Name: Entwicklung von Metarhizium anisopliae Als Mycoinsektizid: Von der Isolation bis zur Field Performance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Mykoinsektizids mit Metarhizium anisopliae für nachhaltigen Pflanzenschutz. Diese Methode zeigt Isolation, Screening und Formulierung wirksamer Pilzstämme gegen Schädlinge.

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Die Autoren bestätigen den Beitrag der Mitarbeiter aus dem Indo-Swiss Collaboration in Biotechnology (ISCB) des Fachbereichs Biotechnologie, Neu-Delhi und der Direktion für Entwicklung und Zusammenarbeit, Bern, Schweiz. Die Beiträge von Projektschülern und Mitarbeitern, die an der Entwicklung des Mycoinsektizids beteiligt sind, darunter Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane und Abhijeet Lande, werden anerkannt. EKP und SGT danken der University Grants Commission, Indien und dem Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indien, für Forschungsstipendien. MVD erkennt die Unterstützung des Rates für industrielle und wissenschaftliche Forschung, Neu-Delhi für das Emeritus Scientist Scheme an. Die Autoren sind dank der Abteilung für Biotechnologie, Neu-Delhi, Indien für die finanzielle Unterstützung im Rahmen der ISCB- und SBIRI-Programme. Wir sind dankbarRezensenten für ihre Eingaben.

1. Isolierung von entomopathogenen Pilzen <ol><li> Bodenverdünnungsmethode <ol><li> Sammeln Sie die Bodenproben und mycosed Insekten aus verschiedenen Erntefeldern ( Tabelle 1 ). Isolieren Sie die entomopathogenen Pilze aus Bodenproben mit dem Bodenverdünnungs-Plattierungsverfahren 8 . Anmerkung: In dieser Studie wurden Proben von der Pune (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N; 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E) und Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E gesammelt ) Bezirke, Maharashtra, Indien. </li><li> 10 g jeder Bodenprobe wiegen und separat zu 90 ml sterilem 0,1% (w / v) Tween-80 zugeben. </li><li> Die Proben mit einem Magnetrührer für 60 min sorgfältig vermischen, um die an den Bodenpartikeln haftenden Sporen freizusetzen. </li><li> Nach dem Mischen verteilen sich 100 bis 200 &amp; mgr; l Aliquots von jeder Probe auf selektives Medium, enthaltend (g / l): Pepton, 10; Glukose, 20; Agar, 18; Streptomycin, 0,6; Tetracyclin, 0,05; CycLohexamid, 0,05; Und dodin, 0,1 ml; PH 7,0 9 . Inkubieren Sie die Platten bei 28 ° C für 3-7 Tage. </li><li> Selektieren und subkulturieren die einzelnen sporulierenden Kolonien auf demselben Medium, um reine Kulturen zu erhalten. </li></ol></li><li> Von mycosed Insekten <ol><li> Sammle die myzosierten Insekten aus dem Feld. Anmerkung: Ein schwerer Larvenkörper wird wahrscheinlich mit entomopathogenem Pilz infiziert. Bei bakterieller oder viraler Infektion ist der tote Insektenkörper weich. </li><li> Sammle lebende Insekten mit abnormalem Verhalten, schlechter Koordination und ruckartigen Bewegungen. </li><li> Halten Sie die Insekten bis zum Tode und übertragen Sie sie dann in feuchten Kammern für weitere Mykosen und Sporulation, wenn überhaupt, bei 28 ° C und 70-80% RH. </li><li> Streifen Sie die Sporen aus den sporulierenden Kadavern auf das oben genannte selektive Medium und erhalten Sie reine Kulturen durch weitere Subkultivierung 2-3 mal auf dem gleichen Medium. </li></ol></li><li> Ködermethode <ol><li> In einemDurchstechflasche (3,85 x 6,0 cm) mit 60 g Bodenprobe, fügen Sie 4-reis-Motten-Larven ( Corcyra cephalonica ) hinzu und halten Sie die Durchstechflaschen bei 25 ± 2 ° C für einen Zeitraum von 14 Tagen. </li><li> Drehen Sie die Fläschchen jeden Tag auf den Kopf. Nach 14 Tagen die Bodenproben auf das Vorhandensein von mycosed Reis-Mottenlarven abschirmen. Isolieren Sie den entomopathogenen Pilz durch Streifen von Sporen aus sporulierenden Kadavern auf selektivem Medium. </li><li> Nach dem Erhalten von Reinkulturen die Isolate auf Kartoffeldextrose-Agar (PDA) schräg stellen und bei 28 ° C und 70-80% RH für 7 Tage inkubieren, um eine Sporulation zu ermöglichen. Nach der Sporulation die Mutterkulturen bei 8 ° C bis zur Anwendung aufrechterhalten. </li></ol></li></ol> 2. Identifizierung von entomopathogenen Pilzen <ol><li> Identifizieren Sie entomopathogene Pilze, indem Sie morphologische Merkmale beobachten ( dh asexuelle Sporengröße und Form und die Anordnung der Sporen auf Conidiophoren); Isoliert von 3 Hauptgattungen, Metarhizium , Beauv<html> Eria und Nomuraea identifiziert werden können. </li><li> Zur molekularen Identifizierung von Metarhizium- Stämmen wird die genomische DNA aus der Myzel-Biomasse unter Verwendung eines DNA-Isolationskits extrahiert; Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien ). Überprüfen Sie die Qualität der