Name: Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Lernen Sie die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zur Identifizierung von T-Lymphozytensubpopulationen in muriner Aorta, Niere und Lymphknoten bei Hypertonie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Immunzellen auf Einzelzellebene.

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Diese Arbeit wurde von einem American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) bis FL, eine Ausbildung Zuschuss von der National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) zu BLD, American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) zu MA Saleh unterstützt und ein NIH K08 Auszeichnung (HL121671) zu MSM. MSM wird auch durch ein Forschungsstipendium von Gilead Sciences, Inc. unterstützt

Vanderbilt University Institutional Animal Care und Use Committee hat die hier beschriebenen Verfahren genehmigt. Die Mäuse werden untergebracht und versorgt in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press. Überarbeitete 2010). 1. Isolierung des Aorten-Lymphknoten, Niere und Aorta von Mäusen <ol><li> Euthanize die Mäuse durch CO 2 Inhalation. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und vorsichtig die Haut öffnen und die Brustwand mit einer Schere das Herz aussetzen. </li><li> Um die Vaskulatur perfundieren, einen kleinen Einschnitt in den rechten Vorhof durchzuführen und kontinuierlich einzuspritzen mindestens 10 ml kaltem PBS (etwa 1 ml / sec) in die Spitze des linken Ventrikels unter Verwendung eines 21 oder 23 G-Nadel. Perfuse bis alle Organe blanchiert haben. Das Herz blanches zuerst. der Leber Blanchierens anzeigt, dass die Perfusion gut durchgeführt wurde. </li><li> Mit Hilfe von kleinen Zange und einer feinen Schere vorsichtig aufgeschnitten und herausziehen, den Darm,Magen, Milz, Bauchspeicheldrüse und Leber, um besser die Aorta zu visualisieren. HINWEIS: Dieser Schritt hat eine Beschädigung an den Gastrointestinaltrakt Kontamination hervorrufen kann sehr genau durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie und nehmen Sie jede Lunge mit einer Schere. Spülen Sie die Brusthöhle mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine nadellose Spritze verwendet wird. Entfernen Sie überschüssiges Blut und Flüssigkeit mit steriler Gaze. </li><li> Entfernen Sie die Bauch-Aorten-Lymphknoten mit feinen Dissektionszangen. Achten Sie darauf, nicht um die Kapsel zu brechen. Entfernen Sie die restlichen Fett auf der Oberfläche jeder Lymphknoten mit den Dissektionszangen. Schneiden Sie die beiden Nieren mit einer feinen Schere. </li><li> Präparieren Sie die gesamte Aorta (thorakalen und abdominalen Aorta) mit feinen, gebogenen Schere. Starten Sie auf der Ebene des Herzens und sorgfältig sezieren entfernt von der Speiseröhre und der Wirbel bis auf die Ebene der iliakalen Bifurkation sicherstellen, dass die umgebende perivaskulärem Fett an der Aorta befestigt zu halten. HINWEIS: Weitere Dissektion der Aorta remove umgebenden Strukturen unter dem Mikroskop durchgeführt werden kann. Insbesondere entfernen Arterienäste (Arteria carotis, subclavia, abdominal, mesenterialen und Nierenarterien) und Lymphknoten. Halten Sie eine einheitliche Schicht von perivaskulären Fett um jede Aorta, da dies ein Ort ist, wo viele Entzündungszellen in der Einstellung der Hypertonie liegen. Legen Sie jedes Gewebe in getrennten Röhrchen mit kaltem PBS. </li></ol> 2. Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus jedem Gewebe <ol><li> Die Nieren HINWEIS: Die Niere kann durch die Kombination von mechanischer Dissoziation und enzymatischen Verdau in eine Einzelzellsuspension dissoziiert werden. <ol><li> Bereiten Sie die Niere Aufschlußlösung durch Zugabe von Kollagenase D (2 mg / ml) und DNase I (100 ug / ml) zu RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS)). Herstellung von 10 ml pro Nierenprobe. </li><li> Verwenden einer Pinzette die beiden Nieren in eine Dissoziation Rohr zu übertragen, die 10 ml Niere verdauenIonenlösung. </li><li> Führen Sie die mechanische Dissoziation eines halbautomatischen Dissociator Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach der mechanischen Dissoziation, nehmen Sie den Schlauch aus dem Gerät und die enzymatische Verdauung durchführen. Inkubiere die Proben für 20 min bei 37 ºC unter kontinuierlicher Drehung. stoppen Sie sofort die enzymatische Verdauung von