Name: Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Erfahren Sie das Twin-Spot MARCM-Protokoll für hochauflösende Zell-Linie-Analysen und Genfunktionsstudien in Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung neuronaler Entwicklung mit zwei Farbmarkern.

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Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2311-B-001-034) und dem Institut für Zelluläre und Organismische Biologie, Academia Sinica, Taiwan unterstützt wurde.

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene 11, 13 <ol><li> Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 11 (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um 13 mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter, mCD8 :: GFP; Expression des Transgens unter der Kontrolle des Upstream - Aktivierungssequenz Promotor ist, die eine Membran-gebundenen Reporter erzeugt von Maus - Cluster von Proteindifferenzierung 8 mit grün fluoreszierenden Protein fusioniert) und UAS-rCD2RNAi (Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt, die RNAi gegen die Expression von Ratten - Cluster of Differenzierung 2, RCD2) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Ort gewebespezifische -GAL4 Treiber auf dem X oder 3. Chromosom, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene von FRT 40A, UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter, RCD2 :: RFP, die andere Membran-gebundenen Reporter aus RCD2 Protein mit rot fluoreszierendes Protein fusioniert) und UAS-GFPRNAi (der Suppressor, der die Expression mCD8 :: GFP hemmt, die RNAi gegen die Expression von gfp) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 nd. Platzieren Hitzeschock (hs) -FLP oder Gewebe-Spezifität FLP auf das X oder 3. Chromosom, wenn möglich. </li></ol></li><li> Generieren Sie die neue Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 14 (siehe Tabelle 1). Führen Sie Standard-fly genetischen Kreuzungsschemata, die p beschrieben wurdenreviously, durch mehrere Transgene in den gleichen Flug Aktien 13 setzen. <ol><li> In einer Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (ein kombiniertes Transgen mCD8 :: GFP und den Suppressor, die die Expression von RCD2 :: RFP hemmt) zusammen im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (entsprechende Paare von Transgenen von FRT und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sind in Tabelle 1 angegeben). Platzieren gewebsspezifische-GAL4 - Treiber auf den Chromosomen anderen als dem Chromosom des gewählten FRT - Stelle, falls möglich. </li><li> In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI (den anderen verbundenen Transgen RCD2 :: RFP und den Suppressor, die die Expression von mCD8 :: GFP hemmt) im selben Arm der 2. oder 3. Chromosom (geeignete Paare von Transgenen von FRT </em&gt; und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI sind in Tabelle 1) angegeben. Ort hs-FLP oder gewebespezifische FLP-on Chromosome anderen als dem Chromosom des Standortes gewählt FRT, falls möglich. </li></ol></li></ol> 2. Quer tsMARCM-ready Fliegen zu tsMARCM Klone in ihren Nachkommen generieren <ol><li> Kreuz tsMARCM-ready Fliegen zusammen (zB setzen 10-15 männlichen Fliegen aus Schritt 1.1.1 oder 1.2.1 und 20-30 jungfräulichen Weibchen aus Schritt fliegt 1.1.2 oder 1.2.2 zusammen) in einem Fly-Essen Fläschchen mit frischem -Aus Hefe-Paste an der Wand des Gefäßes. </li><li> Pflegen Sie die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen bei 25 ° C für 2 Tage, um die Chance der Paarung zu verbessern, bevor befruchteten Eier zu sammeln. </li><li> Häufig übertragen die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen in frisch yeasted Fläschchen Verdrängung zu vermeiden (tippen Sie die Fliegen oder Kohlendioxid verwenden, um die Fliegen zu betäuben den Transfer zu erleichtern, halten nicht mehr als 80 bis 100 befruchtete Eier in einen 10-ml Fliegen-Food überl zu vermeiden, dass zu viele geschlüpften Larven). </li><li> Kultur die tsMARCM Tiere (dh befruchtete Eier, ein Beispiel des Genotyps tsMARCM Tiere, wie verwendet in Abbildung 3 ist hs-FLP [22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +), die in den seriell übertragen Fläschchen bei 25 ° C gelegt wurden , bis sie auf die gewünschten Stufen (zB Embryonen, Larven entwickeln, oder Puppen). </li><li> Legen