Name: Murine Lymphocyte Kennzeichnung von 64 Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für In Vivo Zellhandel von PET / CT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Lernen Sie die Markierung muriner Lymphozyten mit 64Cu-Antikörpern für PET/CT-Bildgebung in vivo. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Zellmigration und Homing-Mustern über 48 Stunden mit hohem Kontrast.

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Die Autoren danken Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant sowie Natalie Altmeyer für die Unterstützung während der Experimente und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung, die DFG durch den SFB685 (Projekt B6) und Fortuné (2309-0-0) unterstützt.

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<li>Perez-Diez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+cells+can+be+more+efficient+at+tumor+rejection+than+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells.</a> Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).</li>
<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
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<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Positron+Emission+Tomography+and+Applications+in+Preclinical+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development.</a> J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Immuno-PET+Imaging+Method+to+Monitor+CD8-Dependent+Responses+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy.</a> Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li>
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<li>Rini, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+with+FDG-labeled+Leukocytes+versus+Scintigraphy+with+111In-Oxine-labeled+Leukocytes+for+Detection+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection.</a> Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).</li>
<li>Ritchie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+macrophage+activated+killer+cells+to+sites+of+metastatic+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).</li>
<li>Adonai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+labeling+with+64Cu-pyruvaldehyde-bis%28N4-methylthiosemicarbazone%29+for+imaging+cell+trafficking+in+mice+with+positron-emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).</li>
<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
<li>Kalkhof, S., Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+chemical+cross-linking+with+amine-reactive+N-hydroxysuccinimide+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters.</a> Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und einfache Methode zum stabilen Zellen für in vivo - Tracking von PET radioaktive Markierung. Unter Verwendung dieses Verfahrens COVA-TH1 - Zellen, isoliert und in vitro aus Spendermäusen erweitert, könnte mit 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und dessen homing wurde in einem die pulmonalen und perithymic LNs als Gebiete von COVA Präsentation nachgeführt radiomarkiert wird COVA-induzierten akuten Atemweg DTHR. Die Modifikation des ...