kaltem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 5% FBS Zugabe. </li><li> Die Lösung wird durch Pipettieren in ein 50 ml konisches Röhrchen nach dem Filtrieren durch ein 40 um Sieb. Necken das verbleibende Gewebe auseinander, indem sie mit dem Kolben einer 1 ml-Spritze gedrückt. Pellet die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C). </li><li> Das Pellet in 3 ml 36% Dichtegradientenzentrifugation Medien. Übertragung der Suspension in einen 15 ml konischen Röhrchen. fügen Sie vorsichtig 3 ml 72% Dichtegradientenzentrifugation Medien unterhalb der 3 ml 36% ige Zellsuspension ohne Unterbrechung. Zentrifuge (1000 xg ohne Bremse, 20 min, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> Die Immunzellen an der Grenzfläche befinden. Entfernen Sie die oberste gelbliche Schicht Zelltrümmer enthält, und dann das Volumen bringen bis zu 15 ml mit kaltem PBS. Gut schütteln, um den Verlauf Zusammenbruch. Dreh die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C) und das Pellet in 3 ml RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss. </li></ol></li><li> die Aorta <ol><li> Bereiten Sie die Aorta Aufschlußlösung durch Kollagenase A Zugabe (1 mg / ml), Kollagenase B (1 mg / ml) und DNase I (100 ug / ml) zu RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 5% FBS). </li><li> Mit einer feinen Pinzette, übertragen Sie die Aorta in ein 2-ml-Röhrchen mit 1 ml Aorta Aufschlußlösung. Mince die ganze Aorta in sehr kleine Stücke mit einer feinen Schere in der 1 ml Aufschlußlösung. Halten Sie sich auf dem Eis. Inkubiere die Proben für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation. </li><li> Die Lösung wird in einer Gewebekulturschale und stoppen Sie die enzymatic Verdau durch Zugabe von 5-fache des Volumens von kaltem RPMI mit 5% FBS. </li><li> Die Lösung wird durch Pipettieren in ein 50 ml konisches Röhrchen nach dem Filtrieren durch ein 40 um Sieb. Necken das verbleibende Gewebe auseinander in eine Einzelzellsuspension durch mit dem Kolben einer 1 ml-Spritze gedrückt. Spülen Sie das Sieb und Pellet die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C). </li><li> Waschen des Pellets mit 10 ml RPMI mit 5% FBS hinzugefügt wird. Dreh die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C) und das Pellet in 3 ml RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss. </li></ol></li><li> Die Aorten - Lymphknoten <ol><li> Legen Sie eine 40 &amp; mgr; m Sieb in einer Gewebekulturschale (60 mm x 15 mm). Legen Sie die Lymphknoten auf dem Sieb und necken sie auseinander in eine Einzelzellsuspension durch mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze drücken. Spülen Sie das Sieb mit 2 ml RPMI mit 5% FBS. Sammle die Zellen in der Schale. </li><li> Übertragungdie Zellen in einem 15 ml Falcon-Röhrchen und die Zellen Pellet (300 · g, 8 min, 4 ° C). Das Pellet in 500 ul RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss. </li></ol></li></ol> 3. Ex - vivo - Stimulation für Zytokin - Nachweis durch Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie die Zellkulturmedium: RPMI mit 5% FBS, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 50 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol und 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Zentrifuge jeder Zellsuspension aus der Niere, Aorta und Lymphknoten erhalten (300 · g, 8 min, 4 ° C). Resuspendieren jedes Pellet mit dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml. </li><li> Stimuliert die Zellen durch Zugabe von 2 &amp; mgr; l der Zellaktivierung Cocktail (mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), dem Calcium-Ionophor Ionomycin und dem Golgi-Inhibitor Brefeldin A) pro 1 ml der Zellkultur. HINWEIS: Die Endkonzentrations der einzelnen Komponenten sind: 81 nM PMA, 1,33 &amp; mgr; M Ionomycin und 5 ug / ml Brefeldin A. Behandlung mit PMA und Ionomycin aktiviert Zellen Zytokine zu produzieren. Cytokine sind sezernierte Proteine, die in den Zellen eingefangen werden müssen, erkannt werden. Brefeldin A bewirkt, dass die Anhäufung von normalerweise sekretierten Proteinen in das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat. So beschriebene Technik hier erhöht die Nachweisbarkeit von Cytokin-produzierenden Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie. </li><li> Platte 1 bis 2.000.000 Zellen in einer 12-Well (Aorta oder Niere) oder mit 24 Vertiefungen (Lymphknoten) geringe Haftplatten. Die