genomischen DNA durch Durchführung der Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel. <ol><li> PCR-amplifizieren die ITS1-5.8S-ITS2 und 26S rDNA Region. Verwenden Sie genomische DNA als Vorlage, mit ITS1 forward (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) und ITS4 Reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Primer 10 . </li><li> Gel-eluieren und die erwarteten Amplikons unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits reinigen; Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien ). Quantifizieren Sie das gereinigte Amplikon und die Sequenz. </li><li> Lesen und bearbeiten Sie die Sequenzen mit der Software und führen Sie eine BLAST-Suche der Nukleotidsequenzen in der NCBI GenBank-Datenbibliothek aus, um die enge Homologie zu analysieren= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Hinterlegung der Sequenzen von identifizierten entamopathogenen Isolaten an die NCBI GenBank Datenbank, um die Zugangsnummern abzurufen. </li></ol></li></ol> 3. Screening von Metarhizium- Isolaten gegen H. armigera <ol><li> Insektenaufzucht <ol><li> Stellen Sie die erste Kultur von H. armigera her, indem Sie gesunde Larven und Puppen des Insekts aus dem Feld sammeln. </li><li> Für die Aufzucht, wachsen die Larven einzeln in sterilen Polypropylen-Durchstechflaschen (3,85 x 6,0 cm, 50-ml-Kapazität), die Stücke von Okra enthalten, die mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit für 10 min 12 desinfiziert wurden. </li><li> Sammeln Sie die Insekteneier, die während der Aufzucht aufgelegt wurden, und oberflächensterilisieren sie mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit. </li><li> Halten Sie die Larven bei 25 ± 2 ° C und 65 ± 5% RH. </li></ol></li><li> Insekten-Bioassay Hinweis: Für den Insekten-Bioassay, die Herstellung von Sporen,Und Feldleistungsstudien wurden die ersten Subkulturen von Metarhizium- Stämmen aus mycosed H. armigera- Larven verwendet, sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Für die Insekten-Bioassays verwenden Sie III-Instar-Larven von H. armigera . </li><li> Tauchen Sie einen Satz von 30 Larven einzeln in eine 10-ml-Sporensuspension von Metarhizium- Isolaten (1 x 10 7 Sporen / ml, sofern nicht anders angegeben, Lebensfähigkeit&gt; 90%) für 5 s. </li><li> Nach der Behandlung jede Larve einzeln in eine separate, sterile Durchstechflasche geben, um einen Kannibalismus zu vermeiden. Zu jeder Durchstechflasche fügen Sie feuchtes Whatmann-Filterpapier Nr. 1 und ein Stück desinfizierten Okra als Futter hinzu. Ändern Sie das Papier und füttern Sie an wechselnden Tagen. </li><li> Halten Sie die Larven bei 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH und 16: 8 Licht: dunkel für 14 Tage oder bis sie sterben. </li><li> Übertragen Sie die toten Larven auf sterile Petrischalen, die feuchte Wattestäbchen enthalten und halten sie bei 28 ° C und 70-80% RH für 3-7 Tage, um Myzelien und Sporen zu ermöglichenBildung über die Kadaver. </li><li> Für eine Kontrolle, behandeln Sie einen Satz von 30 Larven in dreifacher Ausfertigung mit 0,1% (w / v) Tween-80 in sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Führen Sie alle Experimente in dreifacher Ausfertigung mit frisch zubereiteten Sporensuspensionen durch. Sammeln und bündeln Sie die Daten über die prozentuale Mortalität aus drei Experimenten, um Durchschnittswerte zu erhalten. Berechnen Sie die korrigierte prozentuale Mortalität mit Abbott&#39;s Formel 13 . </li><li> Führen Sie die Experimente mit einem randomisierten kompletten Block Design (RCBD) Layout, mit jeder Behandlung mit einem Satz von 30 Larven in dreifacher Ausfertigung. Basierend auf prozentualer Mortalität gegen H. armigera , wählen Sie Metarhizium- Isolate für die weitere Screening der besten Isolat für kommerzielle Produktion. </li><li> Wählen Sie die Isolate, die&gt; 90% Mortalität gegen H. armigera III-instar Larven demonstrieren. Anmerkung: Hier wurden 12 Isolate ausgewählt. </li><li> Bestimmen Sie die LT 50 dieser Isolate und wählen Sie die Isolate demonstrierenBewertung der schnellsten Tötung (in kürzerer Zeit). Anmerkung: Hier wurden 5 Isolate aus den 12 stärksten Isolaten ausgewählt. </li><li> Bestimmen Sie die LC 50 -Werte der ausgewählten Isolate mit vier verschiedenen Konzentrationen (dh 1 × 10 3 , 1 × 10 5 , 1 × 10 7 und 1 × 10 9 Sporen / ml) der Sporensuspension. </li><li> Bestimmen Sie die LC 50 der Metarhizium- Isolate gegen III-Instar-Larven von H. armigera , um die Möglichkeit zu erkennen, den Unterschied in der Virulenz von Isolaten mit hohen Mortalitätswerten zu identifizieren, die unentdeckt werden könnten, wenn nur eine einzige Dosis verwendet wird. