Name: Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit der iCRISPR-Plattform hPSCs genomeditieren und in pankreatische Vorläuferzellen differenzieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Kontrollmechanismen bei der menschlichen Pankreasentwicklung und Diabetes.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH / NIDDK (R01DK096239) und New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156) gefördert. ZZ wurde von der NYSTEM Postdoc-Stipendium aus dem Zentrum für Stammzellbiologie des Sloan Kettering Institute unterstützt.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>González, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iCRISPR+Platform+for+Rapid%2C+Multiplexable%2C+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li>
<li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , in press (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zeit Überlegungen zur Erzeugung von Mutantenlinien Obwohl die jüngsten Ansätze auf Basis von CRISPR / Cas-Systeme für die Genom Bearbeitung zur erfolgreichen Ausrichtung geführt haben, ein wirksamer und universelle Plattform würde für größere Analysen von Genfunktionen vorzuziehen. Die iCRISPR Plattform bietet eine schnelle und effiziente Methode Mutationen zu jedem Gen von Interesse 5, 9 einzuführen. Erstens erlaubt die PCR-basierte gRNA Syntheseverfahren die Herstellung von Hunderten von gRNAs in Array-Format an einem Tag ohne die zeitraubende Klonierungsschritte. Zweitens mit Doxycyclin-induzierbaren Expression in Cas9 iCas9 hPSCs erfordert der Schritt, der eine gRNA Transfektion nur eine minimale Menge an Arbeit, und somit können mehrere gRNA Targeting-Experimente gleichzeitig durchgeführt werden. Drittens, aufgrund der hohen Wirkungsgrade erreichbar Targeting mit unserem System die Analyse von ~ 24 bis 48 Kolonien pro gRNA sollte transfiziert ausr seiniziente mehrere monoallelic und biallelic Mutantenlinien für ein einzelnes Gen zu schaffen, obwohl die Effizienz auf dem Zielort variieren. Da es mechanisch für eine ausgebildete Person möglich ist, zu 384 Kolonien Pick (4 x 96-Well-Platten) in einer Sitzung, die sollte nehmen ~ 4 h unter einem Binokular kann eine ausgebildete Person zu erwarten Mutantenlinien zu erzeugen, innerhalb beeinflussen 12 Gene 12 Monate. Die schlanke Generation von HPSC Mutanten in kurzer Zeit ermöglicht die systematische Analyse einer Reihe von Transkriptionsfaktoren und / oder Signalwegs - Komponenten , die miteinander in Wechselwirkung treten, den Entwicklungsprozess regulieren 9. Zusätzlich öffnet effiziente Multiplex-Gen-Targeting auch die Tür genetischen Interaktionen zugrunde liegenden komplexen menschlichen Eigenschaften zu untersuchen. Die Erzeugung von Precise Genveränderungen Die Ableitung von patientenspezifischen iPS-Zellen aus leicht zugänglichen somatischen Zelltyp<html> s und die Differenzierung in krankheitsrelevanten Zelltypen bieten eine große Chance für die funktionale Validierung von krankheitsassoziierten Mutationen. Aufgrund der beträchtlichen Variabilität der genetischen Hintergrund zwischen Individuen, direkte Vergleiche zwischen iPSCs von Patienten und von gesunden Spendern kann nicht zulassen, dass eine Krankheit Phänotypen von Hintergrundeffekten zu unterscheiden. Daher ist es notwendig , durch eine Korrektur der Krankheitsmutation zurück in die Wildtyp - Sequenz isogenen Kontrolle iPSCs zu erzeugen oder die Patienten-spezifischen Mutationen in einem Wildtyp HPSC Hintergrund vorstellen, wie 26 andere 25, vorgeschlagen. Neben loss-of-function (null) Mutationen, kann man nun genauer Krankheitsmechanismen durch die Einführung eines Patienten-spezifischen Sequenzveränderungen in den endogenen Lokus in hPSCs einschließlich hypermorphic, hypomorphen, neomorphe oder dominant-negative Patienten sezieren Mutationen. ntent &quot;&gt; Precise genetische Modifikation HDR beschäftigt für DSB-Reparatur in Gegenwart eines Reparaturschablone. Da es viel weniger