Platte wird in einem 37 ° C befeuchteten CO 2 Inkubator für 3 Stunden. HINWEIS: Die Anzahl der plattierten Zellen können von Kontrollmäusen in Lymphknoten niedriger sein. Auch hat die Zeit der Stimulation empirisch für jede Zellpopulation und Zytokinproduktion untersucht bestimmt werden. Im Falle von T-Zellen von Aorta, Niere oder Lymphknoten isoliert, empfehlen wir stimulierenden für 3 bis 4 Stunden. Eine längere Stimulation wkrank nicht die Zytokinsekretion erhöhen und eine weitere Herabregulation von mehreren T-Zell-Oberflächenmarker wie CD3, CD4 und CD8 induzieren. (Beachten Sie, dass selbst eine 3-4 Stunden Stimulation wird einige Herunterregulierung dieser Marker induzieren.) </li></ol> 4. Oberflächenfärbung <ol><li> Übertragen Sie die Zellen in eine Polystyrol-FACS-Röhrchen und zentrifugiert (300 · g, 8 min, 4 ° C). Wasche die Zellen zweimal mit FACS - Puffer (Ca 2+ und Mg + free PBS , enthaltend 4% FBS und 2 mM EDTA) und teilen sich die Zellsuspension gleichmäßig in verschiedene FACS - Röhrchen basierend auf der Anzahl von Antikörper - Panels gewünschten und der Anzahl der Kontrollröhrchen benötigt ( siehe unten). </li><li> Zur Kompensation für jedes Panel ausführen, bereiten ungefärbten Kontrollröhrchen und einzelne gefärbten Röhrchen für jede Gewebeart und Antikörper-Panel. Darüber hinaus Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollröhrchen für jeden Antikörper Tafel herzustellen, indem man alle bis auf einen der Antikörper hinzugefügt wird. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der einzelnen Röhrchen auf 2 ml mit FACSPuffer. Centrifuge die Zellsuspension (300 · g, 8 min, 4 ° C), entfernen Sie den Überstand und Block Fc-Rezeptoren durch die Zellen Inkubation mit 0,5 ug anti-CD16 / CD32-Antikörper pro Million Zellen für 10 min auf Eis. HINWEIS: CD16 ist eine geringe Affinität IgG-Fc-Rezeptor III (FcR III) und CD32 ist FcR II. CD16 / CD32 auf Granulozyten, Mastzellen, Monozyten / Makrophagen, natürliche Killerzellen, B-Zellen, dendritischen Zellen und einigen aktivierten reifen T-Zellen exprimiert wird. </li><li> Führen Sie die Lebensfähigkeit Färbung: Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, Zentrifuge (300 · g, 8 min, 4 ° C) und resuspendieren in 1000 ul 1x PBS. 1 &amp; mgr; l eines zell impermeant aminreaktiven Farbstoff (Lebensfähigkeit stain). Inkubieren für 15 min bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li><li> Während der Inkubation bereiten den Cocktail von Antikörpern (für Oberflächenfärbung) in einem geeigneten Volumen von FACS-Puffer. Wasche die Zellen zweimal mit 1-2 ml FACS-Puffer, Zentrifuge (300 · g, 8 min, 4 ° C) und resuspendieren jedes Pellet mit 100 ulder Antikörpermischung. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C vor Licht geschützt. HINWEIS: Für jede Durchflusscytometrie-Antikörper, es ist nützlich, um die optimale Menge an Antikörper, der durch Durchführen einer Dosis Titrationskurve erforderlich zu bestimmen. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit 2 ml FACS-Puffer und pelletieren Sie die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C). </li></ol> 5. Fixierung, Permeabilisierung und intrazelluläre Färbung <ol><li> Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einer Fixierung und Permeabilisierung Kit mit geeigneten Puffern durch den Anweisungen des Herstellers folgen. Fix und die Zellen permeabilisiert, indem sie in dem geeigneten Puffer resuspendieren. Inkubieren Proben für 40 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li><li> 1 ml 1x Permeabilisierung und Waschpuffer direkt zu den festen und permeabilisierten Zellen. Zentrifuge (500 · g, 8 min, 4 ° C) und den Überstand entfernen. Das Pellet mit 2 ml 1x Waschpuffer. </li><li> Bereiten Sie die Mischungen aus ANTIBodies (für intrazelluläre Färbung nur) in einem geeigneten Volumen 1x Waschpuffer (in der Regel 100 &amp; mgr; l pro Röhrchen). HINWEIS: Wie oben beschrieben, ist die optimale Antikörperkonzentration muss für jeden Antikörper in der Platte bestimmt werden. Zum Beispiel für Antikörper gegen IL-17A oder IL-17F, verwenden wir ein Verdünnungsfaktor von 1:30, aber für Antikörper gegen IFNy und T-bet, verwenden wir ein Verdünnungsfaktor von 1: 100. </li><li> Zentrifuge die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C) und jedes Pellet mit 100 ul der Antikörpermischung resuspendieren. Inkubieren für 40 