nkx6-1 hat eine Schlüsselrolle in der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, vor allem während der Differenzierung von endokrinen Vorläuferzellen Zellen zu ß. Wie zuvor beschrieben, Deletion Nkx6-1 zu einer Beeinträchtigung der Bildung von β - Zellen während der Pankreas - Entwicklung 14. Daher sind sowohl in vitro als auch in vivo insulinproduzierenden β - Zellen zu erzeugen erfordert die effiziente Induktion von Nkx6-1. Kürzlich entwickelten wir ein Protokoll zur effizienten PDX1 + / NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern aus hPSCs erzeugen. Diese HPSC abgeleiteten Pankreas - Vorläufern erzeugen reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen 3. Die Differenzierung Protokoll kann in 4 unterteilt werden Stufen charakteristisch: 1) endgültige Endoderm Induktion, 2) hinteren foregut Musterung, 3) Pankreas-Spezifikation und 4) NKX6-1 Induktion. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte des gerichteten Differenzierung.

<table><tbody><tr><td>Medien und Zytokine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Puffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Puffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1x), Phenolrot</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Antikörper für die Durchflusszytometrie (Arbeitsverdünnungen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Konjugat (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Isotyp-Kontrollmaus IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Isotyp-Kontrollziege IgG</td><td>R& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente differenzierung von pluripotenten stammzellen zu nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancreatic vorläufern

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotente Stammzellen haben die Fähigkeit, sich selbst in mehrere Linien erneuern und zu differenzieren, so dass sie eine attraktive Quelle für die Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen zu machen, die für die Untersuchung von und zukünftige Behandlung von Diabetes verwendet werden kann. Dieser Artikel beschreibt einen vierstufigen Differenzierung Protokoll von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen zu erzeugen entworfen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen). Dieses Protokoll kann auf eine Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzellen (HPSC) Leitungen angelegt werden. Der Ansatz zu Pankreas-Vorläuferzellen erzeugen, ist hESCs zu unterscheiden, genau zu wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung modellieren. Dies beginnt mit der Induktion der endgültigen Endoderm, die durch Kultivieren der Zellen in Anwesenheit von Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und CHIR990210 erreicht wird. Eine weitere Differenzierung und Strukturierung mit Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) und Dorsomorphin erzeugt Zellen ähnlich dem hinteren foregut. Die Zugabe von Retinoicsäure-, NOGGIN, SANT-1 und FGF10 unterscheidet hinteren foregut Zellen in Zellen charakteristisch für Pankreas-endoderm. Schließlich führt die Kombination aus Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamid und NOGGIN zur effizienten Erzeugung von PDX1 + / NKX6-1 + Zellen. Durchflusszytometrie durchgeführt wird, die Expression von spezifischen Markern in wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung zu bestätigen. Die PDX1 + / + NKX6-1 pankreatischen Progenitoren am Ende der Stufe 4 sind in der Lage zur Erzeugung von reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen und kann weiter unterschieden werden Insulin-produzierenden Zellen in vitro zu erzeugen. Somit + die effiziente Erzeugung von PDX1 / NKX6-1 + pankreatischen Vorläufern, wie in diesem Protokoll gezeigt, ist von großer Bedeutung , da sie eine Plattform stellt humane Pankreas - Entwicklung in vitro zu studieren und stellt eine Quelle von Zellen mit dem Potential zur Differenzierung zu β-Zellen, die ev konnteentually zur Behandlung von Diabetes verwendet werden.

Effiziente Erzeugung von Pankreas - Vorläufern beruht auf dem Wachstum und Aufrechterhaltung des undifferenzierten durch die genaue Zugabe spezifischer Signalmoleküle während der Differenzierung Protokoll gefolgt Zellen, wie in der schematischen Darstellung in Figur 1A veranschaulicht. Am Tag 0 sollte undifferenzierten Zellen 80-95% konfluent sein und Kolonien sollten definierten Kanten (1A) aufweisen. Während der Stufe 1 wird die Medien erscheinen wahrs...

