In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, humane pluripotente Stammzellen in humane trophoblastische Zellen zu differenzieren, wobei knochenmorphogenes 4 und Inhibitoren des aktiven und nodalen Signalwegs verwendet werden, um die frühen Ereignisse der menschlichen Plazentabildung und -funktion zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der trophoblastischen Zellfunktionen und der Bildung dieser Zellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie reichlich trophoblastische Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Genetik, produzieren und Zellfunktionsassays ermöglichen kann.

Um das Experiment zu beginnen, tauen Sie ein Aliquot der extrazellulären Matrix drei bis vier Stunden lang auf Eis auf. Mit eiskalten Spitzen, einem kalten konischen 50-Milliliter-Röhrchen und dem modifizierten gleichen Medium von Dulbecco, dem DMEM F12-Medium, werden zwei Milligramm extrazelluläre Matrix in 24 Milliliter eiskaltes DMEM F12 überführt. Füllen Sie das konische 50-Milliliter-Röhrchen sofort auf Eis und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.

Um Gewebekulturplatten zu beschichten, fügen Sie einen Milliliter verdünnter extrazellulärer Matrix pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu. Schwenken Sie die Platte, um die Vertiefungen zu beschichten, und inkubieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die extrazelluläre Matrix aus der neuen Platte und fügen Sie embryonales Fibroblasten-konditioniertes Medium der Maus oder MEFCM hinzu, das bFGF enthält.

Verwenden Sie eine Pipette, um die geschabten Zellklemmen von der MEF-Platte zu übertragen und in die mit extrazellulärer Matrix beschichtete Platte zu aliquotieren. Dann die Platte inkubieren. Kratzen Sie differenzierte Zellen mit einer Pasteur-Pipette ab, bevor Sie das MEFCM täglich durch bFGF-Medium ersetzen, indem Sie zwei Milliliter Medium für eine Vertiefung verwenden.

Wenn die Kolonien unter dem Mikroskop groß und hell erscheinen, passieren die hES-Zellen alle sechs bis sieben Tage. Wenn die Feeder-freien Zellen bereit für den Durchgang sind, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen, indem Sie mit einer Pipette einen Milliliter PBS hinzufügen. Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es mit einer Pipette durch 0,5 Milligramm pro Milliliter vorgewärmte Dispase.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit PBS, indem Sie zwei Milliliter PBS pro Vertiefung hinzufügen und das PBS aspirieren. Fügen Sie einen Milliliter CM pro Vertiefung hinzu und kratzen Sie die Zellen mit der Spitze einer Fünf-Milliliter-Pipette manuell in kleine Klumpen.

Als nächstes plattieren Sie die suspendierte Zellverklumpung zu neuen, mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platten. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium vor. Verwenden Sie CM ohne bFGF und fügen Sie vor der Anwendung frische Inhibitoren hinzu.

Verwenden Sie feederfreie hES-Zellen, die auf extrazellulären Matrix-beschichteten Platten wachsen, für eine Passage, die in einem Inkubator mit 5 % Sauerstoff kultiviert werden. Lassen Sie die Zellen nach der ersten Passage auf die mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platten 24 Stunden lang anhaften. Am nächsten Tag initiieren Sie die Differenzierung, indem Sie das CM, das bFGF enthält, entfernen und durch CM mit BMP4/A/P mit zwei Millilitern pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte ersetzen.

Kultivieren Sie die Zellen weiter mit einem Sauerstoffgehalt von 4 %. Ersetzen Sie das CM, das BMP4/A/P enthält, alle zwei Tage, indem Sie das alte Medium aspirieren und ein neues Medium hinzufügen, das BMP4/A/P enthält. Sammeln Sie Zellen zu den gewünschten Zeitpunkten.

Kultivieren Sie hES-Zellen für zwei Passagen auf extrazellulärer Matrix, nachdem sie aus den MEFs mit hES-Medium, das bFGF enthält, übertragen wurden. Eine hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, also teilen Sie die hES-Zellen eins zu eins auf eine neue Platte auf, die am nächsten Tag eine Konfluenz von mindestens 50 % gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht im sauerstoffarmen Inkubator.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch zwei Milliliter pro Vertiefung Differenzierungsmedium. Legen Sie die Zellen über Nacht in einen sauerstoffarmen Inkubator. Vor der Transfektion eine Schale mit Gelatine beschichten und 0,1 % Gelatine in eine Schale geben.

Schwenken Sie die Schüssel, um den Teller zu beschichten, und lassen Sie den Teller dann bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten die Gelatine entfernen. Differenzieren Sie die Zellen bis zum gewünschten Zeitpunkt.

Am Tag vor der Transfektion trypsinisieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 0,05 % Trypsin. Plattieren Sie die Zellen in der gewünschten Konfluenz auf die mit Gelatine beschichtete Platte. Fügen Sie CM hinzu, das BMP4/A/P ohne bFGF enthält, und inkubieren Sie die Kultur über Nacht.

Geben Sie am nächsten Tag frisches Differenzierungsmedium in die Zellen. Transfizieren Sie siRNAs mit einem siRNA-Transfektionsreagenz. Verwenden Sie für Plasma-DNA ein geeignetes Lipofectamine-Reagenz.

Befolgen Sie das Produktprotokoll wie für jedes Transfektionsreagenz beschrieben. Übertragen Sie die siRNA-Lipofectamine-Komplexe in jede Vertiefung oder Platte mit Zellen und mischen Sie sie vorsichtig. Kultivieren Sie die Zellen dann über Nacht in einem sauerstoffarmen Inkubator.

Ersetzen Sie am nächsten Tag die Medien durch frische Differenzierungsmedien. Ernten Sie die Zellen zu den gewünschten Zeitpunkten, um die Effizienz der Gendisruption mit quantitativer RT-PCR zu überprüfen. Um schließlich Zellen zu ernten, fügen Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen.

Fügen Sie fünf Milliliter MEF-Medium pro Vertiefung hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem 200-fachen g herunter und verwenden Sie das Zellpellet zur RNA-Isolierung. Mit dieser Technik werden morphologische Veränderungen deutlich sichtbar.

Die Zellen am ersten Tag der Differenzierung sind größer als die Zellen vom Tag Null. Während die Differenzierung fortschreitet, teilen sich die Zellen und dehnen sich vom Zentrum der Kolonie aus aus aus, wobei sie nach außen wachsen. Die einzelnen Kolonien verschmelzen bis zum fünften Differenzierungstag miteinander, wobei die Zellen übereinander wachsen.

Die QRT-PCR-Analyse zeigt, dass die relativen Expressionsniveaus des pluripotenten C-Markers NANOG nach einem Tag der Differenzierung um 75% reduziert sind, wenn Zellen mit BMP4 kultiviert werden, und um 90% in Gegenwart von BMP4/A/P reduziert sind. Am zweiten Tag der Differenzierung waren die NANOG-Spiegel für Zellen, die in BMP4 allein oder in BMP4/A/P kultiviert wurden, im Vergleich zu denen in hESC CM-Medium, das Beta-FGF enthält, sehr niedrig. Transfektionen, die mit einem GFP-Plasmid durchgeführt und am ersten und dritten Tag in BMP4/A/P-behandelte Zellen eingeführt wurden, erzielten 24 Stunden nach der Transfektion eine Transfektionseffizienz von 30 bis 50 %.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche pluripotente Zellen in vitro in trophoblastische Zellen unterscheidet und wie man DNA-Konstrukte zur Manipulation der Genexpression einführt.