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von Sporen eines Metarhizium- Isolats für Feldleistungsstudien <ol><li> Herstellung von Metarhiziumsporen durch SSF <ol><li> Für SSF, bereiten Sie das Inokulum durch Zugabe von 2 x 10 7 Sporen der Metarhizium- Isolate zu200 ml YPG (0,3% Hefeextrakt, 0,5% Pepton und 1,0%, Glucose) Medium. Inkubieren Sie die Kolben bei 28 ° C unter Schütteln (180 U / min) für 48 h. </li><li> Für die Massenproduktion von Sporen durch SSF, verwenden Sie Reis als Substrat, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Für SSF füllen Sie Autoklavenbeutel (Typ / 14 mit einem einzigen Mikrofiltfilter von 0,5 μm, 2 kg Fassungsvermögen, 64 × 36 cm) mit 2 kg Reis. Füge 1.000 ml destilliertes Wasser dem Reis in die Säcke hinzu und über Nacht einweichen 14 . Autoklavieren Sie die Beutel mit dem getränkten Reis bei 121 ° C für 45 min 15 . </li><li> Inokulieren Sie die Beutel mit 48-h-altem Myzel-Inokulum (10% Inokulum, 200 ml für 2 kg Reis) und inkubieren bei 28 ° C und 70-80% RH für 14 Tage. </li><li> Ernte die Sporen durch Flüssigkeitsextraktion mit 0,1% Tween-80. Dazu fügen Sie den Inhalt des Beutels zu 0,1% Tween-80 (3 L pro 1 kg Reis) hinzu, mischen gründlich, trennen die Sporen aus der Flüssigkeit durch Zentrifugation und trocknen bei 37 ° C für 2 Tage<html> / Li&gt; <li> Alternativ trocknen Sie die Beutel mit Reis mit den Sporen und einigen Myzelien bei 37 ° C für 2 Tage, um den Feuchtigkeitsgehalt zu reduzieren (&lt;20%). Ernten Sie die Sporen mit einem Mähdrescher oder Vibro-Sichter. </li></ol></li><li> Lebensfähigkeit Studien <ol><li> Bestimmen Sie die prozentuale Lebensfähigkeit der geernteten Sporen mit verschiedenen Methoden 15 . Dazu werden die Sporensuspensionen in 0,1% (w / v) Tween-80 vorbereitet und die Anzahl auf 1 × 10 3 Sporen / ml eingestellt. </li><li> Die Sporensuspensionen (0,1 ml) auf die PDA-Platten dreifach verteilen und bei 28 ° C und 70-80% RH für 72 h inkubieren. </li><li> Manuell die isolierten Kolonien zählen und die gesamte lebensfähige Anzahl für die jeweilige Probe bestimmen. </li></ol></li><li> Sporen-Sedimentationsrate <ol><li> Für eine einheitliche Dosierung ist die homogene Sporensuspension erforderlich; Bestimmen die Sporen-Sedimentationsraten für Metarhizium- Isolate wie beschrieben&quot;Xref&quot;&gt; 16 Überprüfen Sie die Sedimentationsraten von Sporen in 0,2 M Ammoniumsulfat und 0,1% Tween-80. </li><li> Stellen Sie die Anzahl der Sporensuspension auf ~ 7 × 10 7 Sporen / ml ein, um eine anfängliche Extinktion von 0,6 bei 540 nm zu erhalten. Lassen Sie die Küvetten für 6 Stunden ungestört stehen, damit sich die Sporen absetzen können. </li><li> Die Extinktion bis zu 6 h aufnehmen. Drücken Sie die Sedimentationsrate in Prozent aus und berechnen Sie die für 50% Sedimentation benötigte Zeit (ST 50 ). Wiederholen Sie das Experiment dreimal mit frisch zubereiteten Sporensuspensionen. </li></ol></li></ol> 5. Feld-Performance-Studien über die Fähigkeit der ausgewählten M. anisopliae isolieren, um H. armigera in Taubenerbsen zu kontrollieren <ol><li> Benetzbare Pulverformulierung von M. anisopliae M 34412 Sporen <ol><li> Vorbereitung der 2,5-5% benetzbaren Pulverformulierung durch Mischen der Sporen mit Talk. </li><li> Passen Sie die endgültige Vitalzahl (TVC) auf 1 x 10 12 Spo anRes pro kg Formulierung </li></ol></li><li> Feldleistungsstudien von M. anisopliae M 34412 Sporen <ol><li> Für Feldleistungsstudien über die Fähigkeit des ausgewählten M. anisopliae- Isolats, H. armigera- Befall in Taubenerbsen zu kontrollieren, verwenden Sie eine RCBD mit vier Replikationen. Anmerkung: Hier bei Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927 ° N, 74.6488 ° E) durchgeführt. </li><li> Verwenden Sie zwei verschiedene Sprühformulierungen, eine Ölformulierung von Sporen (5 x 10 12 Sporen / 3 L Diesel: Sonnenblumenöl, 7: 3) und eine wässrige Formulierung in Tween-80 (0,1%). Die Ölformulierung mit einem Ultra-Low-Volumen (ULV) Spray (70 min; 3 L / ha) die wässrige Formulierung mit einem Rucksacksprüher (5 x 10 12 Sporen, 500 l / ha) aufsprühen. Anmerkung: Hier wurden die Larvenpopulationen einen Tag vor dem Spray aufgezeichnet und 3 und 7 Tage nach dem Auftragen jedes Sprays auf 5 zufällig ausgewählte Pflanzen. Die Gesamtbevölkerung war tFür die statistische Analyse zur Quadratwurzel von n + 1 geleitet. <ol><li> Nach landwirtschaftlichen Praktiken für die Tauben Erbsen Ernte, führen Sie die erste Sprühen zwischen 10 und 15 d nach Ei Verlegung und 2 weitere Male mit einem 14-Tage-Intervall. Führen Sie das Sprühen zwischen 16:00 und 18:00 h IST durch. Überwachen Sie die Windrichtung und verwenden Sie ggf. Tuchvorhänge, um das Spritzen von Sporen zu den benachbarten Parzellen zu vermeiden. </li></ol></li><li> Zum Vergleich die