Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Dieses Protokoll zeigt, wie die iCRISPR-Plattform für die schnelle Genom-Editierung in hPS-Zellen etabliert wird und wie genom-editierte Linien mit hPS-gesteuerter Pankreasdifferenzierung integriert werden können, um die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der menschlichen Pankreasentwicklung zu beantworten, wie z. B. die genetische Kontrolle der normalen Bauchspeicheldrüsenentwicklung und die molekularen Grundlagen von Diabetes. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie es uns ermöglichen, Gene, die für hPS-Zellen von Interesse sind, effizient zu modifizieren und diese modifizierten Zelllinien für Studien der menschlichen Pankreasentwicklung und -erkrankung in vitro zu verwenden.

Kultivieren Sie hPSCs unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen auf abgeschnittenen, mit Vitronektin überzogenen Schalen für humane Menschen. Am Tag vor der Elektroporation während des Medienwechsels 10 mikromolare ROCK-Inhibitoren zugeben. Bereiten Sie am Tag der Elektroporation im Voraus mit vitronektinbeschichtete 10-Zentimeter-Gerichte zu.

Entfernen Sie dann das Kulturmedium von den Zellen, waschen Sie es einmal mit PBS ohne Kalzium und Magnesium und behandeln Sie die Zellen dann etwa drei Minuten lang mit einem 1-fachen Dissoziationsreagenz bei 37 Grad Celsius. Als nächstes aspirieren Sie das Dissoziationsreagenz, bevor sich die Zellen abgelöst haben, und fügen Sie 10,5 Milliliter vollständiges Medium hinzu. Verwenden Sie vorsichtiges Pipettieren, um eine einzellige Suspension zu bilden, bevor Sie sie in Zentrifugenröhrchen übertragen.

Führen Sie eine Zellzählung von 500 Mikrolitern Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler durch. Pelletieren Sie dann die hPSCs fünf Minuten lang bei 200 mal G. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem PBS bei 12,5 mal 10 bis den sechsten Zellen pro Milliliter und aliquotieren Sie in Volumina von 800 Mikrolitern.

Die Plasmide in jede 800-Mikroliter-hPSC-Suspension geben und gut mischen. Füllen Sie die Mischung in eine 0,4 Zentimeter große Elektroporationsküvette und lassen Sie sie etwa fünf Minuten lang auf Eis. Elektropopolieren Sie die Zellen mit einem Elektroporationssystem bei 250 Volt und 500 Mikrofarad.

Es ist wichtig, gesunde und proliferierende hPS-Zellen für die Genom-Editierung zu verwenden. Nach der Elektroporation werden die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern vorgewärmtem, vollständigem Medium überführt und dann pelletiert. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren und plättieren Sie eins mal 10 auf die sechste, 2,5 mal 10 auf die sechste und fünfmal 10 auf die sechste Zelle von jeder Elektroporation auf vitronektinbeschichtete Schalen, so dass mindestens eine der Platten genügend Einzelzellkolonien für die Entnahme aufweist.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Beginnen Sie am zweiten Tag mit der Neomycin-Auswahl, indem Sie Medium mit 500 Mikrogramm G418-Sulfat pro Milliliter hinzufügen. Beginnen Sie am sechsten Tag mit der Puromycin-Auswahl, indem Sie Medium hinzufügen, das ein Mikrogramm pro Milliliter Puromycin-Dihydrochlorid enthält.

An den Tagen 10 bis 12 erreichen die einzelligen hPSC-Kolonien einen Durchmesser von ein bis zwei Millimetern. Entnehmen Sie zu diesem Zeitpunkt 12 bis 24 Kolonien unter einem Stereomikroskop. Disaggregieren Sie die hPSC-Kolonien mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mechanisch in kleine Stücke und übertragen Sie die Zellen direkt in vitronektinbeschichtete 24-Well-Platten.

24 Stunden vor der Transfektion der Guide-RNA ist iCas9 hPSCs mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin zu behandeln. Bereiten Sie am Tag der Transfektion vitronektinbeschichtete 24-Well-Platten vor und dissoziieren Sie die iCas9-Zellen wie zuvor mit dem 1X-Dissoziationsreagenz in Einzelzellen. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten und resuspendieren die Zellen bei 0,5 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter in vollständigem Medium, ergänzt mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitor.

