Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einzellige Suspensionen aus der murinen Aorta, der Niere und den Lymphknoten zu erhalten, um Immunzellen in einem Modell der Angiotensin-II-induzierten Hypertonie zu quantifizieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beantworten, z. B. welche zwei Lymphozyten-Untergruppen die Entwicklung von Bluthochdruck begünstigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Identifizierung und Quantifizierung von Immunzelluntergruppen in soliden Organen auf Einzelzellebene ermöglicht.

Desinfizieren Sie die Mäusebrust vor Beginn des Eingriffs mit 70% Ethanol. Öffnen Sie dann mit einer Schere vorsichtig die Haut und die Brustwand, um das Herz freizulegen. Um das Gefäßsystem zu perfundieren, machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und injizieren Sie kontinuierlich mindestens 10 Milliliter kaltes PBS mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Sekunde in die Spitze des linken Ventrikels.

Wenn alle Organe blanchiert sind, verwenden Sie eine Feinpräparierzange, um die Lymphknoten zu entfernen, die die Bauchaorta drainieren, und achten Sie darauf, dass die Kapseln nicht platzen. Unter einem Präpariermikroskop entfernen Sie die beiden Nieren mit einer feinen Schere. Verwenden Sie dann eine feine gebogene Schere, um die gesamte thorakale und abdominale Aorta beginnend am Herzen und endend an der Beckengabelung zu präparieren, wobei darauf zu achten ist, dass das umgebende perivaskuläre Fett an der Aorta haftet.

Übertragen Sie anschließend die Nieren in ein Dissoziationsröhrchen mit 10 Millilitern Nierenverdauungslösung und verwenden Sie einen halbautomatischen Dissoziator, um das Nierengewebe gemäß den Anweisungen des Herstellers mechanisch zu disaggregieren. Am Ende der Dissoziation inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Rotation. Stoppen Sie nach 20 Minuten sofort den enzymatischen Aufschluss mit kaltem RPMI 1640-Medium, das mit 5%FBS ergänzt ist, und filtrieren Sie die resultierende Gewebeaufschlämmung durch ein 40-Mikron-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Verwenden Sie den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das restliche Gewebe auseinander zu kitzeln. Anschließend pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern eines Mediums mit einem Dichtegradienten von 36 % und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Schichten Sie vorsichtig drei Milliliter eines Gradientenmediums mit einer Dichte von 72 % unter die Zellen, achten Sie darauf, die Schichten nicht zu stören, und trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Die Immunzellen werden sich an der Grenzfläche befinden. Entfernen Sie die oberste gelbliche Schicht mit Zelltrümmern und erhöhen Sie das Volumen dann mit kaltem PBS auf 15 Milliliter.

Gut schütteln, um den Gradienten aufzubrechen, und dann die Zellen durch Zentrifugation waschen. Um die Immunzellen der Aorta zu isolieren, wird die Aorta in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter frisch zubereiteter Aorta-Verdauungslösung auf Eis überführt und mit einer feinen Schere die ganze Aorta in feine Stücke zerkleinert. Dann inkubieren Sie die Fragmente bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten kontinuierliche Rotation.

Am Ende des Aufschlusses fügen Sie kaltes RPMI, ergänzt mit 5 % FBS, mit dem fünffachen Volumen der Aufschlusslösung hinzu und filtrieren Sie die resultierende Gewebeaufschlämmung durch ein 40-Mikron-Sieb. Sammeln Sie dann die einzellige Suspension durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in frischem RPMI mit FBS. Um eine einzellige Suspension aus den aortendrainierenden Lymphknoten zu erzeugen, übertragen Sie die Lymphknoten auf ein 40-Mikron-Sieb in einer 60 x 15 Millimeter großen Gewebekulturschale und verwenden Sie einen Ein-Milliliter-Spritzenkolben, um das Gewebe zu disaggregieren.

Spülen Sie dann das Sieb mit zwei Millilitern RPMI plus FBS und überführen Sie die freigesetzten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Um die Zellen zu stimulieren, stellen Sie zunächst jede Zellsuspension auf eine einmal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter Konzentration im Zellkulturmedium ein. Geben Sie dann zwei Mikroliter des Zellaktivierungscocktails zu jeder Zellgruppe für jeden Milliliter Medium.