chemischen Insektizide mit einem Hand-Kompressions-Rucksack Spray sprühen. </li><li> Bestimmen Sie die Beharrlichkeit des Inokulums auf dem Feld durch das Sammeln von H. armigera Larven 0, 3, 5, 7 und 14 Tage nach dem Sprühen. </li><li> Halten Sie diese Larven unter Beobachtung für einen Zeitraum von 14 Tagen und nach dem Tod, übertragen Sie sie in eine Plastikfläschchen mit feuchtem Filterpapier. Inkubieren bei 25 ± 2 ° C und 70 ± 10% RH zur Beobachtung der Mykose. </li><li> Bestimmen Sie die Beharrlichkeit des Inokulums auf der Larvenpopulation auf der Grundlage der p<html> Ering-Mortalitätsdaten der nach dem Sprühen aus dem Feld gesammelten Larven </li><li> Bewerten Sie die Feldstudien auf der Basis der prozentualen Wirksamkeit 17 , Prozent Pod Schaden und Prozent Ausbeute 18 . Anmerkung: Hier wurden die Daten für die Parameter wie Temperatur, Feuchtigkeit, Windgeschwindigkeit (km / h), Sonnenschein (h), Niederschlag (mm), Regentage und Verdunstung (mm) während eines Versuches bei einem Landwirtschaft Universität (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Das partizipative Programm der Landwirte <ol><li> Wählen Sie die Anzahl der Landwirte für die Demonstrationsversuche aus. Versorgung der Tauben Erbsensamen (BSMR - 736) zusammen mit Dünger an die Bauern. Hinweis: In dieser Studie waren 20 Landwirte beteiligt. Dorf: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Verwenden Sie die gleichen Sprühformulierungen und die Anzahl der Sprays wie in Schritt 5.2. </li></ol></li></ol>Tle &quot;&gt; 6. Wirkung auf Nichtzielorganismen <ol><li> Beobachten Sie die Wirkung von Mycoinsektizid Spray, wenn überhaupt, auf die Taube Erbse Blätter. </li><li> Sammeln Sie die Bodenbewohner-Arthropoden und blattbewohnenden Insekten 1 Tag nach jeder Behandlung in den unbehandelten Parzellen und in den mit M. anisoplien behandelten Plots. </li><li> Sammle die Boden-Arthropoden mit Pitfall-Fallen innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung und sammle die blattbewohnenden Insekten mit einem Sweep-Netz am Morgen nach der Behandlung ( dh etwa 15-18 Stunden nach der Behandlung). </li><li> Halten Sie sie einzeln in zylindrischen Plastikboxen mit einem Durchmesser von 3,5 cm und einer Höhe von 4,0 cm. Überprüfen Sie die Insekten täglich auf Infektion und füttern Sie sie mit entsprechender Nahrung. </li><li> Notieren Sie die Anwesenheit von M. anisopliae , wenn überhaupt, und isolieren Sie den Pilz. </li></ol> 7. Identifizierung von Qualitätskontrollparametern <ol><li> Überprüfen Sie die Sporenlebensfähigkeit durch Messung der Sporenkeimung auf PDA bei 28 °C; </li><li> Messen Sie abbildende Enzymaktivitäten wie Chitinase, Chitin-Deacetylase, Chitosanase, Protease und Lipase, die im YPG- und Chitin-Medium produziert werden, wie zuvor beschrieben 15 . </li><li> Bestimmen Sie die prozentuale Mortalität von H. armigera in einem Labor-Bioassay 15 . </li><li> Verwenden Sie molekulare Marker, wie ein PCR-RFLP-Muster von Chitinasen ( Chit 1 , 2 und 4 ) und Protease ( Pr1A ) -Gen , als Virulenzattribute für M. anisopliae . <ol><li> Extrahiere die genomische DNA aus der Myzelien-Biomasse unter Verwendung eines DNA-Isolationskits 15 . PCR-amplifizieren die Chit1- und Chit2- Genfragmente unter Verwendung genomischer DNA als Matrize mit Primerpaaren Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) und Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Für Chit4 verwenden Sie das Primerpaar Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Für die Amplifikation des Pr1A-Gens verwenden Sie das METPR2- und METPR5-Primerpaar (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG). </li><li> Führen Sie den Restriktionsverdau 19 des Chit1- Gens mit BsaJI , BstUI und ScrFI durch ; Des Chit2- Gens mit AluI , HpyCH4IV und HpyCH4V und des Chit4- Gens mit BstUI , HaeIII und MboI . Für die Verdauung des Pr1A- Gens verwenden Sie RsaI , DdeI und MspI 20 . </li><li> Beobachten Sie das Beschränkungsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) -Muster auf 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese für jedes Gen für die meisten virulenten Stämme (&gt; 90% Mortalität); Dies kann als Virulenzmarker für die Selektion von M. anisopliae verwendet werden . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Während der 1880er Jahre wurde der erste Versuch unternommen, Metarhizium zu benutzen, um den Skarabäuskäfer, Anisoplia austriaca und die Zuckerrüben curculio, Cleonis punctiventris 21 zu kontrollieren . In diesem Protokoll war eine der Voraussetzungen, einen virulenten Stamm entweder vom Boden oder von infizierten Insekten zu isolieren. Tatsächlich haben andere Parameter wie LC 50 , LT 50 und ST 50 wesentlich zur Kostenwi...