Nicht-invasive Zellverfolgung ist ein vielseitiges Werkzeug , Zellfunktion, Migration und Homing in vivo zu überwachen. Recent Zellverfolgung Studien haben sich auf mesenchymale 1, 2 oder Knochenmark stammende Stammzellen 3 im Rahmen der regenerativen Medizin, autologem peripherer weißer Blutzellen in einer Entzündung oder T - Lymphozyten in adoptiven Zelltherapien gegen Krebs 3, 4 konzentriert. Die Aufklärung der Wirkorte und die zugrunde liegenden biologischen Prinzipien der zellbasierten Therapien ist von großer Bedeutung. CD8 + zytotoxische T - Lymphozyten, genetisch chimäres Antigen - Rezeptor (CAR) oder T - Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten engineered (TILs) wurden in großem Umfang als der Goldstandard. Allerdings Tumor-assoziiertes Antigen-spezifische TH1 - Zellen haben sich als eine wirksame alternative Behandlungsoption 4, sein &lt;/ sup&gt; 5, 6, 7. Als wichtige Akteure bei der Entzündung, organspezifischen Autoimmunerkrankungen (zB rheumatoide Arthritis oder Asthma bronchiales), und Zellen von großen Interesse in der Krebsimmuntherapie, ist es wichtig , die zeitliche Verteilung und Referenzierung Muster von TH1 - Zellen zu charakterisieren. Nicht - invasive in - vivo - Bildgebung durch PET stellt eine quantitative, hochempfindliche Methode 8 Zellmigrationsmuster, in vivo Referenzierung und die Seiten der T - Zell - Antworten und die Aktion während der Entzündung, Allergien, Infektionen oder Tumorabstoßungs 9, 10, 11 zu untersuchen. Klinisch 111 In-Oxin ist für Leukozyten - Szintigraphie für die Unterscheidung von Entzündung und Infektion 12, während 2-deoxy-2- (18 verwendet ,F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) wird für die Zell Tracking - Studien von PET 3, 13 verwendet. Ein wesentlicher Nachteil dieses PET - Tracer, jedoch ist die kurze Halbwertszeit des Radionuklide 18 F bei 109,7 min und der niedrigen intrazelluläre Stabilität , die Bildübertragung zu späteren Zeitpunkt nach der Adoptivzelle behindert. Für längerfristige in - vivo - Studien Zellverfolgung von PET, obwohl instabil in den Zellen, 64 Cu-PTSM häufig unspezifisch eingesetzt zu etikettieren Zellen 14, 15 mit minimierten nachteiligen Wirkungen auf T - Zell - Lebensfähigkeit und Funktion 16. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur weiteren nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren und die Funktion eines T-Zell-Rezeptor (TCR) -spezifischen radiomarkierten mAb verwendet. Zunächst wird die Herstellung der Radioisotop 64 Cu, die Konjugation des mAb KJ1-26 mit the Chelator DOTA und die nachfolgenden 64 Cu-Radiomarkierungs gezeigt. In einem zweiten Schritt wird die Isolierung und Expansion von COVA TH1-Zellen von DO11.10 Spendermäusen und die radioaktive Markierung mit 64 Cu belasteten DOTA-konjugierten mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) werden im Detail beschrieben. Die Beurteilung der Aufnahmewerte und Ausströmen von Radioaktivität mit einem Dosiskalibrator und y-Zählung jeweils sowie die Bewertung der Wirkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und Funktionalität mit IFN- &amp; gamma; ELISA vorgestellt . Für nicht-invasive in vivo - Zellverfolgung, das Hervorrufen von einem Maus - Modell von COVA-induzierter akuten Atemweg DTHR und Bildaufnahme von PET / CT nach dem adoptiven Zelltransfer beschrieben. Darüber hinaus kann diese Kennzeichnung Ansatz zu verschiedenen Krankheitsmodellen, Maus-T-Zellen mit unterschiedlichen TCRs oder allgemeinen Zellen von Interesse mit membrangebundenen Rezeptoren oder Ausdruck mar übertragen werdenkers kontinuierlichen Membran Basiswert 17 pendelt.