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml 1x Waschpuffer und Pellet die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C). Das Pellet mit 300 ul 1x Waschpuffer und zu analysieren, auf einem Durchflusszytometer mit geeigneten Filtern. </li><li> Zur Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen pro Gewebeprobe, Zählen Perlen verwenden. Vor der Akquisition der empfohlenen Volumen / Anzahl der Perlen in jedes Röhrchen zu zählen. </li></ol> 6. Entschädigung, Gating, Normalisierungs und Tipps <ol><li> Kompensation und Gating <ol><li> Führen Sie ungefärbten und einzelne gefärbten Kontrollröhrchen zur Kompensation für die spektrale Überlappung einzustellen. HINWEIS: Die Verwendung von Kompensations Perlen anstatt zellbasierte Kompensationssteuerungen ist notwendig in Fällen, in denen das Antigen von Interesse oder Zellpopulation in einer Probe bei so niedrigen Niveaus Zellen schwierig wird verwenden, die Kompensation vorhanden ist. Auch der Hinweis, wenn Tandem-Farbstoffe verwendet werden, ist es ratsam, Kompensationen für jedes Experiment herzustellen, da Tandem-Farbstoffe von Charge zu Charge variieren und mit jedem Tag. </li><li> Führen Sie Fluoreszenz minus eins Kontrollen (RGV) für alle Fluorophore in der Platte, wenn ein neues Mehrfarben Experiment zu starten. HINWEIS: Die FMO Kontrollen sind Proben, die alle Antikörper in der Platte enthalten, mit Ausnahme eines. Diese Kontrollen erlauben eine genaue Unterscheidung von positiven gegenüber negativen Signale für die versäumte Antikörper richtig adjust die Tore. Diese Steuerungen sind besonders wichtig, wenn die Expressionsniveaus niedrig sind oder wenn die Trennung der Zielbevölkerung gering ist (beispielsweise, wenn das Ziel ein Cytokin oder Transkriptionsfaktor ist). Obwohl es nicht immer notwendig, in einigen Fällen Isotypkontrollen kann anstelle bevorzugt werden von FMO kontrolliert, da sie eine angemessene Entschädigung für den Antikörper-Isotyp und Fluorophor-Konjugat ohne die Spezifität des Antigens bereitzustellen. </li><li> Legen Sie die primäre Tor nach oben: justieren Forward Scatter Area (FSC-A) und Seitenstreubereich (SSC-A) Spannung, um die Leukozyten-Population zu erfassen. </li><li> Schließen Sie die toten Zellen. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit Fleck reagiert mit freien Aminen vorhanden sowohl auf der Oberfläche und das Innere von Zellen. Im Gegensatz Zellen zu leben, tote Zellen (mit geschwächtem Membranen) ermöglichen es dem Farbstoff in das Zytoplasma zu geben, die Menge an Proteinmarkierung zu erhöhen. So werden tote Zellen heller als lebende Zellen ermöglicht leichte Unterscheidung. Tor auf dem LiveZellen. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellsuspension aus der Aorta und der Niere kann niedriger als die Lebensfähigkeit der Zellsuspensionen aus den Lymphknoten aufgrund der zusätzlichen Verdauungsschritt. </li><li> Plot Forward Scatter Area (FSC-A) [y-Achse] und Forward Scatter Höhe (FSC-H) [x-Achse]. Sonderangebot erscheinen als Diagonale auf diesem Punktdiagramm. Tor auf dieser Diagonale Dubletten auszuschließen. Dann zeichnen SSC-A [y-Achse] und CD45 [x-Achse]. </li><li> Die CD45 + Leukozytenpopulation leicht identifiziert werden können. Tor auf dieser Population. Nachfolgende Populationen können aus dieser Population identifiziert werden. </li></ol></li><li> Normalisierung der Zellzählungen <ol><li> Zählen Perlen haben Eigenschaften, die in niedrigen FSC und hohe SSC führen. Wenn beispielsweise 50.000 Kügelchen in 300 &amp; mgr; l der Einzelzellsuspension zugegeben werden, die Gleichung für die Berechnung der absoluten Anzahl von beliebigen Zelltyp geben pro Röhrchen wie folgt ist: Anzahl der Zellen per Rohr = (50.000 / Anzahl der Kügelchen gezählt vom Durchflusszytometer) gezählt x Anzahl der Zellen. Mit Hilfe dieser Berechnung kann die absolute Anzahl von einem gegebenen Zelltyp pro Röhrchen bestimmt werden. Basierend darauf, wie viele Röhrchen aus jedem Organ erzeugt wurden, kann die Anzahl der Zellen pro Organ berechnet werden. HINWEIS: Bewahren Sie alle Zellen und Reagenzien bei 4 ° C während des Protokolls. Vermeiden Sie heftiges Vortexen, weil sie Zellen schädigen können. Verwenden minimale Kräfte um die Zellen zu pelletieren. Vermeiden Sie Blasen in der FACS-Röhrchen zu machen, da es den Zelltod fällen kann. Nicht die Pellets zu jeder Zeit austrocknen lassen. </li></ol></li></ol>