effizient als NHEJ-vermittelter DNA-Reparatur ist ein Donorplasmid die patientenspezifische Mutation, eine Arzneimittelselektionskassette, und Homologiearme enthalten, zuvor wurde als Reparaturschablone 2 verwendet. nach der Medikamentenauswahl und Überprüfung der patientenspezifischen Mutation in einem zweiten Schritt wird im allgemeinen benötigt , um die Arzneimittelselektionskassette zu entfernen. Während das am häufigsten verwendete Cre-loxP und FLP-FRT - Systeme hinterlassen Restsequenz in den endogenen Lokus, die Verwendung von piggyBac Transposon wurde zur nahtlosen Entfernung der Arzneimittelselektionskassette erlaubt 27. in neuerer Zeit haben kurze ssDNA templates auch effizient HDR zu unterstützen mit technisch DNA - Endonukleasen 28 gezeigt. im Vergleich zu einem Donorplasmid können ssDNA direkt synthetisiert werden und umgeht so die zeitraub Klonierungsschritt. Hier hat es sein,dass de gezeigt durch Cotransfektion gRNA und eine ssDNA Vorlage Homologie gerichtete Reparatur zu induzieren, können iCRISPR verwendet werden, um spezifische Nukleotidmodifikationen mit hoher Effizienz einzuführen. Dies ist wichtig, nicht nur für die Rolle der essentiellen Nukleotide innerhalb Protein funktionellen Domänen sezieren, aber auch menschliche Krankheit Mutationen zur Modellierung und möglicherweise diese krankheitsassoziierten Mutationen für die therapeutische Intervention zu korrigieren. Aufgrund der großen Anzahl von Suszeptibilitätsloci, die jeweils mit mehreren Sequenzvarianten sind, komplex und multigene Krankheiten wie Diabetes Modellierung ist eine Herausforderung für Genetiker gewesen. Da die iCRISPR Plattform für die schnelle Erzeugung einer allelischen Serie oder für Gen-Targeting multiplex permissive ist, kann es die Untersuchung mehrerer krankheitsassoziierter loci erleichtern entweder einzeln oder in Kombination mit isogenen Hintergründen. Targeting Effizienzen und Off-Target-Effekte Wir haben<html> eine gute Korrelation zwischen dem T7E1 und RFLP Untersuchungsergebnisse und der Anzahl der Mutantenlinien gefunden durch Sequenzierung identifiziert. Dies unterstreicht die Bedeutung dieser Tests parallel mit der Einrichtung von klonalen Linien durchführen. Während die Zielwirkungsgrade in Abhängigkeit von der genomischen Loci variieren kann erreicht werden , in den meisten Ein-Gen-Targeting - Experimente, 20-60% der Klone mit beide Allele mutiert gefunden wurden (einschließlich in-frame und Rasterverschiebungsmutationen) 9. In Fällen , in denen Multiplex - Gen - Targeting durchgeführt wurde, Dreier- biallelic mutierten Klone mit 5-10% Wirkungsgrad wurden 5 erhalten. ssDNA-vermittelte HDR mehrerer Gene wurden auch genaue genetische Veränderungen durchgeführt zu erhalten, mit der Effizienz des Erhaltens homozygote Knock-in - Klone im Bereich von 1 5 - 10%. Arbeiten mit CRISPR / Cas in hPSCs, alle Mutationen in potenziellen Off-Target-Sites, die sind noch nicht die gleiche gRNA Zielsequenz teilen zu erfasselass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Whole-Genom - Sequenzierung in einer kürzlich durchgeführte Studie hat es versäumt , auch erhebliche Off-Target - Mutationen in klonalen HPSC Linien zu identifizieren , erzeugt unter Verwendung von CRISPR / Cas 29. Trotzdem jede mögliche Wirkung von Verwechselung Phänotypen durch Mutationen an Off-Target-Effekt Stellen eingeführt zu minimieren, wird vorgeschlagen, mindestens zwei unabhängige gRNAs Targeting verschiedenen Sequenzen innerhalb des gleichen Gens unter Verwendung unabhängiger Mutantenlinien zu erzeugen. Ähnlich wie in mehreren Linien beobachteten Phänotypen erzeugt unterschiedliche gRNAs mit könnte die Möglichkeit ausschließen, vor allem, dass der Phänotyp von einem Off-Target-Effekt kommt. Feeder-abhängige gegen unabhängige Kultur und Targeting Herkömmliche Methoden zur HPSC Kultur beinhalten ihre Wartung und Erweiterung auf Feeder-Zellen in Medien, die Serum oder Serumersatz, der tierische prod