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Differenzierung durch vier Schlüsselstadien der Pankreasentwicklung effizient pankreatische Vorläuferzellen, die NKX6.1 exprimieren, aus humanen pluripotenten Stammzellen in vitro zu erzeugen. Durch die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen über vier Schlüsselstadien der Pankasentwicklung bietet dieses Protokoll ein Modell, um die menschliche Pankreasentwicklung in vitro zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen liegt darin, dass wir hohe Anteile an NKX6.1-positiven pankreatischen Vorläuferzellen mit einer Vielzahl humaner pluripotenter Stammzelllinien erzeugen können.Da pankreatische Vorläuferzellen in der Lage sind, insulinproduzierende, betaähnliche Zellen zu bilden, eröffnet diese Technik uns die Möglichkeit, Zellen für die Diabetesbehandlung, für die Wirkstoffforschung und für die Krankheitsmodellierung zu entwickeln. Am Tag null beginnen Sie die Differenzierung, indem Sie das KnockOut-Serumersatz-Medium durch das Differenzierungsmedium für Tag null ersetzen. An den Tagen eins und zwei schütteln Sie die Platte vorsichtig, um abgestorbene Zellen aus der Zellschicht zu entfernen, bevor Sie das Medium abpipettieren.Anschließend durch Differenzierungsmedium für Tag eins bis zwei ersetzen. Am dritten Tag die Zellen für die Durchflusszytometrie gewinnen. Wenn die Zellen mehr als 90 % von CXCR4 und CD117 exprimieren, ist die Effizienz erreicht.Dann schwenken Sie die Platte vorsichtig, um abgestorbene Zellen vor dem Absaugen von der Monolayer zu entfernen, und ersetzen Sie das Medium durch Differenzierungsmedium vom Tag drei bis fünf. Es ist wichtig, bis zum Tag drei mittels Durchflusszytometrie sicherzustellen, dass die effiziente Induktion des definitiven Endoderms erfolgt ist. Wenn der Prozentsatz der Zellen, die sowohl CXCR4 als auch CD117 exprimieren, unter 90 % liegt, wird die Differenzierung zu pankreatischen Vorläuferzellen wahrscheinlich beeinträchtigt sein.Am sechsten und siebten Tag wechseln Sie das Medium in Differenzierungsmedium für Tag sechs bis sieben. Am achten, zehnten und zwölften Tag wechseln Sie das Medium in Differenzierungsmedium für Tag acht bis zwölf. Anschließend ernten Sie am dreizehnten Tag die Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Expression von PDX1 und NKX6.1 zu bestimmen.Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse zu gewinnen, lösen Sie die Zellen mit einer kommerziellen Trypsin-Lösung gemäß dem Herstellerprotokoll auf und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach drei Minuten die Trypsin-Lösung und resuspendieren Sie die Einzelzellen in 1.000 µL Fax-Puffer mit 30 µL DNA One. Anschließend filtrieren Sie die Zellen durch einen Zellfilter aus Nylon mit 35 µm Maschenweite und überführen sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 455 × g für fünf Minuten, bevor Sie die Zellen für die lebende oder fixierte Färbung vorbereiten. Resuspendieren Sie die Zellen nun in 1.000 µL Fax-Puffer. Überführen Sie 200 µL in zwei Vertiefungen einer 96-Loch-Platte für die unbehandelten und gefärbten Proben.Anschließend die Platte bei 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren, danach den Überstand durch Umkehren der Platte entfernen, die Zellen mit primärem konjugiertem Antikörper in einem Endvolumen von 100 µL für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Danach die Platte erneut bei 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren, nach zwei Minuten den Überstand durch Umkehren der Platte entfernen. Anschließend die Proben in 100 µL Fax-Puffer resuspendieren.Anschließend die Platte 2 Minuten bei 931 × g zentrifugieren und den Überstand durch Umkehren der Platte entfernen. Danach die Proben in 300 bis 500 µL Fax-Puffer erneut suspendieren, in 1-mL-Mikroteströhrchen oder 5-mL-Rundbodentubes überführen und die Proben an einem Durchflusszytometer messen.Wenn die Proben nicht sofort verarbeitet werden können, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius und schützen Sie sie vor Licht. Bei diesem Verfahren resuspendieren Sie das Zellpellet in einer kommerziellen Fixierungs- und Permeabilisierungslösung für 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach 24 Stunden zentrifugieren Sie die Probe bei 455 × g für fünf Minuten und resuspendieren sie anschließend in 400 µL kommerzieller Perm-Waschlösung.Überführen Sie anschließend 200 Mikroliter der Probe in zwei Vertiefungen einer 96-Loch-Platte für die IGG-Kontrolle sowie die Färbung von PDX1 und NKX6.1 und zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für zwei Minuten. Suspendieren Sie die Zellpellets dann erneut in 100 Mikrolitern einer kommerziellen Permeabilisierungs- und Waschlösung, die die primären Antikörper gegen PDX1 und NKX6.1 oder die Isotyp-Kontrollantikörper enthält. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Platte bei 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren, das Überstand durch Umkehren der Platte entfernen und die Proben in 100 µL der kommerziellen Permeabilisierungs-Pufferlösung resuspendieren. Anschließend die Platte bei 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren. Den Überstand durch Umkehren der Platte entfernen.Anschießend die Proben in 100 Mikroliter Puffer zur Permeabilisierung und Waschung unter Zugabe des sekundären Antikörpers eine Stunde bei Raumtemperatur resuspendieren und vor Licht schützen. Nach einer Stunde die Platte mit 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren, dann den Überstand durch Umkehren der Platte entfernen. Danach die Proben in 100 Mikroliter kommerziellen Puffer zur Permeabilisierung und Waschung resuspendieren, die Platte erneut mit 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren und den Überstand durch Umkehren der Platte abgießen. Anschließend die Probe erneut in 100 Mikroliter kommerziellen Puffer zur Permeabilisierung und Waschung resuspendieren, die Platte erneut mit 931 × g für zwei Minuten zentrifugieren und anschließend den Überstand entfernen.Als Nächstes die Proben in 300 bis 500 Mikroliter Fax-Puffer erneut suspendieren und in separate eintausend Mikroliter-Testr&ouml;hrchen oder f&uuml;nf Milliliter-Rundbodenr&ouml;hrchen &uuml;berf&uuml;hren, um die Durchflusszytometrie durchzuf&uuml;hren. Gezeigt ist hier eine &Uuml;bersicht &uuml;ber die Induktion von Pankreasvorl&auml;ufern aus humanen embryonalen Stammzellen, die den Differenzierungszeitpunkt, den Entwicklungsstadium, das Basalmedium sowie die in jedem Stadium zugesetzten Zytokine angibt. Und hier sind die Phasenkontrastbilder der wichtigsten Stadien der Pankreasdifferenzierung.Die H1-Zellen wurden gemäß dem dargestellten Vier-Stufen-Differenzierungsprotokoll differenziert. Beginnend mit undifferenzierten menschlichen embryonalen Stammzellen am Tag null, definitivem Endoderm in Stufe eins, posteriorem Vorderdarm in Stufe zwei, pankreatischem Endoderm in Stufe drei und NKX6.1-positiven endodermalen pankreatischen Vorläuferzellen in Stufe vier. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Durchflusszytometrie-Diagramme vom Tag drei für die Antikörperfärbung mit CXCR4 PE und CD117 APC.Hier ist die ungefärbte Probe und hier die gefärbte Probe. Diese Abbildung zeigt repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme vom Tag 13 für aus Stadium vier stammende Pankreasvorläuferzellen, die NKX61 und PDX1 exprimieren. Dies ist die IGG-Kontrolle und dies ist die gefärbte Probe.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von 13 Tagen durchgeführt werden. Dies kann jedoch je nach verwendeter Zelllinie variieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Reagenzien aufgrund von Charge-zu-Charge-Variabilität zu testen.Nach Durchführung des Verfahrens können die NKX6.1-positiven pankreatischen Vorläuferzellen mithilfe anderer veröffentlichter Protokolle weiter zu insulinproduzierenden, betaähnlichen Zellen differenziert werden. Dies bietet eine Plattform, um die Reifung und Entwicklung von Beta-Zellen in vitro zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche pluripotente Stammzellen effizient durch die vier wichtigsten Entwicklungsstadien hindurch zu pankreatischen Vorläuferzellen differenziert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt die Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus nicht-transgenen und transgenen humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). hPSCs werden unter Verwendung eines neuronalen Differenzierungsmediums zu neuralen Vorläuferzellen differenziert. Während die Differenzierung in nicht-transgenen Zellen mit kleinen Molekülen induziert wird, werden die transgenen hPSCs durch Zugabe eines Antibiotikums differenziert, das den Promotor für einen neuronalen differenzierungsspezifischen...

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Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

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Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1+ Pankreas-Vorläufern in vier Stufen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung hoher Anteile positiver Zellen für Diabetes-Forschung.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1

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