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.00318<</td><td>sup>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Methanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.06007</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Isopropanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.0104</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) Platte</td> <td>& Ouml; gussa</td><td>Sonderanfertigung</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>PEEK Kammer</td><td>WKL</td><td>Sonderanfertigung</td><td>64Cu Produktion</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Chemotrade</td><td></td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Polygramm SIL G/UV 254 Platte</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Ionenaustausch Ionenaustausch Säule</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Festkörper-Target-System für PETtrace</td><td>WKL</td><td>customum made</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>64Cu Aufarbeitungsmodul</td><td>WKL</td><td>customum made</td><td>64Cu Herstellung</td></tr><tr><td>Dosiskalibrator</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtrace Zyklotron</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Makrozyklika</td><td>B-280</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Anti-cOVA-TCR-Antikörper (KJ1-26)</td><td></td><td>Isoliert aus Hybridom-Zellkultur</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>H+ Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Filtereinheit</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Rotipuran Reinstwasser</td><td>Carl Roth</td><td>HN68.3</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Universität Tübingen</td><td></td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P-6 Säule</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7326221</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>Cyclone Plus PhosphorImager&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td><td>DOTA-Konjugation</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>Zutat für T-Zell-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Merck Millipore</td><td>L0473</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM-Aminosäuren</td><td>Merck Millipore</td><td>K0293</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>L 1613</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium</td></tr><tr><td>&nbsp; Penicillin/Streptomycin</td><td>Merck Millipore</td><td>A2212</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 mM 2-&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Inhaltsstoff für T-Zell-Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>DO11.10 Mäuse</td><td></td><td>Inhouse-Züchtung</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>Zellsieb 40 &micro; M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, Maus</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>LS Säule</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>Anti-CD4-Antikörper (Gk1.5)</td><td></td><td>Isoliert aus Hybridom-Zellkultur</td><td>TH1-Zellkultur-Anti-CD8-Antikörper</td></tr><tr><td>(5367.2)</td><td></td><td>Isoliert aus Hybridom-Zellkultur</td><td>TH1-Zellkultur</td></tr><tr><td>Anti-Ratten-Antikörper (MAR18.5)</td><td></td><td>Isoliert aus Hybridom-Zellkultur</td><td>TH1-Zellkultur</td></tr><tr><td>Kaninchen-Komplementär MA</td><td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>TH1-Zellkultur</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 Antikörper (11B11)</td><td></td><td>Isoliert aus einer Hybridom-Zellkultur</td><td>TH1-Zellkultur</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptid&nbsp;</td><td>EMV-micro-collections</td><td>Sonderanfertigung</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>CPG1668-Oligonukleotide</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>Sonderanfertigung</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655180</td><td>TH1 Zellkultur</td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662160</td><td>TH1</td></tr><tr><td>Zellkultur-Zellkulturflasche</td><td>Greiner</td><td>660175</td><td>TH1-Zellkultur</td></tr><tr><td>48-Well-Platten</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>677 180</td><td>Zellmarkierung</td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Beste Theratronics</td><td>via Anfrage&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gulmay RT225</td><td>Gulmay</td><td>via Anfrage&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Merck Millipore</td><td>L6323</td><td>in vitro Auswertung</td></tr><tr><td>Maus IFN-& gamma ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>558258</td><td>in vitro Bewertung</td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptose-Nachweiskit&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>in vitro Bewertung</td></tr><tr><td>Röhrchen 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.476</td><td>in vitro Bewertung</td></tr><tr><td>Röhrchen mit rundem Boden&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td>in vitro Auswertung</td></tr><tr><td>Wizard &gamma;-counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro Auswertung</td></tr><tr><td>ELISA Reader MultiscanEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51118177</td><td>in vitro Auswertung</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>via Anfrage&nbsp;</td><td>in vitro Auswertung</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>via Anfrage&nbsp;</td><td>in vitroAuswertung</td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo Zelltransport</td></tr><tr><td>Aluminiumgel</td><td>Serva Elektrophorese</td><td>12261.01</td><td>in vivo Zellhandel</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td>Bestellt via Universitätsklinikum</td><td>in vivo Zellhandel</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Ratiopharm</td><td>Bestellt via Universitätsklinik</td><td>in vivo Zelltransport</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP-Pharma</td><td>Bestellt via Universitätsklinikum</td> <td>in vivo Zelltransport</td></tr><tr><td>30 G Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td>in vivo Zellhandel Spritze</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo Zelltransport</td></tr><tr><td>Kapillaren 10 & Mikro; L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Inveon PET-Scanner</td><td>Siemens Healthineers</td><td>nicht mehr lieferbar</td><td>in vivo Zellhandel, alternative Firmen: Bruker, Mediso&nbsp;</td></tr><tr><td>Inveon SPECT/CT-Scanner</td><td>Siemens Healthineers</td><td>nicht mehr lieferbar</td><td>in vivo Zellhandel</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td>Bildanalyse, alternative Software: Pmod</td></tr></tbody></table>

murine lymphocyte kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; cu-antikörper-rezeptor-targeting für<em&gt; in vivo</em&gt; zellhandel von pet / ct