enthältdukten, wie Rinderserumalbumin. Feeder-Zellen, Serum, Serum-Ersatz, und alle Albumin enthalten komplexe, nicht definierten Komponenten und zeigen erhebliche Chargenvariabilität. Die Anpassung an die Feederfrei und chemisch definierten Zustand erheblich reduziert den Aufwand für die HPSC Wartung und, was noch wichtiger ist, die Konsistenz der Differenzierungsexperimente erhöht. Derzeit gibt es nur sehr wenige Studien , die Genombearbeitungsverfahren auf hPSCs kultiviert in vollständig definierten Kulturbedingungen 30 beschreiben. Wir haben höhere CRISPR gefunden Effizienzen bei gRNA Transfektion und klonalen Ablagerung Targeting in Feeder freien Bedingungen durchgeführt wurden, im Vergleich zu Feeder-abhängige Kulturbedingungen. Wir glauben, dass dies zu einem erhöhten Überleben der Zelle nach der Transfektion durch und Einzelzellaussaat für die Koloniebildung. Außerdem haben Nährzellen zuvor gezeigt worden, Transfektionsreagenzien zu maskieren, wodurch die Transfektionseffizienz zu senken. VereinigungGenome Editing mit gerichteten Differenzierung Vorherige Differenzierungs Protokolle nur einen geringen Anteil an Insulin-positive Zellen ergab, von denen die meisten waren polyhormonal und ähnelten fötalen endokrinen Zellen 23. Die jüngsten Fortschritte hat die Differenzierung von hPSCs in reiferen auf Glucose reagierenden Beta-ähnlichen Zellen erlaubt 16, 17, 19, 20. Wir können routinemäßig mindestens 75% endgültige Entodermzellen, 40% PDX1 + NKX6.1 + Pankreas - Vorläufern, und rund 20% NKX6.1 + CPEP + Glukose-responsive Beta-ähnliche Zellen erhalten 9 HUES8 hPSCs verwenden. Wenn es mit dem iCRISPR Genom Editing-System kombiniert, das robustere Differenzierung Protokoll hat die Analyse von Transkriptionsfaktoren erleichtert, die auf die Differenzierung Pankreas-Vorläufer und endokrine Stadien der Pankreas entscheidend sind. Dadurch wirdes möglich, in zukünftigen Studien, eine große Anzahl von Kandidatenkrankheitsgene für die funktionelle Überprüfung und Untersuchung der Mechanismen zu untersuchen , die 9 - Diabetes zu Grunde liegen. Zukünftige Anwendungen oder Wegbeschreibungen Unser iCRISPR System die Erzeugung komplexer genomischer Veränderungen, wie zum Beispiel die Schaffung von Reporter - Allele durch HDR-vermittelte Gen - Targeting mit langen Spender - DNA - Matrizen - Codierung Protein - Tags oder fluoreszierenden Reporter können erleichtern 12. Wir haben gezeigt, dass aufgrund des hohen Wirkungsgrade erreicht CRISPR im System Targeting kann dieser Prozess in hPSCs durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit für weitere Wirkstoffselektion 12. Weiterhin kann Targeting gemultiplexten Gen verwendet werden , um genetische Wechselwirkungen zugrunde liegenden komplexen menschlichen Erkrankung zu untersuchen, wie in unserer Studie gezeigt, die wir 31 ist das erste Beispiel für eine solche Arbeit glauben. iCRISPR kann auch durch die Schaffung von Löschungen regulatorischen Kontrolle zu verstehen Gen verwendet werden, entweder in nicht-kodierenden RNAs oder in der Gen-regulatorische Regionen wie Promotoren und Enhancer. Um effizient zu erzeugen regulatorische Mutanten unter Verwendung iCRISPR kann gRNAs werden entwickelt, um die Bindungsstelle eines DNA-bindenden Proteins zu stören, einschließlich, aber nicht auf die basale Transkriptionsmaschinerie oder eines gewebespezifischen Transkriptionsfaktor beschränkt. ssDNA template-vermittelte HDR kann auch zu mutieren spezifische Protein-Bindungsstellen verwendet werden. Schließlich sehen wir , dass eine weitere Optimierung der Nutzung der iCRISPR Plattform in hPSCs für höheren Durchsatz genetische Analysen von Pluripotenz Phänotypen oder Krankheitsphänotypen ermöglichen würde , wenn sie mit einem in vitro Differenzierung Protokoll kombiniert. Diese iCRISPR-vermittelte Studien können für die schnellere Identifizierung von Kandidatenkrankheitsassoziierten Genen und Studien über ihre funktionelle Bedeutung ermöglichen.