<html> Von der Einführung von Organochlor-Pestiziden in den 1940er Jahren in Indien hat die Verwendung von Pestiziden viele Falten 1 , mit Ernte-Schädlinge noch kostet Milliarden von Rupien 2 jährlich in Bezug auf Ertragsverlust in der landwirtschaftlichen Produktion. Die weit verbreitete und nicht-vernünftige Verwendung von synthetischen Pestiziden ist eine kontinuierliche Bedrohung für die Umwelt und die menschliche Gesundheit 1 . Die wahllose Verwendung von Pestiziden führt zu Rückständen im Boden und zur Erschöpfung von natürlichen Schädlingsbekämpfern. Es dient auch als ein mächtiger Selektionsdruck für die Veränderung der genetischen Make-up einer Schädlingsbevölkerung, was zur Entwicklung des Widerstandes 1 führt . Trotz der enormen Vorteile der grünen Revolution, die hohe Inputs wie Dünger und Pestizide benötigte, sind Schädlinge weiterhin ein wichtiger biotischer Zwang. Eine allgemeine Schätzung der jährlichen Ernteverluste in Indien und weltweit beträgt 12 Mrd. USDEf &quot;&gt; 2 und USD 2.000 Mrd. 3 . Wenn chemische Pestizide bei der Bekämpfung von Insektenschädlingen schädliche Wirkungen haben, wird es zwingend erforderlich, nach alternativen Methoden zu suchen, die ökologisch sinnvoll, zuverlässig, wirtschaftlich und nachhaltig sind. Die biologische Kontrolle bietet eine geeignete Alternative und beinhaltet die Verwendung von Parasiten, Raubtieren und mikrobiellen Pathogenen 4 . Pilze sind zum Beispiel bekannt, um eine breite Palette von Insektenschädlingen zu infizieren, darunter Lepidopterane, Hymenopterane, Coleopterane und Dipterane, die oft zu natürlichen Tierseuchen führen. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu anderen bakteriellen und viralen Insektenbekämpfungsmitteln die Wirkungsweise von insektenpathogenen Pilzen durch Kontakt 5 . Diese Pilze umfassen eine heterogene Gruppe von über 100 Gattungen, wobei etwa 750 Arten unter verschiedenen Insekten berichtet werden. Die bedeutenden Pilzpathogene sind: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii und Hirsutella sp., um nur einige zu nennen 6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin ist der zweithäufigste entomopathogene Pilz in der Biokontrolle. Es ist bekannt, über 200 Arten von Insekten anzugreifen 7 . In dieser Studie werden verschiedene Stufen der wissensbasierten Entwicklung eines Mycopesticids mit M. anisopliae vorgestellt. Dazu gehören: 1) die Identifizierung einer Quelle ( dh entweder Boden oder mykosierte Insekten) für virulenten Entomopathogene, 2) Entomopathogenidentifizierung und Selektion, 3) Strategien zur Aufrechterhaltung ihrer virulenten Natur und Wirksamkeit im Labor-Bioassay und im Feld, 4 ) Die kostengünstige Formulierung von infektiösen Propagulen, 5) die Entwicklung von einzigartigen Qualitätskontrollparametern für die virulente Präparation und 6) Bioprospektation und Wertschöpfung.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td> Reagenz-DNA-Analysator<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Angewandtes Biosystem</td><td>ABI-Prisma 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>DNA-Verordnungskit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td> Reagenz-Gel-Extraktionskit <td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Knapsac Sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Polypropylen-Fläschchen & nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td></td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)</td> aus Kunststoff<td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ultra-Low-Volume-Sparyer</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Einhorn-Beutel&nbsp;</td><td>Unicorn</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Autoklaviertasche für SSF</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

entwicklung von<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; als mycoinsektizid: von der isolation bis zur field performance

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Ein wichtiges Anliegen bei der Entwicklung von kommerziellen Mycoinsektiziden ist die Abtötungsgeschwindigkeit im Vergleich zu der von chemischen Insektiziden. Daher sind Isolation und Screening für die Auswahl eines schnell wirkenden, hochgradig virulenten entomopathogenen Pilzes wichtige Schritte. Entomopathogene Pilze wie Metarhizium, Beauveria und Nomurea , die durch Kontakt wirken, eignen sich besser als Bacillus thuringiensis oder Nukleopolyhedrosis Virus (NPV), die von der Insektenschädlinge eingenommen werden müssen. In der vorliegenden Arbeit isolierten wir 68 Metarhiziumstämme von infizierten Insekten unter Verwendung einer Bodenverdünnung und Ködermethode. Die Isolate wurden durch die Amplifikation und Sequenzierung der ITS1-5.8S-ITS2- und 26S-rDNA-Region identifiziert. Der am meisten virulenten Stamm von Metarhizium anisopliae wurde basierend auf der medianen letalen Konzentration (LC 50 ) und der Zeit (LT 50 ), die in Insekten-Bioassays gegen III-Instar-Larven von Helicoverpa armigera erhalten wurde, ausgewählt.Die Massenproduktion von Sporen durch den ausgewählten Stamm wurde mit Festkörperfermentation (SSF) unter Verwendung von Reis als Substrat für 14 Tage durchgeführt. Sporen wurden aus der sporulierten Biomasse mit 0,1% Tween-80 extrahiert und verschiedene Formulierungen der Sporen wurden hergestellt. Feldversuche der Formulierungen zur Kontrolle eines H. armigera- Befalles in Taubenerbsen wurden durch randomisierte Blockgestaltung durchgeführt. Die mit Öl und wässrigen Formulierungen erhaltenen Befallkontrollniveaus (78,0% bzw. 70,9%) waren besser als die mit chemischen Pestiziden erhaltenen 63,4%

Während der Untersuchungen wurden verschiedene Stämme von Metarhizium, Beauveria und Nomuraea durch verschiedene Isolationsmethoden isoliert (Daten nicht gezeigt) 6 , 14 Da Metarhizium- Stämme bei der Kontrolle von H. armigera , einem schrecklichen Schädling in den Hülsen 6 , 14, wirksamer waren Wurden weitere Isolierungen zur Isolierung von Metarhiziumstä...