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MSM wird durch einen Zuschuss von Gilead Sciences Herz-Kreislauf unterstützt.

Das hierin beschriebene Protokoll wurde optimiert, um T-Zell-Untergruppen, die in den Nieren, der Aorta und den Lymphknoten von Mäusen vorhanden sind, ordnungsgemäß zu identifizieren. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Immunzelluntergruppen wie B-Lymphozyten und angeborene Immunzellen zu untersuchen, und kann modifiziert werden, um andere Gewebetypen einzubeziehen. Der Verdauungsschritt ist kritisch und muss für jedes Gewebe modifiziert und optimiert werden9. Ein längerer Verdauungsschrit...

Neuere Erkenntnisse zeigen , dass das adaptive Immunsystem, insbesondere T - Lymphozyten, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen 1,2,3,4,5 spielen. Beispielsweise im Modell der Angiotensin - II induzierten Bluthochdruck, eine Anhäufung von T - Zellen in den Gefäßen und den Nieren der Mäuse wurde 6 beschrieben. Das vaskuläre Akkumulation überwiegend in der Adventitia und des perivaskulären Fett. In der Niere akkumulieren T-Zellen sowohl in der Medulla und Nierenrinde. Je nachdem , welche Teilmenge beteiligt ist, geben diese T - Zellen zu unterschiedlichen Zytokine, vaskulären und renalen Funktion und führen zur Entwicklung der Pathologie (rezensiert von McMaster et al. 6) beeinflussen. T - Helfer 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regulatorischen T (Treg - Zellen) und T follikulären Helfer (Tfh) Zellen auf der Grundlage ihrer Funktionen und Unterschrift Zyto: CD4 + T - Helfer - Lymphozyten können in mehrere Untergruppen unterteilt werdenkines 7. In ähnlicher Weise können CD8 + zytotoxische T - Zellen als Tc1, Tc2, TC17 oder Tc9 8 klassifiziert werden. Es gibt auch doppelt negative T - Zellen (dh Zellen, die die CD4 oder CD8 - T - Zell - Marker nicht exprimieren). Eine Teilmenge dieser Zellen besitzen eine alternative gamma delta T-Zellen-Rezeptor (anstelle der klassischen Alpha- und Beta-Rezeptoren) und werden deshalb nachfolgend als gamma delta T-Zellen. Die Multi-Parameter-Analyse mittels Durchflusszytometrie von Oberflächenmarker, Cytokinen und Transkriptionsfaktor bildet den besten Ansatz, um diese Zellen zu identifizieren. Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf dem Gebiet der Immunologie verwendet wird, ist es weniger gut in festen Organen und bei der Festlegung von cardiovaskulären Erkrankungen beschrieben. Historisch gesehen war die Identifizierung von Lymphozyten in Gewebe zu Immunhistochemie oder RT-PCR Ansätze beschränkt. Obwohl Immunhistochemie und Immunfluoreszenz sind leistungsfähige Methoden, um die Gewebeverteilung eines Antigens von int zu bestimmenerest, sie sind unzureichend phänotypisch die Untergruppen identifizieren beteiligt. Darüber hinaus, während RT-PCR-Analyse nützlich ist, die mRNA-Expression von Antigenen, Cytokinen oder Transkriptionsfaktoren zu erkennen, erlaubt es nicht die Detektion von mehreren Proteinen gleichzeitig auf der Ebene einzelner Zellen. Das Aufkommen der Durchflusszytometrie, vor allem, wenn sie mit intrazellulären Färbung kombiniert Zytokinen und Transkriptionsfaktoren zu erfassen, stellt die Ermittler mit einer leistungsstarken Technik, die Identifizierung und Quantifizierung auf Einzelzellebene von Immunzelluntergruppen in festen Organen ermöglicht. Wir haben eine intrazelluläre Anfärbung Assay optimiert durch Durchflusszytometrie der großen T-Zell-Untergruppen, die innerhalb murine Nieren Aorta und aortic drainierenden Lymphknoten in einem Modell von Angiotensin II induzierten Bluthochdruck zu identifizieren. Die Optimierung jedes Schrittes: Gewebe Verdauung, ex vivo - Aktivierung, Permeabilisierung und Oberfläche und die intrazelluläre Färbung entsteht ein hoch wiederproduzierbar Assay, der auf andere kardiovaskuläre und renale Krankheitsmodellen angewendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Für die Dichtegradientenzentrifugation</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; C-Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissoziatorgerät</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Verwenden Sie das Programm SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Zellaktivierungscocktail (mit Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>verdünnt 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixierbares violettes Totzellen-Färbeset</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionsfaktor-Puffersatz</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 Stück eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (Klon 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (Klon 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (Klon TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (Klon 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (Klon GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (Klon 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (Klon 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (Klon XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