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die Fähigkeit, sowohl selbst erneuern und verursachen alle Derivate der drei embryonalen Keimlinien. Sie bieten eine wertvolle Ressource für die Zell-Ersatz-Therapie und Krankheitsmodelle, indem sie als einzigartige Plattform dient, zelluläre Prozesse in einem menschlichen Entwicklungskontext zu rekapitulieren. Sie sind auch eine Quelle von Versuchszellen für skalierbare, Hochdurchsatz-Analyse. Jedoch wurden Fortschritte aufgrund von zwei wesentlichen Herausforderungen beschränkt: den Mangel an effizienten genetischen Modifikation Werkzeuge und die Schwierigkeit, in die komplexen embryonalen Entwicklungsschritte in einer Kulturschale zu rekapitulieren. Genetische Veränderung ist ein unverzichtbares Werkzeug Genfunktion in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Während jedoch die klassische Gen Ansätze durch homologe Rekombination gezielt bewährt haben ein mächtiges Werkzeug zu sezieren Genfunktion in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) 1, dieser Ansatz zu seinwar äußerst ineffizient , wenn 3 bis hPSCs 2, angewendet. Die jüngste flotten Beitritt von programmierbaren, ortsspezifische Nukleasen von der Natur zu den Laboreinsatz, einschließlich Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs), Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) und den Cluster regelmäßig kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) voneinander beabstandete / CRISPR-assoziierten (Cas) -Systeme 4, bedeutet , dass Genomtechnik eine viel einfachere Aufgabe , in einem breiten Spektrum von Organismen und Zelllinien geworden ist, einschließlich in hPSCs. Diese Gen-Editing-Tools nutzen die Tatsache, dass chimären Nukleasen wie die Cas9 Endonuklease eine ganze Reihe von genetischen Veränderungen durch Induktion Doppelstrangbrüche (DSBs) an genauen Stellen erlauben kann, die Auslösung der endogenen DNA-Reparatur-Maschinen zu aktivieren entweder nicht-homologe Ende Beitritt (NHEJ) oder Homologie gerichtete Reparatur (HDR). Beide Mechanismen können durch Induzieren eith zur genetischen Manipulation ausnutzener zufällige Insertion und Deletionsmutationen (indels; über NHEJ), Frameshift - Mutationen zu erzeugen , die Gen - Allele zunichte machen, oder präzise Nukleotidsubstitutionen (via HDR), Patienten Mutationen für die menschliche Krankheitsmodelle zu rekapitulieren oder eine krankheitsverursachende Mutation für die Gentherapie zu korrigieren . CRISPR / Cas-vermittelte Genomtechnik erfordert zwei Komponenten: die Konstante RNA-gesteuerte Cas9 Endonuklease, die für DNA-Spaltung und einer variablen CRISPR RNA (crRNA) und trans-Aktivierung (tracrRNA) Duplex-DNA, die Zielerkennung angibt. Die crRNA / tracrRNA Duplex kann mit einem einzigen chimären Führung RNA (gRNA) ersetzt werden, die gefunden wurden , effizienter 5, 6, 7 zu arbeiten. Während die CRISPR / Cas9 System hat zu den meisten experimentellen Organismen und Zelllinien angepasst worden ist, ändert sich die Lieferung und die Expression von Cas9 und gRNA signifikant und werden muss, weiter zu Achi optimiertVorabend effiziente Genom Bearbeitung in vielen Systemen, einschließlich hPSCs 8. Eine effiziente Genom-Editing - Plattform, iCRISPR wurde 5 in hPSCs etabliert. In diesem System wird ein TALEN-vermittelte Ansatz verwendet wurde , in trans, ein Allel mit einem Reverse - Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator (M2rtTA) und die andere mit einem Tetracyclin - Response - Element beide Allele des &quot;Transgen sicheren Hafen locus&quot; AAVS1 Ziel (TRE ) in den hPSCs die Expression von Cas9 (iCas9) fahren. In etablierten