Als nächstes werden ein- bis zweimal 10 bis zur sechsten Aorten- oder Nierenzelle pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte und ein- bis zweimal 10 bis zur sechsten Lymphknotenzellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte übertragen. Legen Sie die Platten für drei Stunden in einen 37 Grad Celsius feuchten Kohlendioxid-Inkubator. Anschließend werden die Zellen in die entsprechenden Polystyrol-FACS-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation pelletiert.

Nachdem die Zellen zweimal mit frischem FACS-Puffer unter den gleichen Zentrifugenbedingungen gewaschen wurden, blockieren Sie die Bindung an die unspezifische Oberfläche mit FC und waschen Sie die Zellen in PBS. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter frischem PBS und färben Sie die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt mit einem Mikroliter eines zellundurchlässigen Amin-reaktiven Viabilitätsflecks. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen noch zwei Mal in ein bis zwei Millilitern FACS-Puffer und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern des entsprechenden Antikörper-Cocktails zur Zelloberflächenfärbung.

Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius und vor Licht geschützt zwei weitere Male in zwei Millilitern frischem FACS-Puffer und fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit einem Fixierungs- und Permeabilisierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Markieren Sie anschließend die Zellen mit dem intrazellulären Antikörpercocktail von Interesse und waschen Sie die Zellen erneut in FACS-Puffer. Für die durchflusszytometrische Analyse der stimulierten intrazellulären Zytokinproduktion führen Sie zuerst die ungefärbten und einfach gefärbten Kontrollröhrchen aus, um die spektrale Überlappung auszugleichen, gefolgt von den Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen für jedes Fluorophor im Panel.

Wenn die grundlegenden Parameter für die Fluoreszenzanalyse eingestellt wurden, verwenden Sie ein Vorwärts-nach-Seite-Streuflächendiagramm, um das primäre Gate für den Nachweis der Leukozytenpopulation festzulegen, gefolgt von einem Gating, um die toten Zellen entsprechend ihrer mangelnden Expression der Lebensfähigkeitsfärbung auszuschließen. Plotten Sie die vordere Streufläche gegen die vordere Streuhöhe und das Tor, um die Dubletten auszuschließen. Die Leukozyten können dann an ihrer CD45-Expression identifiziert werden.

Um das Vorhandensein von IL-17A- oder IL-17F-produzierenden T-Zellen mit der murinen Niere oder Aorta zu bestimmen, können Einzelzellsuspensionen, wie gerade gezeigt, für die Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollanalyse jedes Zytokins hergestellt werden. Wie erwartet sind nur sehr wenige Zellen positiv für IL-17A oder IL-17F in den Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen, was die genaue Unterscheidung von positiven und negativen Signalen ermöglicht, um die Gates für die Identifizierung von IL-17A- oder IL-17F-positiven Zellen in den experimentellen Proben richtig einzustellen. Die repräsentative intrazelluläre Färbung von T-Zellen, die aus der Niere und der Aorta von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden und mit Vehikel oder Angiotensin II infundiert wurden, zeigt das Vorhandensein einer Untergruppe von IL-17A- oder IL-17F-exprimierenden T-Zellen in beiden Geweben.

Darüber hinaus zeigt die intrazelluläre Färbung von T-Zellen aus den aortendrainierenden Lymphknoten, dass CD8-positive T-Zellen nach Angiotensin-II-Stimulation Interferon gamma und T-bet exprimieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis neun Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der zu verarbeitenden Gewebe. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell und effizient zu arbeiten, um den Zelltod zu minimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzellsuspensionen aus der Niere, der Aorta und den Lymphknoten der Maus erzeugt und Immunzelluntergruppen aus diesen Organen charakterisiert und quantifiziert. Diese Technik ermöglicht es der kardiovaskulären und renalen Physiologie, die Veränderungen in Immunzellpopulationen zu untersuchen, die zu Bluthochdruck und anderen entzündungsfördernden Erkrankungen beitragen können.