intrazelluläre färbung und durchflusszytometrie zu identifizieren lymphozytensubpopulationen in murine aorta, niere und lymphknoten in einem modell von hypertonie

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Es ist mittlerweile allgemein bekannt, dass T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung mehrerer Herz-Kreislauf-Erkrankungen spielen1,2,3,4,5. Zum Beispiel haben Studien aus unserer Gruppe gezeigt, dass Bluthochdruck mit einer übermäßigen Ansammlung von T-Zellen in den Gefäßen und der Niere während der Entwicklung der experimentellen Hypertonie verbunden ist6. In diesen Geweben produzieren T-Zellen mehrere Zytokine, die sowohl die Gefäß- als auch die Nierenfunktion beeinflussen und zu Vasokonstriktion sowie Natrium- und Wasserretention führen1,2. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen Herz-Kreislauf- und Nierenerkrankungen verursachen, ist es wichtig, die spezifischen T-Zell-Untergruppen in diesen Geweben identifizieren und quantifizieren zu können. T-Zell-Untergruppen werden durch eine Kombination von Oberflächenmarkern, den von ihnen sezernierten Zytokinen und den von ihnen exprimierten Transkriptionsfaktoren definiert. Die Komplexität der T-Zellpopulation macht die Durchflusszytometrie und die intrazelluläre Färbung zu einer unschätzbaren Technik, um die Phänotypen der im Gewebe vorhandenen Lymphozyten zu entschlüsseln. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung der oberflächen- und intrazellulären Marker (Zytokine und Transkriptionsfaktoren) in T-Zellen zur Verfügung, die aus murinen Nieren-, Aorta- und Aortendrainage-Lymphknoten in einem Modell der Angiotensin-II-induzierten Hypertonie isoliert wurden. Folgende Schritte werden detailliert beschrieben: Isolierung der Gewebe, Erzeugung der Einzelzellsuspensionen, ex vivo Stimulation, Fixierung, Permeabilisierung und Färbung. Darüber hinaus werden mehrere grundlegende Prinzipien der durchflusszytometrischen Analyse diskutiert, einschließlich der Auswahl der richtigen Kontrollen und geeigneter Gating-Strategien.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Markern in T aus murinen Nierenzellen isoliert, Aorta und aortic drainierenden Lymphknoten in einem Modell von Angiotensin II induzierten Bluthochdruck. Repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt. Abbildung 1 zeigt die Gating - Strategie verwendet , um die T - Zellpopulation in einer Einzelzellsuspension aus de...

Dieser Artikel enthält detaillierte Methodik zur Identifizierung und funktionelle T-Lymphozyten-Untergruppen, die innerhalb Maus Niere, Aorta und der Lymphknoten durch die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Das Modell der Angiotensin-II-induzierte Hypertonie wurde zu erklären, ausgewählt, Schritt-für-Schritt, die Verfahren und die grundlegenden Prinzipien der Durchflusszytometrie und intrazelluläre Färbung.