Klonlinien (iCas9 hPSCs) wird Cas9 hoch mit Doxycyclin Behandlung ausgedrückt. Inzwischen aufgrund seiner geringen Größe (100 nt), können einzelne oder mehrere gRNAs leicht in iCas9 hPSCs mit hohem Wirkungsgrad geliefert werden und Cas9 für die ortsspezifische Spaltung anweisen kann, eine effiziente NHEJ-vermittelten Gen-Unterbrechung sowie HDR-vermittelte genaue Nucleotid Modifikationen in Gegenwart von kurzen einsträngigen DNA (ssDNA) Donator-Vorlagen. Das iCRISPR System kannverwendet , um erfolgreich erzeugen eine Gruppe von krankheits nachahmt HPSC Linien mit biallelic (homozygot oder heterozygot) oder heterozygot loss-of-function Mutationen in wichtigen Entwicklungsgene 5, 9. Während eine Anzahl von Gruppen effiziente Gen Bearbeitung unter Verwendung CRISPR / Cas in hPSCs berichtet haben, bleibt der Erfolg auf eine kleine Anzahl von technologisch Adept Laboratorien beschränkt. Die iCRISPR Plattform bietet eine effiziente und dennoch einfache Lösung für Routine - Gen Bearbeitung von Forschern unterschiedlicher Schwierigkeitsstufen, und es wurde bereits in einer Reihe von veröffentlichten Studien von unserer Gruppe und andere 9, 10, 11, 12 verwendet. Dieser Ansatz wurde auch erweitert weiter induzierbaren silencing basierend auf der Expression von dCas9-KRAB 13. Zusammen mit dem Fortschritt in der Genombearbeitung Technologie, haben erhebliche Verbesserungen auch in HPSC Wartung und gerichtet Differenzierung erreicht. Die Kulturbedingungen für hPSCs haben aus bestrahlten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) Feeder abhängig Feeder freien Bedingungen auf definierte extrazellulären Matrixkomponenten entwickelt und von komplexen Medien Formulierungen chemisch Medium Bedingungen 14 definiert. Derartige Verbesserungen haben die Variabilität in hPSCs aufgrund von Charge zu Charge unterschiedliche Imef Vorbereitung und knockout Serumersatzkomponenten reduziert und somit eine reproduzierbare Umgebung für HPSC Differenzierung bereitzustellen. Inzwischen verbesserte Kenntnis der Signalwege menschlichen embryonalen Entwicklung , die Errichtung sowie Entdeckungen von Hochdurchsatz - Wirkstoffscreenings, haben dazu geführt , zu einer verbesserten Differenzierung Protokolle 15, 16, 17, 18. Diese Protokolle mehr imitieren eng in vivo Entwicklungsschritte und Zelltypen zu erzeugen , die eng ihre in - vivo - Pendants rekapitulieren. Für HPSC Differenzierung in den Pankreas Abstammung, anfängliche Protokolle nachgeahmt frühen Pankreasentwicklung relativ gut, aber schließlich polyhormonal β-Zellen erzeugt, die von unreifen fetalen Phänotypen waren und reagiert schlecht auf die Glukose-Stimulation. Jüngsten Fortschritte 16, 17, 19, 20 sind für die Erzeugung von Glukose-responsive pankreatischen β-ähnlichen Zellen erlaubt, die es uns ermöglichen, spätere Ereignisse zu untersuchen, wie die Bildung und die weitere Reifung von monohormonal β - Zellen. Hier stellen wir detailliert die Anwendung von Genom-modifizierten Zeilen für die Untersuchung der Pankreasentwicklung durch die iCRISPR System kombiniert mit der HPSC basierten in vitro Differenzierung in Richtung Plattform Glukose-responsive pancreatic β-ähnliche Zellen. Diese Kopplung von leistungsfähigen Genom - Editing - Tools mit einer verbesserten HPSC Differenzierung Protokoll bietet nicht nur die Geschwindigkeit und das Ausmaß notwendig , um die wachsende Nachfrage nach Validierung Krankheit Kausalität gerecht zu werden, sondern ermöglicht auch anspruchsvolle genetische Manipulationen für weitere mechanistische Untersuchungen zur Transkriptionskontrolle zugrunde liegenden normalen Entwicklung und Krankheit 9 .