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Dieses Protokoll stellt die Herstellung von 64 Cu und die Chelator Konjugation / radioaktive Markierung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) , gefolgt von murine Lymphozyten - Zellkultur und 64 Cu-Antikörper - Rezeptor der Zellen abzielen. In - vitro - Bewertung der radioaktive Markierung und nicht-invasiven in vivo - Zellverfolgung in einem Tiermodell einer Atemwegs verzögerten Typ Überempfindlichkeitsreaktion (DTHR) von PET / CT beschrieben. Im Detail wird die Konjugation eines mAb mit dem Chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) gezeigt. Nach der Herstellung von radioaktivem 64 Cu, radioaktiver Markierung der DOTA-konjugierten mAb beschrieben. Als nächstes werden die Erweiterung der Hühnerovalbumin (COVA) -spezifische CD4 + Interferon (IFN) -γ-produzierende T - Helferzellen (COVA-TH1) und die anschließende radioaktive Markierung der Cova-TH1 - Zellen dargestellt. Verschiedene in vitro - Techniken werden zur Veranschaulichung der ef auszuwertenkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf den Zellen, wie die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluß, die Färbung auf Apoptose mit Annexin V für die Durchflusszytometrie und die Beurteilung der Funktionalität , die durch IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Darüber hinaus ist die Bestimmung der radioaktiven Aufnahme in die Zellen und die Markierungsstabilität im Detail beschrieben. Dieses Protokoll weiter beschrieben, wie Zell Tracking-Studien in einem Tiermodell für einen Atemweg DTHR und daher durchzuführen, die Induktion von COVA-induziertem akuten Atemweg DHTR in BALB / c-Mäusen ist enthalten. Schließlich ist eine robuste PET / CT-Workflow inklusive Bildaufnahme, Rekonstruktion und Analyse vorgestellt. Der Cu-64 - Antikörper - Rezeptor - Targeting - Ansatz mit nachfolgender Rezeptor - Internalisierung hohe Spezifität und Stabilität, reduzierte zelluläre Toxizität bereitstellt, und niedrigen Efflux Raten im Vergleich zu herkömmlichem PET-Tracer für die Markierung von Zellen, beispielsweise 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64-PTSM Cu). Schließlich ermöglicht unser Ansatz nicht-invasive in vivo Zellverfolgung durch PET / CT mit einem optimalen Signal-Rausch - Verhältnis für 48 Stunden. Dieser experimentelle Ansatz kann auf verschiedenen Tiermodellen und Zelltypen mit membrangebundenen Rezeptoren übertragen werden, die internalisiert werden.

Abbildung 1 fasst die Etikettierung von COVA TH1-Zellen mit dem 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und der Versuchsplan für die in - vitro- und in - vivo - Studien in diesem Protokoll. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" /> Abbildung 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Etikettiervorgang &amp; Experimentelles Design. ...

Nach der Herstellung eines 64 Cu-modifizierte monoklonale Antikörperbindung an einem transgenen Maus - T - Zell - Rezeptor, sind T - Zellen radioaktiv markiert in vivo, analysiert auf ihre Lebensfähigkeit, Funktionalität, Etikettieren Stabilität und Apoptose und adoptiv transferiert in Mäuse mit einem Atemweg Allergien vom verzögerten Typ Reaktion zur nichtinvasiven Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie / Computertomographie (PET / CT).