Hier berichten wir über die verschiedenen Phasen der wissensbasierten Entwicklung eines wirksamen Mycoinsektizids, einschließlich der Isolierung, Identifizierung, Screening und Auswahl des &quot;best-fit&quot; entomopathogenen Pilzes, Metarhizium anisopliae , zur Bekämpfung von Insektenschädlingen in der Landwirtschaft .

Entwicklung von<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Als Mycoinsektizid: Von der Isolation bis zur Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Der unsachgemäße Einsatz synthetischer Pestizide stellt eine ständige Bedrohung für die Umwelt und die menschliche Gesundheit dar. Der biologische Pflanzenschutz mit Hilfe von Bakterien, Viren und Pilzen bietet eine geeignete Alternative zur Bekämpfung verschiedener Insektenplagen in der Landwirtschaft. Im Gegensatz zu Bakterien und Viren wirken insektenpathogene Pilze kontaktwirksam.Metarhizium-Arten gehören zu den wirksamsten pilzlichen Insektenpathogenen. Bekanntermaßen befallen sie mehr als 200 Schadinsektenarten. Wir haben ein Mycoinsektizid unter Verwendung von Sporen einheimischer Metarhizium-Isolate entwickelt.In diesem Video werden die Protokolle zur Isolierung und Identifizierung lokaler Pilzisolate, zur Insekten-Bioassays zur Untersuchung und Auswahl wirksamerer Stämme, zur Herstellung von Sporen ausgewählter Metarhizium-Stämme sowie das Protokoll zur Herstellung einer kostengünstigen Formulierung des Mycoinsektizids für den Feldgebrauch vorgestellt. Zudem werden Qualitätskontrollmaßnahmen hervorgehoben, die während der kommerziellen Produktion zu beachten sind. Die Isolierung entomopathogener Pilze kann auf drei Arten erfolgen.Zunächst ausgehend von Böden. Metarhizium ist ein natürlich vorkommender Pilz in den meisten Böden. Um eine große Vielfalt an Isolaten zu erhalten, werden Böden von Feldern mit verschiedenen Kulturpflanzen und aus weit voneinander entfernten Regionen gesammelt.Die Bodenprobe wird vier bis sechs Zoll unterhalb der Oberfläche entnommen. Die Proben aus dem Feld werden in beschrifteten Tüten gesammelt und später im Labor jeweils 10 Gramm jeder Probe in Gefäße überführt. Metarhizium wird mit der Bodenverdünnungsplattenmethode isoliert. 10 Gramm der Bodenprobe werden in 90 ml sterilem 0,1 % Tween 80 überführt. Die Aufschlämmung wird 60 Minuten lang mit einem magnetischen Rührer gerührt. In der Zwischenzeit werden 900 Mikroliter-Aliquote von Tween 80 für die nachfolgende Verdünnungsreihe vorbereitet.Das Überstand aus der Suspension wird nun nacheinander in den Tween-80-Aliquoten verdünnt. Einhundert Mikroliter Aliquot aus jeder Probe werden auf dem von Keller und anderen beschriebenen Medium ausgestrichen. Die Platten werden drei bis sieben Tage bei 28 Grad inkubiert.Die einzelnen sporulierenden Kolonien werden später auf dem gleichen Medium nachkultiviert, um reine Kulturen zu erhalten. Um den insektenpathogenen Pilz zu isolieren, werden tote Insekten aus Feldern gesammelt. Die Sporen von mykotischen Kadavern werden durch Übertragung in Tween 80 und anschließendes Vortexen getrennt.Die Sporensuspension wird anschließend auf einer Agarplatte ausgestrichen. Reinkulturen werden durch weitere Subkultivierung auf dem gleichen Medium erhalten. Zur Anzüchtung entomopathogener Pilze aus Boden werden Reismalzlarven verwendet.Vier Reismalzlarven werden in ein Gefäß mit einer 60-Gramm-Bodenprobe gegeben. Die Gefäße werden bei 28 Grad inkubiert. Da sich diese Larven normalerweise tief in den Boden bewegen, werden die Gefäße täglich bis zu 14 Tage lang auf den Kopf gestellt, um den Kontakt der Larven mit den Pilzsporen im Boden zu erleichtern.Die toten Larven werden von Zeit zu Zeit entnommen und zur Sporulation in einem Feuchtinkubator aufbewahrt. Das Verfahren zur Isolierung des Pilzes ist dasselbe wie das für Insektenkadaver. Nachdem reine Kulturen gewonnen wurden, werden die Isolate auf PDA-Anstellröhrchen kultiviert, und die Stammkulturen werden bis zur Verwendung bei acht Grad Celsius aufbewahrt.Zur Identifizierung der Pilze wird genomische DNA aus der Myzelmasse extrahiert. Zur Identifizierung von Metarhizium-Isolaten werden die Primer fünf-Prime, drei-Prime, ITS1 und ITS4 verwendet. Die Amplikone der erwarteten Größe werden aus dem Gel eluiert, quantifiziert und sequenziert.Die Sequenzen wurden anschließend mit der NCBI-GenBank-Datenbank abgeglichen, um die Isolate auf Art-Ebene zu identifizieren. Bodenproben und tote Insekten, die aus den Distrikten Pune und Buldana in Maharashtra, Indien, gesammelt wurden, ergaben 68 unterschiedliche Isolate von Metarhizium. Davon wurden 58 aus Böden und 10 aus Insekten isoliert.55 waren Metarhizium anisopliae, acht waren Metarhizium flavoviridae und fünf waren