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Einzelzell-Suspensionen aus der murinen Aorta, den Nieren und den Lymphknoten zu gewinnen, um Immunzellen in einem Modell der durch Angiotensin II induzierten Hypertonie zu quantifizieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise, welche beiden Lymphozyten-Subpopulationen die Entstehung einer Hypertonie fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Identifizierung und Quantifizierung von Immunzell-Subpopulationen in festen Organen auf Einzelzell-Ebene ermöglicht.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, desinfizieren Sie die Brust der Maus mit 70 %igem Ethanol. Öffnen Sie dann vorsichtig mit einer Schere die Haut und die Brustwand, um das Herz freizulegen. Um die Gefäße zu perfundieren, führen Sie einen kleinen Einschnitt in das rechte Atrium ein und spritzen kontinuierlich mindestens 10 Milliliter kalte PBS-Lösung mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Sekunde in die Spitze des linken Ventrikels.Wenn alle Organe entfärbt sind, entfernen Sie mit feinen Dissektionspinzetten die abdominalen, aortennahen Lymphknoten, wobei darauf zu achten ist, dass die Kapseln nicht verletzt werden. Entfernen Sie unter dem Stereomikroskop mit feinen Scheren die beiden Nieren. Anschließend wird mit feinen gebogenen Scheren die gesamte thorakale und abdominale Aorta vom Herzen bis zur Iliakalgabelung präpariert, wobei das umgebende perivaskuläre Fettgewebe an der Aorta belassen wird.Als Nächstes überführen Sie die Nieren in ein Dissoziationssröhrchen, das 10 Milliliter Nierendigensionslösung enthält, und verwenden Sie einen halbautomatischen Dissoziator, um das Nierengewebe gemäß den Herstelleranweisungen mechanisch zu disaggregieren. Am Ende der Dissoziation inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Rotation. Stoppen Sie nach 20 Minuten die enzymatische Verdauung unverzüglich mit kaltem RPMI 1640-Medium, das mit 5 % FBS ergänzt wurde, und filtrieren Sie die erhaltene Gewebeaufschlämmung durch einen 40-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Konischrohr.Verwenden Sie den Kolben eines Ein-Milliliter-Spritze, um das verbleibende Gewebe zu zerkleinern. Anschließend pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter 36%-Dichtegradientenmedium und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.Überlagern Sie die Zellen vorsichtig mit drei Millilitern 72%igem Dichtegradientenmedium, achten Sie darauf, die Schichten nicht zu stören, und trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Die Immunzellen befinden sich an der Grenzfläche. Entfernen Sie die oberste, gelbliche Schicht, die zellulären Abfall enthält, und stellen Sie das Volumen anschließend mit kaltem PBS auf 15 Milliliter ein.Gut schütteln, um den Gradienten aufzubrechen, und die Zellen anschließend durch Zentrifugation waschen. Um die immunen Zellen der Aorta zu isolieren, die Aorta in ein zwei Milliliter fassendes Reaktionsröhrchen überführen, das ein Milliliter frisch zubereitete Aorta-Digensionslösung auf Eis enthält, und mit feiner Schere die gesamte Aorta in feine Stücke zerkleinern. Danach die Fragmente bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten unter kontinuierlicher Rotation inkubieren. Am Ende der Verdauung kaltes RPMI mit 5 % FBS im fünffachen Volumen der Verdauungslösung hinzufügen und die resultierende Gewebesuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter sieben. Anschließend die Einzelzell-Suspension durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in frischem RPMI mit FBS resuspendieren. Um eine Einzelzell-Suspension aus den aortennahen Lymphknoten zu gewinnen, die Lymphknoten auf einen 40-Mikrometer-Filter in einer 60 mal 15 Millimeter großen Zellkulturschale überführen und mit dem Kolben einer 1-Milliliter-Spritze das Gewebe disaggregieren.Danach spülen Sie das Sieb mit zwei Millilitern RPMI plus FBS und überführen die freigesetzten Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Um die Zellen zu stimulieren, stellen Sie zunächst jede Zellsuspension auf eine Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in Zellkulturmedium ein. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter des Zellaktivierungscocktails zu jeder Zellgruppe pro Milliliter Medium hinzu.Übertragen Sie anschließend ein- bis zweimal 10 hoch 6 aortale oder Nierenzellen pro Mulde in eine 12-Mulden-Platte und ein- bis zweimal 10 hoch 6 Lymphknotenzellen pro Mulde in eine 24-Mulden-Platte. Stellen Sie die Platten drei Stunden lang in einen befeuchteten CO₂-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Überführen Sie die Zellen danach in die entsprechenden passenden Polystyrol-FACS-Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Nachdem die Zellen zwei Mal unter denselben Zentrifugierbedingungen mit frischem FACS-Puffer gewaschen wurden, blockieren Sie unspezifische Bindungen mit FC-Block und waschen die Zellen in PBS. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter frischem PBS und färben Sie die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem Mikroliter einer zellunpermeablen, aminreaktiven Vitalitätsfarbe, wobei das Licht ausgeschlossen werden muss. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen erneut zwei Mal in ein bis zwei Milliliter FACS-Puffer und resuspendieren die Pellets in 100 Mikroliter der geeigneten Antikörpercocktail-Lösung für die Oberflächenmarkierung.Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius und Lichtschutz die Zellen zwei weitere Male mit je zwei Milliliter frischem FACS-Puffer waschen und anschließend mit einem Fixierungs- und Permeabilisierungs-Kit gemäß den Herstelleranweisungen fixieren und permeabilisieren. Danach die Zellen mit dem gewünschten intrazellulären Antikörpercocktail markieren und erneut mit FACS-Puffer waschen. Zur Durchflusszytometrie-Analyse der stimulierten intrazellulären Zytokinproduktion zunächst die nicht gefärbten und einfach gefärbten Kontrollröhren messen, um die spektrale Überlappung auszugleichen, gefolgt von den Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen für jeden Fluorophor im Panel.Nachdem die grundlegenden Parameter für die Fluoreszenzanalyse eingestellt wurden, verwenden Sie ein Streudiagramm der Vorwärtsstreuung gegenüber der Seitenstreuung, um das primäre Gate für die Detektion der Leukozytenpopulation zu definieren, gefolgt von einer Gating-Strategie, um tote Zellen anhand ihres Fehlens an Vitalitätsfarbstoffexpression auszuschließen. Tragen Sie die Vorwärtsstreuung (Fläche) gegen die Vorwärtsstreuung (Höhe) auf und setzen Sie ein Gate, um Doppelzellen auszuschließen. Die Leukozyten können anschließend anhand ihrer CD45-Expression identifiziert werden.Um das Vorhandensein von IL-17A- oder IL-17F-produzierenden T-Zellen in der murinen Niere oder Aorta zu bestimmen, können Einzelzell-Suspensionen wie gerade für die Fluoreszenz-ohne-eins-Kontrollanalyse jedes Zytokins gezeigt hergestellt werden. Wie erwartet sind in den Fluoreszenz-ohne-eins-Kontrollen nur sehr wenige Zellen positiv für IL-17A oder IL-17F, wodurch eine genaue Unterscheidung zwischen positiven und negativen Signalen ermöglicht wird, um die Gating-Bedingungen korrekt für die Identifizierung von IL-17A- oder IL-17F-positiven Zellen in den Versuchsproben anzupassen. Eine repräsentative intrazelluläre Färbung von T-Zellen, isoliert aus der Niere und der Aorta von Wildtyp-Mäusen, die mit Vehicle oder Angiotensin II infundiert wurden, zeigt das Vorhandensein einer Teilpopulation von IL-17A- oder IL-17F-exprimierenden T-Zellen in beiden Geweben auf.Weiterhin zeigt die intrazelluläre Färbung von T-Zellen aus den aortendrainierenden Lymphknoten, dass CD8-positive T-Zellen nach Stimulation mit Angiotensin II Interferon Gamma und T-bet exprimieren. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie je nach Anzahl der zu verarbeitenden Gewebe in sechs bis neun Stunden durchgeführt werden. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell und effizient zu arbeiten, um den Zelltod so gering wie möglich zu halten.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Einzelzell-Suspension aus der murinen Niere, der Aorta und den Lymphknoten erzeugt und immunologische Zellsubpopulationen aus diesen Organen charakterisiert und quantifiziert. Diese Technik ermöglicht es der kardiovaskulären und renalen Physiologie, Veränderungen in den Immunzellpopulationen zu untersuchen, die zur Hypertonie und anderen proinflammatorischen Erkrankungen beitragen können.

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Wir beschreiben Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen in Mausmodellen durch Präzisionsschnitte der Aortenhöhle und der aufsteigenden Aorta in Kombination mit histochemischer und immunhistochemischer Analyse.

Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

Die Funktion der vaskulären Zellen hängt von der Aktivität der intrazellulären Botenstoffe ab.  Beschrieben wird hier ein ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren, das die Messung des intrazellulären Calcium- und Stickoxidspiegels als Reaktion auf physiologische und pharmakologische Reize in einzelnen endothelialen und glatten Muskelzellen einer isolierten Aorta ermöglicht.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von transgenen Reporter Mäuse und verschiedenen Verwaltung Routen von Fluoreszenzfarbstoffen in Angiotensin-II-induzierte Hypertonie mit intravitalen Videomikroskopie der Blutgefäße, um die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten und ihre Fähigkeit, Rollen und halten uns an das Endothel.

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Lernen Sie die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zur Identifizierung von T-Lymphozytensubpopulationen in muriner Aorta, Niere und Lymphknoten bei Hypertonie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Immunzellen auf Einzelzellebene.

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie (Video) | JoVE Journal

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

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