<table><tbody><tr><td>Chemisch definiertes Medium (E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 Basalmedium und Essential 8 Supplement enthalten</td></tr><tr><td>Verkürzte rekombinante menschliche Form von Vitronektin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationsreagenz (TrypLE Select Enzym)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, tierischen Ursprungs frei, rekombinantes Enzym</td></tr><tr><td>G418 Sulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Selektives Antibiotikum</td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromycin Selektive antibiotische</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>PCR-Kit</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Transkriptions-Reinigungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin-Hyclat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Blut & Tissue Kit</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Genomisches DNA-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Maßgeschneidert mit einer veröffentlichten Formulierung (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>L-Glutamin-Ergänzung (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>fettsäurefrei</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>GSK-3-Hemmer</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Vitamin C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Hedgehog-Inhibitor</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Retinsäure</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>BMP-Inhibitor</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt-Antagonist&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>PKC Aktivator</td></tr><tr><td>3,3',5-Trijod-L-thyronin (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 Inhibitor II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>Gamma Sekretase Inhibitor XX, NOTCH Signalinhibitor</td></tr><tr><td>N-Cys (N-Acetyl Cystein)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>Vitamin E Analogon</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>AXL Rezeptor Tyrosinkinase Inhibitor</td></tr><tr><td>24 mm Transwell mit Einsatz</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporationssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Elektroporationsküvetten</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuklease I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Puffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Long Oligonukleotid</td><td>Eton Bioscience oder IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 Antikörper</td><td>F& Technik D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 Antikörper</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 Antikörper</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Insulin Antikörper</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>C-Peptid Antikörper</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Glucagon-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1.000</td></tr></tbody></table>

genome editing und gerichteten differenzierung von hpscs zur abfrage lineage bestimmungsfaktoren im bereich human pancreatic entwicklung

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Abfrage Genfunktion in sich selbst erneuernden oder humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) Differenzierung bietet eine wertvolle Plattform in Richtung der menschlichen Entwicklung zu verstehen und Mechanismen Krankheit in einer Schale zu sezieren. Um dieses Potenzial Anwendung nutzen erfordert effiziente Genom-Editing - Tools HPSC Mutanten in krankheitsassoziierten Genen, sowie in - vitro - HPSC Differenzierung Protokolle krankheitsrelevanten Zelltypen produzieren , die eng rekapitulieren ihre in - vivo - Pendants zu erzeugen. Eine effiziente Genom-Editing - Plattform für hPSCs namens iCRISPR wurde durch die TALEN-vermittelte Targeting einer Cas9 Expressionskassette im AAVS1 Locus entwickelt. Hierbei sind die Protokolle für die Erzeugung von induzierbaren Cas9 HPSC Linien Zellen kultiviert in einem chemisch definierten Medium und einem Zubringer freien Zustand verwenden beschrieben. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des iCRISPR System für Gen-Knockout oder präzise genetische Veränderungen in hPSCs, entweder durch nauf homologe Ende (NHEJ) oder über präzise Nukleotidveränderungen Verbinden einer Homologie gerichteten Reparatur (HDR) Vorlage jeweils enthalten sind. Diese technischen Verfahren sind Beschreibungen der Konstruktion, Produktion, und die Transfektion von CRISPR Führung RNAs (gRNAs); die Messung der Geschwindigkeit CRISPR Mutation durch T7E1 oder RFLP-Tests; und die Etablierung und Validierung von klonalen Mutantenlinien. Schließlich haben wir Chronik Verfahren zur HPSC Differenzierung in Glukose-responsive Pankreas - β-ähnliche Zellen durch in - vivo - Pankreas - Embryonalentwicklung nachahmt. iCRISPR Technologie mit gerichtetem HPSC Differenzierung Kombination ermöglicht die systematische Untersuchung von Genfunktionen unser Verständnis von Pankreas-Entwicklung und Diabetes Krankheitsmechanismen zu fördern.