Metarhizium robertsii. Die Sporen aus den Schrägen werden 10 ml Tween 80 zugesetzt und vortexiert. Für den Insekten-Bioassay wird die Sporenkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmt.Und die Konzentration wird auf 10 hoch sieben Sporen pro ml eingestellt. Ein Satz von 30 Larven wird verdreifacht einzeln fünf Sekunden lang in eine 10-ml-Sporensuspension jedes Metarhizium-Isolats getaucht. Für Insekten-Bioassays werden späte Larven des zweiten oder frühe Larven des dritten Entwicklungsstadiums von Helicoverpa armigera verwendet.Nach der Behandlung wird jedes Larve in ein steriles Röhrchen überführt, das mit feuchtem Whatman-Filterpapier Nummer eins und einem Stück desinfizierter Okra als Nahrung versehen ist. Als Kontrolle dient ein Satz von 30 Larven, die in dreifacher Ausführung mit 0,1 % Tween 80 in steriler destillierter Wasser behandelt werden. Die Larven werden so lange gehalten, bis sie sterben, und bis zu 14 Tage lang beobachtet.Diese Schritte wurden für alle 68 Isolate wiederholt. Die prozentuale Mortalität wird durch Zählen der toten und lebenden Larven ermittelt. Die toten Larven werden in sterile Petrischalen überführt, die meist mit Wattebäuschen versehen sind, und für drei bis sieben Tage bei 28 Grad Celsius und 70 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit zur Mykose und Sporulation aufbewahrt.Die Daten zur prozentualen Mortalität aus drei Experimenten werden zusammengefasst, um Durchschnittswerte zu erhalten, die anschließend mit der Abbott-Formel korrigiert werden. 12 Metarhizium-Isolate, die eine Mortalität von mehr als 90 % aufwiesen, wurden zur Bestimmung der medianen letalen Zeit gegenüber Larven des dritten Stadiums von Helicoverpa armigera ausgewählt. Basierend auf den LT50-Werten wurden fünf Isolate identifiziert, die schneller bei der Tötung von Insekten wirken.Die medianen letalen Konzentrationen für die identifizierten fünf Isolate wurden mithilfe von vier verschiedenen Konzentrationen der Sporensuspension bestimmt. Basierend auf den LC50-Werten wurden drei Metarhizium-Isolate für die Sporenproduktion durch feste Fermentation ausgewählt. Das YPD-Medium wird hergestellt und durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten sterilisiert.Sporen von den Haltungsansätzen werden in 0,1 % Tween 80 überführt. Die Sporensuspensionen der drei ausgewählten Metarhizium-Isolate werden dem YPD-Medium zugesetzt. Die Kolben werden anschließend auf einem Rüttler inkubiert.Autoklavierbare Unicorn-Beutel, die mit zwei Kilogramm Reis gefüllt sind, werden über Nacht in einem Liter destilliertem Wasser eingeweicht und anschließend bei 121 Grad Celsius 45 Minuten lang autoklaviert. Die feste Fermentation wurde an Substraten wie Reis, Sorghum, Mais und Weizen getestet. Unter den getesteten Substraten förderte Reis die maximale Sporulation von Metarhizium-Isolaten.Die Beutel werden mit 48 Stunden altem Mycel mit einer Konzentration von 10 % inoculiert. Dieses wird gründlich vermischt und 14 Tage lang inkubiert. Die Sporen können mit verschiedenen Methoden geerntet werden.Zur Isolierung mit Mycoharvester und Vibrosifter werden die Beutel mit sporuliertem Mycel zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius getrocknet, um den Feuchtigkeitsgehalt auf unter 20 % zu senken. Die flüssige Extraktion ist eine effizientere Methode. Der Reis mit Sporen wird in große Gefäße gegeben. 0,1 %iges Tween 80 wird in die Gefäße gegossen, und das Gemisch wird gründlich umgerührt.Das Überstand wird filtriert, um eventuelle Reispartikel zu entfernen. Die Sporen werden durch Zentrifugation angereichert und getrennt. Anschließend werden die Sporen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius getrocknet.Diese Sporen können bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden. Um die Haltbarkeit während der Lagerung zu verlängern, wird Talkum hinzugefügt und mit den Sporen vermischt. Damit die Sporen wirksam sind, müssen sie lebensfähig sein, weshalb der Isolat identifiziert werden muss, der die maximale Anzahl an lebensfähigen Sporen liefert.Die Sporensuspensionen werden in 0,1 % Tween 80 hergestellt und die Konzentration auf 10 hoch sieben Sporen pro ml eingestellt. 