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine Lymphozyten stabil mit einem kupfermodifizierten radioaktiven monoklonalen Antikörper zu markieren, um die zeitliche Verteilung und Homing-Muster von Lymphozyten in Mausmodellen von Entzündungen oder Krebs mithilfe der PET/CT-Bildgebung in vivo zu verfolgen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Wirkorte sowie die entscheidenden zugrundeliegenden biologischen Prinzipien zellbasierter Therapien – wie Stammzelltherapien in der regenerativen Medizin oder Krebsimmuntherapien – aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Abbildung der Zellwanderung über einen Zeitraum von 48 Stunden mit hohem Kontrast und minimalen nachteiligen Auswirkungen auf die Zellen ermöglicht.Diese Methode kann leicht auf jede gewünschte Zellart mit spezifischen membranständigen Rezeptoren und entsprechenden monoklonalen Antikörpern übertragen werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Chelator-Konjugation und dem Radiomarkierungsprozess, was zu einer geringeren immunreaktiven Fraktion und einer zellspezifischen Aktivität führen kann. Beginnen Sie damit, eine DO11.10-Maus mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.Danach die Gliedmaßen mit Klebeband fixieren und einen medianen Schnitt entlang des Abdomens des Tieres anlegen. Beide Seiten des Schnittes seitlich auseinanderziehen, die Haut vom Peritoneum lösen und die zervikalen, axillären, brachialen und inguinalen Lymphknoten identifizieren. Mit stumpfen Pinzetten die Lymphknoten in einen Behälter mit 1 % FCS in PBS überführen.Öffnen Sie dann das Peritoneum, lösen Sie die Milz von der Bauchspeicheldrüse und dem Bindegewebe und lagern Sie die Milz zusammen mit den Lymphknoten. Sobald alle Gewebeproben gesammelt wurden, überführen Sie die Proben auf einen 40-Mikrometer-Filter in einem 15-Milliliter-Konustube und zerkleinern Sie das Gewebe mithilfe eines Spritzenstößels. Spülen Sie anschließend den Filter mit 10 Milliliter FCS in PBS aus und sammeln Sie die Einzelzell-Suspension durch Zentrifugation.Nachdem die roten Blutkörperchen lysiert wurden, das Pellet der weißen Blutkörperchen gemäß den Herstelleranweisungen in frischem PBS mit FCS und CD4-positiven Mikroperlen resuspendieren. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen mit bis zu 50 Milliliter frischem PBS mit FCS-Puffer waschen und in dem geeigneten Volumen an PBS mit FCS für die magnetische Elution der CD4-negativen Zellpopulationen resuspendieren. Die Zellen auf eine magnetische Zellseparationssäule auftragen und den Durchlauf in einem 15-Milliliter-Konustestgefäß auffangen.Am Ende der magnetischen Zellseparation verwenden Sie den Kolben, um die CD4-positiven Zellen in ein neues kegelförmiges Reagenzglas zu spülen, und stellen Sie die Konzentration der isolierten CD4-positiven T-Zell-Suspension auf eine mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in frischem vollständigem Medium für die Lagerung bei vier Grad Celsius ein. Sammeln Sie die CD4-negativen Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in Anti-CD4, Anti-CD8, mausanti-rattenspezifischen monoklonalen Antikörpern und Kaninchen-Komplement und inkubieren Sie 45 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nachdem die Zellen durch Zentrifugation gesammelt wurden, das Pellet in drei Milliliter frischem vollständigem Medium resuspendieren und die negativ selektierten antigenpräsentierenden Zellen mit 30 Gray bestrahlen. Die Konzentration der antigenpräsentierenden Zellen auf fünf mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in frischem vollständigem Medium einstellen und jeweils 100 Mikroliter CD4-positiver T-Zellen sowie 100 Mikroliter antigenpräsentierender Zellen in die entsprechenden experimentellen Vertiefungen einer 96-Loch-Flachbodenplatte geben. Anschließend die geeigneten Stimuli zu jeder Vertiefung hinzufügen und die Platte in einen Zellkultur-Inkubator überführen.Für die Radiomarkierung von auf Hühnerei-Ovalbumin-spezifischen TH1-Zellen verwenden Sie zunächst einen Dosis-Kalibrator, um 37 Megabecquerel des gewünschten T-Zell-spezifischen radioaktiven Antikörpers in eine Spritze ohne Totvolumen aufzuziehen. Geben Sie anschließend den Antikörper in ein Reaktionsgefäß und messen Sie die verbleibende Aktivität in der Spritze, um diese von der ursprünglich aufgezogenen Menge abzuziehen. Fügen Sie danach ein Milliliter physiologische Kochsalzlösung zum Gefäß hinzu, um eine Lösung mit einer Konzentration von 37 Megabecquerel pro Milliliter herzustellen.Als Nächstes werden zwei mal 10 hoch sechs OVA-TH1-Zellen in 0,5 Milliliter komplettem Medium in jedes Wells einer 48-Well-Platte gegeben, gefolgt von 20 Mikroliter der radioaktiv markierten Antikörperlösung. Nach 30 Minuten in einem strahlungssicheren Inkubator bei 37 Grad Celsius und 7,5 % Kohlendioxid werden die radioaktiv markierten Zellen in einem 50-Milliliter-Konischgefäß gesammelt und zweimal mit je 10 Milliliter PBS bei 37 Grad Celsius gewaschen. Um