Sie die übertragenen Fläschchen, die tsMARCM Tiere in der gleichen Entwicklungsstufe zu einem 37 ° C Wasserbad enthalten für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten, um die optimale Zeit der Hitzeschock, um zu bestimmen, welche die Expression von FLP induziert zu erzeugen, die tsMARCM Klone von Interesse. Überspringen Sie diesen Schritt , wenn Gewebe-Spezifität FLP ist in der tsMARCM Experiment verwendet wird (hs-FLP ist für neuronale Linie bevorzugt analysiert; die Gründe für diese Einstellung zuvor 15 beschrieben worden ist). HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.5 die optimale Zeit des Hitzeschock in Zukunft tsMARCM Experimente, wenn mehr tsMARCM Klone von Interesse verwendet werden wollte; Im Allgemeinen wird in hs-FLP mehr FLP Expression induziert [22] im Vergleich zu hs-FLP [1] mit der gleichen Hitzeschock - Zeit. </li><li> Kultur, die einem Hitzeschock tsMARCM Tiere bei 25 ° C, bis sie die entsprechende Entwicklungsstufe erreicht, und dann gehen Sie zu Schritt 3. </li></ol> 3. Bereiten Sie, Beize und Mount Fly Gehirne mit einem Gehalt tsMARCM Clones <ol><li> Bereiten Sie zangen Schutz Gerichte. Mischen Sie Teil A (30 g) und Teil B (3 g) des Silikon-Elastomer-Kit mit Aktivkohle (0,25 g). Gießen Sie die Mischung in die entsprechenden Gerichte. </li><li> Präparieren Larven-, pupal oder Erwachsenen-Gehirn aus der tsMARCM Tiere in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Zange auf einem zangenSchutzSchale betrachtet durch eine Dissektion Mikroskop. HINWEIS: Ein Protokoll für das Fliegen Gehirnsezierung wurde abribed 16 zuvor. </li><li> Fix the fly Gehirn in einem Glas Tüpfelplatte mit 1x PBS für 20 min 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur enthält. Verarbeiten Sie die Fliege Gehirne in diesem Glas Tüpfelplatte für den Rest der Schritte. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT (1x PBS mit 1% Triton X-100) und waschen Sie sie dreimal für je 30 min in 1% PBT (rinse: entfernen PBT und fügen Sie neue PBT schnell; waschen: entfernen PBT, fügen Sie neue PBT, und brüten die Fliege Gehirne in der neuen PBT einen Orbitalschüttler verwenden). </li><li> Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel der Mischung aus primärem Antikörper ist Ratte anti-CD8-Antikörper (1: 100), Kaninchen-Anti-DsRed-Antikörper (1: 800) und Maus-Anti-Bruchpilot (BRP) Antikörper (1:50) in 1% PBT, enthaltend 5% normalem Ziegenserum (NGS). </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. </li><li&gt; Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus sekundären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel für die Mischung von Sekundärantikörper ist Ziege-anti-Ratte-IgG-Antikörper mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist (1: 800), Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit gelb-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) und Ziege-anti-Maus konjugierte IgG-Antikörper mit weit rot-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) in 1% PBT mit 5% NGS. </li><li> Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. Montieren sie auf einem Mikroobjektträger mit einem Anti-Quenching-Reagenz. Setzen Sie ein Mikrodeckglas auf der Mikro Dia-the-fly Gehirne zu bedecken und zu schützen. Seal die Ränder des Mikrodeckglas und Mikro-Schlitten mit klarem Nagellack. Bewahren Sie diese montiert und versiegelt Gehirn Proben bei 4 ° C fliegen. </li></ol> Nehmen 4., Prozess- und Analysieren Fluoreszenzbilder von tsMARCM Clones <ol><li> Erfassen Fluoreszenzbilder von tsMARCM Klone from die Proben in Schritt 3.8 mit der konfokalen Mikroskopie System der Wahl erstellt. </li><li> Projektstapel tsMARCM konfokalen Fluoreszenzbildern in zweidimensionalen, abgeflachten Bilder die Bildverarbeitungs - Software mit dem konfokalen Mikroskopiesystem der Wahl zugeführt (siehe Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O und 3Q - 3T für Beispiele von abgeflachten konfokale Fluoreszenzbilder). </li><li> Zählen der Zellanzahl der mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone eine geeignete Bildverarbeitungssoftware (beispielsweise die &quot;Zellzähler&quot; -Funktion in ImageJ 17; siehe Figur 3E, 3J, 3O und 3T für die Beispiele der Zelle Leichen von Neuronen). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und die durc...