10 µl der Sporensuspension werden in dreifacher Ausführung auf PDA-Objektträgern aufgetragen und anschließend inkubiert. Innerhalb von 12 Stunden beginnen die vitalen Sporen zu keimen.Nach 12 Stunden werden die Keimschläuche bildenden Sporen mikroskopisch gezählt. Die Hydrophilie der Sporen ist wichtig, damit der Pilz an der Insektenkutikula haften kann. Eine Sporensuspension in Ammoniumsulfat und Tween 80 wird in einer Kürette aufgenommen.Die andere Probe, ohne Sporen, dient als Kontrolle. Die Konzentration der Sporensuspension wird so eingestellt, dass sie etwa sieben bis zehn hoch sieben Sporen pro ml beträgt, um eine anfängliche Extinktion von 0,6 bei 540 Nanometern zu erreichen. Die Küvetten werden etwa sechs Stunden lang ungestört stehengelassen, damit sich die Sporen absetzen können.Die Absorption wird aufgezeichnet und die Zeit für eine 50 %ige Zufuhr berechnet. Basierend auf den Ergebnissen wurde ein Stamm für den Einsatz im Feld ausgewählt. Die anderen beiden dienten als Reservestämme.Die Feldleistung von Sporen des ausgewählten Metarhizium-Isolats M34412 zur Bekämpfung von Helicoverpa armigera-Befall an der Pigeon-Pea-Pflanze wurde nach einem randomisierten Blockdesign mit vier Wiederholungen durchgeführt. Es gibt zwei verschiedene Sprühformulierungen. Die Formulierung in 0,1 % Tween 80 wird mit einem Rückensprüher aufgebracht.Eine Ölformulierung von Sporen wird mit einem Ultraniedrigvolumen-Sprüher versprüht. Das Besprühen erfolgt entweder morgens oder abends. Der erste Einsatz erfolgt während des Blühstadiums und wird zwei weitere Male im Abstand von 14 Tagen wiederholt.Helicoverpa armigera werden am Tag null, drei, fünf, sieben und vierzehn nach der Applikation gesammelt und zur Mykoseentwicklung in einer Feuchtekammer aufbewahrt. Während der Feldversuche zur Bekämpfung von Helicoverpa armigera im Kichererbsenanbau wurde mit Metarhizium anisopliae M34412 eine Wirksamkeit von über 70 % erzielt. Die Schotenbefallsschäden in den mit Metarhizium anisopliae behandelten Parzellen waren geringer als in den mit chemischem Pflanzenschutzmittel behandelten und unbehandelten Kontrollparzellen.Die Kichererbsenblätter werden auf mögliche Wirkungen durch die Diesel-Sonnenblumenöl-Formulierung des Mycoinsektizids untersucht. Im Boden lebende Arthropoden und auf den Blättern vorkommende Insekten wurden aus den mit Metarhizium anisopliae behandelten Parzellen gesammelt. Es wurde keine schädliche Wirkung auf nicht-zielgerichtete Arthropoden beobachtet.Die Demonstrationsversuche wurden in einem Dorf, doo-lally-pra-va-da, mit der Teilnahme von 20 Landwirten durchgeführt. Die Formulierung wirkt effektiv gegen andere Insektenschädlinge wie fettige Drahtwürmer, gefleckte Schotenwürmer, Mehlwanzen, wollige Blattläuse und Mücken. Die Experimente ermöglichten die Identifizierung der wesentlichen Parameter zur Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Mycoinsektiziden.Die Keimfähigkeit der Sporen sollte auf PDA nach 16 Stunden bei 28 Grad Celsius und 70 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit über 90 % liegen. Die Mortalität von Helicoverpa armigera sollte in der Labor-Bioassay mit 10 hoch 7 Sporen über 90 % betragen. Bei wiederholter Subkultivierung auf künstlichem Labormedium verliert der Organismus seine Virulenz.Nach der Kultivierung des Pilzes in Chitin-Medium für 72 Stunden werden die Aktivitäten von kutikulaabbauenden Enzymen wie Chitinase, Chitin-Deacetylase, Chitosanase, Protease und Lipase gemessen. Diese dienen als biochemische Marker für Virulenz. Zur Verdauung der Chitinase-Gene wurden vier verschiedene Kombinationen aus jeweils drei Restriktionsenzymen verwendet.Die Isolate mit einer Mortalität von über 90 % wiesen das spezifische Muster für alle drei Gene auf. Diese Muster zeigen eine signifikante Korrelation mit den von Metarhizium-Isolaten extrazellulär produzierten kutikuladegradierenden Enzymprofilen. Wir schlagen erstmals vor, die Chitinase-Aktivität und das PCR-Muster des Chitinase-Gens als Virulenzmarker zu verwenden.Dies kann als Qualitätsindikator für die Produktion im kommerziellen Maßstab dienen. Um das Produkt kosteneffizienter zu gestalten, können wir die Förderung des Pflanzenwurzelwachstums durch Myzel-Biomasse einsetzen. Es kann außerdem zur Isolierung von Chitosanase für Anwendungen im Gesundheitswesen verwendet werden.Diese wertschöpfenden Produkte werden dieses auf Metarhizium basierende Mycoinsektizid rentabler machen.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

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Entomopathogene Pilze haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. In dieser Studie wurde die Massenproduktion einer ausreichenden Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen südafrikanischer Isolate von Metarhizium robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge erfolgreich unter Verwendung von landwirtschaftlichen Getreideprodukten durchgeführt.

Massenproduktion von entomopathogenen Pilzen, Metarhizium robertsii und Metarhizium pinghaense, zur kommerziellen Anwendung gegen Insektenschädlinge

Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

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