die Aufnahme und den Ausstrom des radioaktiv markierten Antikörpers zu messen, werden unmittelbar nach dem zweiten Waschschritt jeweils eine mal 10 hoch sechs monoklonal markierte OVA-TH1-Zellen in einem Milliliter komplettem Medium in jeweils eines von 10 Gamma-Zählgefäßen übertragen.Die Zellen durch Zentrifugation pelletieren und die Überstände in 10 neue Gamma-Zählgefäße überführen. Anschließend die Zellen mit einem Milliliter vollständigem Medium waschen, um nicht gebundene radioaktiv markierte monoklonale Antikörper zu entfernen, und die Überstände in 10 neue Gamma-Zählgefäße überführen. Danach einen Milliliter frisches, vollständiges Medium zu den Zellen geben und die Anfangswerte der Aufnahme in einem Gamma-Zähler messen.Für die in vivo PET/CT-Bildgebung die OVA-TH1-Zellen unmittelbar nach der Radiomarkierung auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter in PBS einstellen und 200 Mikroliter Zellen in eine Eins-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel aufziehen. Die Zellen intraperitoneal in ein Tier mit einer Ova-verzögerten Hypersensitivitätsreaktion zwischen der vierten und fünften Brustwarze injizieren. Um anschließend die Ko-Registrierung der PET- und CT-Bilder während der Bildanalyse zu erleichtern, Glaskapillaren, die eine radiomarkierte Antikörperlösung enthalten, unter einer Kleintierliege fixieren.Wenn der geeignete Sedierungszustand erreicht ist, Augensalbe auf die Augen des Tieres auftragen und Wattestäbchen sowie chirurgisches Klebeband verwenden, um die Maus auf der Liege zu fixieren. Die Mausliege zum PET-Scanner bringen und das Sichtfeld so zentrieren, dass die Lunge im Fokus steht, um eine 20-minütige statische PET-Aufnahme mit einem Energiefenster von 350 bis 650 Kiloelektronenvolt durchzuführen. Die Mausliege anschließend zur CT-Anlage übertragen.Über die Scout-Ansicht das Sichtfeld auf die Lungen zentrieren. Ein planares CT-Bild mittels 360 Projektionen während einer 360-Grad-Rotation im Step-and-Shoot-Modus mit einer Belichtungszeit von 350 Millisekunden und einem Binning-Faktor von vier aufnehmen. Die applizierte radioaktive Dosis von 0,7 Megabecquerel verringert die Lebensfähigkeit der TH1-Zellen lediglich um 8 %, während höhere Dosen eine noch ausgeprägtere Wirkung zeigen.Im Vergleich zur Radiomarkierung mit Kupfer-PTSM wird jedoch kein signifikanter Vorteil für den radiomarkierten Antikörper beobachtet. T-Zell-spezifische, radioaktiv markierte TH1-Zellen zeigen keinen Funktionsverlust, was durch die Sekretion von Interferon-Gamma, eine verminderte Ausschleusung von Radioaktivität und eine reduzierte Induktion der Apoptose im Vergleich zu Kupfer-PTSM-markierten TH1-Zellen belegt wird. Hier werden repräsentative hochauflösende statische PET- und anatomische CT-Bilder nach adoptiver Übertragung der mit monoklonalem Antikörper radiomarkierten Zellen gezeigt, wobei die Bilder in koronaler, axialer und sagittaler Ansicht mithilfe von Glas-Kapillaren, wie gerade demonstriert, fusioniert wurden.Es wurden Volumina von Interesse in den pulmonalen und perithymischen Lymphknoten auf den zerfallskorrigierten und normalisierten PET-Bildern abgegrenzt, um den Prozentsatz der injizierten Dosis pro Kubikzentimeter zu berechnen. Die Verfolgung der Migration von OVA-TH1-Zellen zu den pulmonalen und perithymischen Lymphknoten als Stellen der OVA-Präsentation bei einer verzögerten Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV zeigt, dass die in-vivo-PET-Signale, die von den mit monoklonalen Antikörpern radioaktiv markierten OVA-TH1-Zellen stammen, deutlich höher sind als die Signale von den mit Kupfer-PTSM markierten Zellen. Außerdem waren die Aufnahmewerte der OVA-TH1-Zellen bei den Tieren mit verzögerter Hypersensitivitätsreaktion signifikant höher im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren derselben Wurfgruppe.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie verwendet werden, um die spezifischen Rollen und Wirkorte von Immunzellen in tierexperimentellen Modellen menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass jeder Zelltyp möglicherweise unterschiedlich auf Radioaktivität reagiert, weshalb die Menge der verwendeten Radioaktivität entsprechend der jeweiligen Zellart angepasst werden muss. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man antigenspezifische T-Zellen isoliert und kultiviert, diese Zellen mit einem radioaktiven Antikörper markiert und ihre Verteilung sowie Homing-Kinetik mittels PET/CT bildlich darstellt.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter Bleiabschirmung, die Minimierung der Expositionszeiten sowie die Maximierung des Abstands zur radioaktiven Quelle getroffen werden sollten, während dieses Verfahrens.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die intrazelluläre Radiomarkierung von T-Helferzellen unter Verwendung von radioaktiven Isotopen-konjugierten monoklonalen Antikörpern für die nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung.