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung 1, 2. Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen 3 (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen 4. MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System 4 ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor - Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr 4 blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB - Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen - Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien 5, 6, 7, 8, 9, 10. Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere 11, 12. Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen - Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden 11 ( 2A - 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA - Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion 11, 12. Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

<table><tbody><tr><td>Kohlendioxid (CO2)</td>Lokaler <td>Anbieter</td><td>n.a.Anästhesiefliegen</td><td></td></tr> <tr><td>CO2 Pad Lokaler</td><td>Anbieter</td><td>n.a.Fliegensortierung</td><td>, Kreuzung und Transfer von Fliegen</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7,4</td><td>Uniregion Bio-Tech (oder andere Anbieter)</td><td>PBS001</td><td>Präparieren, Spülen, Waschen und Immunfärben von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Fliegengehirne reparieren</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Fliegengehirne spülen, waschen und immunfärben</td></tr><tr><td>Normale Ziege</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD8 Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-DsRed Antikörper</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Anti-Brp-Antikörper von Mäusen</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Anti-Ratten-IgG-Antikörper von Ziegen, konjugiert mit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper von Ziegen, konjugiert mit Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG-Antikörper von Ziegen, konjugiert mit Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifading-Reagenz</td><td>Molekulare Sonden</td><td>S36936</td><td>Fliegengehirne montieren und Fluoreszenzlöschung schützen</td></tr><tr><td>PYREX 9 Depression Glas</td><td>Spot Plate Corning</td><td>7220-85</td><td>Präparieren, Spülen, Waschen und Immunfärben von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Herstellung von schwarzen Sylgard Schalen zum Schutz der Pinzette während der Dissektion des Gehirns Aktivkohle</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>Herstellung von schwarzen Sylgard Schalen</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11252-30</td><td>Fliegengehirne sezieren und montieren</td></tr><tr><td>Mikroobjektträger</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>Fliegengehirne montieren</td></tr><tr><td>Mikro-Deckglas Nr. 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>Fliegengehirne montieren</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Lokaler Anbieter</td><td>nicht verfügbar</td><td>Mikro-Deckglas auf Objektträgern versiegeln</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Die LTI603-Kultur</td> von <td>Kansin Instruments</td><td>fliegt bei 25 & Grad; C</td></tr> <tr><td>(oder andere Anbieter)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wasserbad</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>Induzieren Sie einen Hitzeschock bei Fliegen bei 37 & Grad; C</td></tr> <tr><td>(oder andere Anbieter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>Wasch- und Immunfärbung von Fliegengehirnen</td></tr> <tr><td>(oder andere Anbieter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>Fliegensortierung, Kreuzung und Transfer; Präparieren, Spülen, Waschen und Immunfärben von Fliegengehirnen</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss (oder andere Anbieter)</td><td>LSM 700 (oder andere Modelle)</td><td>Image tsMARCM Klone</td></tr><tr><td>Bildbearbeitungssoftware 1 (z.B. , Zeiss LSM Image Browser)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>nicht verfügbar</td><td>Projektstapel mit Bildverarbeitungssoftware für konfokale Bilder</td></tr><tr><td>2 (z.B. , ImageJ)&nbsp;</td><td>nicht verfügbar</td><td>nicht verfügbar Anzahl</td><td>der Zellen Anzahl der tsMARCM-Klone</td></tr></tbody></table>

zell lineage analysen und genfunktion studien mit twin-spot marcm

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen 11, 12, 18 (si...

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Twin-Spot-MARCM-Protokolls besteht darin, zelluläre Stammbaumanalysen mit hoher Auflösung durchzuführen und detailliertere Untersuchungen zur Genfunktion zu ermöglichen. Da das Gehirngewebe aus einer Vielzahl unterschiedlicher Neuronen besteht, ist es schwierig, die Mechanismen zu erforschen, die der Zusammenlagerung von Neuronen während der Entwicklung zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, Neuronen, die von gemeinsamen neuronalen Vorläuferzellen abstammen, in zwei unterschiedlichen Farben zu markieren. die es ermöglichen, den Zeitpunkt der Entstehung der Information einzelner Neuronen zu ermitteln. Daher kann diese Technik Forschern helfen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen, zu untersuchen. Die heutige Demonstration des Verfahrens übernimmt Pei-Chi Chung.Ein Techniker aus dem Labor von Professor Yu. Beginnen Sie damit, männliche und weibliche Fliegen mit bereitgestelltem Twin-Spot-MARCM-System in ein Fläschchen mit Nährmedium und frischem Hefe zu geben. Halten Sie die gekreuzten, für den Twin-Spot-MARCM geeigneten Fliegen zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius, um die Wahrsch

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

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Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

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