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Dieses Protokoll zeigt, wie man die iCRISPR-Plattform für eine schnelle Genomeditierung in hPSCs etabliert und wie genomeditierte Zelllinien mit der von hPSCs abgeleiteten Pankreasdifferenzierung kombiniert, um die menschliche Pankreasentwicklung und Pankreaserkrankungen zu untersuchen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der menschlichen Pankreasentwicklung zu beantworten, beispielsweise die genetische Kontrolle der normalen Pankreasentwicklung sowie die molekularen Grundlagen von Diabetes. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie es uns ermöglichen, Gene von Interesse in hPSCs effizient zu verändern und diese modifizierten Zelllinien für in-vitro-Studien zur menschlichen Pankreasentwicklung und zu Pankreaserkrankungen zu nutzen.Kultivieren Sie hPSCs unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen auf mit verkürztem humanem Vitronectin beschichteten Platten. Am Tag vor der Elektroporation geben Sie während des Mediumwechsels 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor hinzu. Am Tag der Elektroporation bereiten Sie im Voraus mit Vitronectin beschichtete 10-Zentimeter-Platten vor.Entfernen Sie dann das Kulturmedium von den Zellen, waschen Sie einmal mit PBS ohne Calcium und Magnesium und behandeln Sie die Zellen anschließend mit 1X Dissoziationsreagenz bei 37 Grad Celsius für etwa drei Minuten. Danach saugen Sie das Dissoziationsreagenz ab, bevor sich die Zellen gelöst haben, und geben Sie 10,5 Milliliter komplettes Medium hinzu. Verwenden Sie vorsichtiges Pipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen, bevor Sie diese in Zentrifugenröhrchen überführen.Führen Sie eine Zellzählung von 500 Mikrolitern Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler durch. Pelletieren Sie anschließend die hPSCs bei 200 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in kalter PBS bei 12,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter und portionieren Sie sie in Aliquots zu je 800 Mikrolitern.Fügen Sie die Plasmide jeder 800-Mikroliter-hPSC-Suspension hinzu und mischen Sie gründlich. Überführen Sie die Mischung in eine Elektroporationsküvette mit 0,4 cm Breite und lagern Sie sie etwa fünf Minuten auf Eis. Elektroporieren Sie die Zellen mithilfe eines Elektroporationssystems bei 250 Volt und 500 Mikrofarad. Es ist entscheidend, gesunde und proliferierende hPSCs für die Genomeditierung zu verwenden. Nach der Elektroporation überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas mit fünf Milliliter vorgewärmtem, vollständigem Medium und pelletieren anschließend die Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter vollständigem Medium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor und säen Sie jeweils eine mal 10 hoch 6, 2,5 mal 10 hoch 6 und fünf mal 10 hoch 6 Zellen jeder Elektroporation auf mit Vitronectin beschichteten Schalen aus, sodass mindestens eine der Schalen ausreichend Einzelzellkolonien zum Auswählen aufweist.Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Beginnen Sie am zweiten Tag die Neomycin-Selektion, indem Sie Medium mit 500 Mikrogramm pro Milliliter G418-Sulfat hinzufügen. Beginnen Sie am sechsten Tag die Puromycin-Selektion, indem Sie Medium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin-Dihydrochlorid hinzufügen.An den Tagen 10 bis 12 erreichen die einklonalen Kolonien der hPSC einen Durchmesser von einem bis zwei Millimetern. Zu diesem Zeitpunkt 12 bis 24 Kolonien unter einem Stereomikroskop auswählen. Die hPSC-Kolonien mechanisch mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze in kleine Stücke zerlegen und die Zellen direkt in mit Vitronectin beschichtete 24-Loch-Platten überführen.24 Stunden vor der Transfektion mit der Leit-RNA iCas9-hPSCs mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin behandeln. Am Tag der Transfektion vitronektinbeschichtete 24-Well-Platten vorbereiten und die iCas9-Zellen wie zuvor mit 1X Dissoziationsreagenz in Einzelzellen dissoziieren. Anschließend die Zellen bei 200 × g für fünf Minuten pelletieren und in komplettem Medium, ergänzt um zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin und 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor, auf eine Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren.Geben Sie 500 Mikroliter der resuspendierten