Platten 500 Mikroliter der resuspendierten Zellen in einzelne Vertiefungen der 24-Well-Platte. Für jede Leit-RNA werden die folgenden Transfektionsmischungen hergestellt. Mischen Sie A, 50 Mikroliter reduziertes Serummedium plus einen Mikroliter Guide-RNA.

Mischen Sie B, 50 Mikroliter reduziertes Serummedium plus drei Mikroliter Transfektionsreagenz. Mischung A und B zu einer 100-Mikroliter-Mischung kombinieren und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 50 Mikroliter der Mischung zu den Zellen in den doppelten Vertiefungen der 24-Well-Platte und mischen Sie sie gut.

Nach vier Tagen extrahieren Sie genomische DNA, amplifizieren Sie die Zielregionen, die die Targeting-Sequenzen der Guide-RNA flankieren, und schätzen Sie die Editierungseffizienz mithilfe des T7E1-Verdaus. Beginnen Sie mit der Differenzierung der hPS-Linien, wenn die Zellen zwei Tage nach der Aussaat eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Fügen Sie Differenzierung Tag Null Medium hinzu und wechseln Sie dann täglich das Medium mit den hier gezeigten Formeln.

Untersuchen Sie an Tag 10 die späteren Pankreas-Vorläufer PP2-Marker, PDX1 und NKX6.1, durch Immunfluoreszenzfärbung einer Untergruppe der Zellen. Fahren Sie dann mit der Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur fort, indem Sie die PP2-Zellen zunächst vier Stunden lang mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren behandeln. Nach Ablauf der Inkubationszeit dissoziieren Sie die Zellen wie zuvor.

Minimieren Sie die Dauer der Dissoziationsbehandlung mit Reagenzien, um das Überleben der Zellen für die Aussaat in der Phase der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche der Differenzierung zu maximieren. Aspirieren Sie das Dissoziationsreagenz, bevor sich die Zellen abgelöst haben. Geben Sie dann 10 Milliliter Boo-Lah-Medium in die Platte und dispergieren Sie die PP2-Zellen in einzelne Zellen, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren.

Sammeln Sie die einzellige Suspension. Zählen Sie die Zellzahl und pelletieren Sie die Zellen. Nach der Resuspendierung des Zellpellets in S5-Differenzierungsmedium werden fünf bis 10 Mikroliter Zellen pro Spot auf einen Transwell-Einsatzfilter aufgetüllt.

Geben Sie S5-Medium auf den Boden jedes Transwell-Einsatzes und inkubieren Sie mit dem Medienwechsel, bis endokrine Marker der Bauchspeicheldrüse durch Immunfluoreszenzfärbung nachweisbar sind. Diese Abbildung zeigt die iCRISPR-vermittelte nicht-homologe Endverbindung in hPSCs. Der Gen-Knockout ist hocheffizient, da kein Selektionsprozess stattfindet und 20 % bis 50 % biallelische Mutanten leicht erreicht werden können.

Für effiziente und präzise genetische Veränderungen werden Guide-RNAs mit einem einzelsträngigen DNA-Donor kotransfiziert, der die spezifische Sequenzveränderung trägt, die in Rot dargestellt ist. Um ein erneutes Schneiden in modifizierten Allelen zu verhindern, wird häufig empfohlen, eine stille Mutation in die PAM-Sequenz aufzunehmen, die hier grün dargestellt ist. Mit diesem System können ca. 10% der Klone, die die gewünschte homologiegesteuerte reparaturvermittelte Genommodifikation tragen, ohne zusätzliche Veränderungen in beiden Allelen erreicht werden.

Einmal gemeistert, dauert es weniger als zwei Monate, um eine neue iCas9 hPSC-Linie zu etablieren. Danach kann innerhalb von ein bis zwei Monaten eine Vielzahl von hPSC-mutierten Kolonielinien erzeugt werden. Nach der Generierung genetischer hPSC-Mutantenlinien ermöglicht uns die schrittweise Differenzierung der mutierten Zelllinien in pankreatische Beta-ähnliche Zellen in vitro, die spezifischen Entwicklungsschritte zu untersuchen, die von diesen Mutationen betroffen sind, was ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen ermöglicht.