Markierung von murinen T-Helper-Lymphozyten mit radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpern

Dieses Video demonstriert eine Technik, die ein Radioimmunkonjugat für die in vivo Bildgebung eines Tumors in einem Mausmodell beinhaltet. Bei der Injektion des Radioimmunkonjugats binden die Antikörper des Konjugats an ein spezifisches Membranantigen auf den Krebszellen. Der Radiotracer des Konjugats emittiert Positronen, die mit benachbarten Elektronen interagieren, um Energie zu erzeugen, die von einem Positronen-Emissions-Tomographie-Scanner (PET) detektiert wird, um ein Bild des Tumors zu...

Eine in vivo PET-Bildgebungstechnik zum Nachweis von Tumoren in einem Mausmodell mit radioaktiv markierten Antikörpern

Wir beschreiben eine allgemeine Protokoll für die in-vivo-Zellortung mittels MRT in einem Mausmodell mit Ex-vivo-markierten Zellen. Ein typisches Protokoll für die Zellmarkierung, Bildaufnahme und Verarbeitung Quantifizierung ist inbegriffen.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

Die bioorthogonale inverse Elektronennachfrage Diels-Alder-Cycloaddition wurde genutzt, um eine effektive und modulare prägezielte PET-Bildgebungsstrategie für Krebs zu entwickeln. In diesem Protokoll werden die Schritte dieser Methodik im Kontext eines Modellsystems beschrieben, das den auf Darmkrebs abzielenden Antikörper huA33 und einen 64-Cu-markierten Radioliganden verwendet.

Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

In diesem Artikel wird die Methodik zur radioaktiven Markierung eines humanspezifischen monoklonalen Anti-CD19-Antikörpers beschrieben und erläutert, wie er zur Quantifizierung von B-Zellen im zentralen Nervensystem und in peripheren Geweben eines Mausmodells für Multiple Sklerose unter Verwendung von In-vivo-PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gamma-Zählung und Autoradiographie-Ansätzen verwendet werden kann.

Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie

Lernen Sie die Markierung muriner Lymphozyten mit 64Cu-Antikörpern für PET/CT-Bildgebung in vivo. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Zellmigration und Homing-Mustern über 48 Stunden mit hohem Kontrast.

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von

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