Zellen in einzelne Vertiefungen der 24-Loch-Platte. Für jede Leit-RNA stellen Sie die folgenden Transfektionsgemische her. Gemisch A: 50 Mikroliter Medium mit reduziertem Serumanteil plus ein Mikroliter Leit-RNA.Mischen Sie B: 50 Mikroliter Medium mit reduziertem Serum und drei Mikroliter Transfektionsreagenz. Kombinieren Sie Gemisch A und B, um ein 100-Mikroliter-Gemisch herzustellen, und inkubieren Sie dieses fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 50 Mikroliter des Gemischs zu den Zellen in den duplizierten Vertiefungen der 24-Loch-Platte hinzu und mischen Sie gründlich. Nach vier Tagen genomische DNA extrahieren, die Zielregionen, die an die Leit-RNA-Angriffssequenzen angrenzen, per PCR amplifizieren und die Editier-Effizienz mittels T7E1-Digestion abschätzen. Beginnen Sie die Differenzierung von hPSC-Linien, wenn die Zellen zwei Tage nach der Aussaat eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Fügen Sie das Differenzierungsmedium vom Tag null hinzu und wechseln Sie anschließend täglich das Medium gemäß der hier gezeigten Formeln.Am Tag 10 untersuchen Sie mithilfe immunfluoreszenzbasierter Färbung eine Teilmenge der Zellen auf Marker für späte pankreatische Vorläuferzellen (PP2), PDX1 und NKX6.1. Danach fahren Sie mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur fort, indem Sie die PP2-Zellen zunächst vier Stunden lang mit einem ROCK-Inhibitor (10 µM) behandeln. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, lösen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben auf.Minimieren Sie die Dauer der Behandlung mit dem Dissoziationsreagenz, um die Zellüberlebensrate für die Aussaat im Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenstadium der Differenzierung zu maximieren. Aspirieren Sie das Dissoziationsreagenz, bevor sich die Zellen gelöst haben. Geben Sie dann 10 Milliliter Boo-Lah-Medium in die Platte und dispergieren Sie die PP2-Zellen durch vorsichtiges Auf- und Ab-Pipettieren in Einzelzellen.Sammeln Sie die Einzelzell-Suspension. Bestimmen Sie die Zellanzahl und pelletieren Sie die Zellen. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Zellpellets in S5-Differenzierungsmedium geben Sie fünf bis zehn Mikroliter Zellen pro Punkt auf einen Transwell-Einlegefilter.Fügen Sie S5-Medium in die Unterseite jedes Transwell-Inserts hinzu und inkubieren Sie mit Medienwechseln, bis pankreatische endokrine Marker mittels immunfluoreszenzchemischer Färbung nachweisbar sind. Diese Abbildung zeigt die iCRISPR-vermittelte nicht-homologe Endverknüpfung in hPSCs. Der Gen-Knockout ist äußerst effizient, da kein Selektionsprozess erforderlich ist, und biallele Mutationen im Bereich von 20 % bis 50 % können leicht erreicht werden.Für effiziente und präzise genetische Veränderungen werden Leit-RNAs zusammen mit einem einzelsträngigen DNA-Donor, der die spezifische Sequenzveränderung trägt (hier rot dargestellt), kotransfiziert. Um ein erneutes Schneiden in modifizierten Allelen zu verhindern, wird häufig empfohlen, eine stille Mutation in die PAM-Sequenz einzufügen, die hier grün dargestellt ist. Mit diesem System können etwa 10 % Klone erreicht werden, die die gewünschte, durch homologieabhängige Reparatur vermittelte genomische Modifikation ohne zusätzliche Veränderungen in beiden Allelen aufweisen.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, dauert es weniger als zwei Monate, um eine neue iCas9-hPSC-Linie zu etablieren. Danach können innerhalb von ein bis zwei Monaten verschiedene hPSC-Mutantenkolonie-Linien erzeugt werden. Nach der Generierung genetischer hPSC-Mutantenlinien ermöglicht die schrittweise Differenzierung der Mutantenlinien in vitro in pankreatische betaähnliche Zellen die Untersuchung spezifischer Entwicklungsstufen, die von diesen Mutationen betroffen sind, wodurch ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Krankheitsmechanismen ermöglicht wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie mit der iCRISPR-Plattform hPSCs genomeditieren und in pankreatische Vorläuferzellen differenzieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Kontrollmechanismen bei der menschlichen Pankreasentwicklung und Diabetes.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung (Video) | JoVE Journal

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

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