Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM
2. März 2017
Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.
Das übergeordnete Ziel dieses Twin-Spot-MARCM-Protokolls besteht darin, zelluläre Stammbaumanalysen mit hoher Auflösung durchzuführen und detailliertere Untersuchungen zur Genfunktion zu ermöglichen. Da das Gehirngewebe aus einer Vielzahl unterschiedlicher Neuronen besteht, ist es schwierig, die Mechanismen zu erforschen, die der Zusammenlagerung von Neuronen während der Entwicklung zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, Neuronen, die von gemeinsamen neuronalen Vorläuferzellen abstammen, in zwei unterschiedlichen Farben zu markieren.
die es ermöglichen, den Zeitpunkt der Entstehung der Information einzelner Neuronen zu ermitteln. Daher kann diese Technik Forschern helfen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen, zu untersuchen. Die heutige Demonstration des Verfahrens übernimmt Pei-Chi Chung.
Ein Techniker aus dem Labor von Professor Yu. Beginnen Sie damit, männliche und weibliche Fliegen mit bereitgestelltem Twin-Spot-MARCM-System in ein Fläschchen mit Nährmedium und frischem Hefe zu geben. Halten Sie die gekreuzten, für den Twin-Spot-MARCM geeigneten Fliegen zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius, um die Wahrscheinlichkeit einer Paarung zu erhöhen, bevor befruchtete Eier gesammelt werden.
Um eine Überbelegung nach dem Schlüpfen der Larven zu vermeiden, klopfen Sie die gekreuzten Twin-Spot-MARCM-Fertigfliegen vorsichtig ab und überführen Sie sie in frisch mit Hefe bestreute Gefäße. Kultivieren Sie die Nachkommen des Twin-Spot-MARCM, bis sie den gewünschten Entwicklungsstand erreicht haben. In diesem Fall werden die Fliegen im Larvenstadium einer Hitzeschockbehandlung unterzogen, um die Expression der Flippase zu induzieren.
Überführen Sie die Flaschen mit Fliegen für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die optimale Hitzeschockdauer für die Flippase-Expression zu bestimmen, um die gewünschten twin-spot MARCM-Klone zu erzeugen. Der Zeitpunkt des Hitzeschocks bestimmt das Entwicklungsstadium der Klonbildung, während die Dauer des Hitzeschocks festlegt, wie viele Klone gebildet werden.
Kultivieren Sie die hitzeschockbehandelten Twin-Spot-MARCM-Tiere bei 25 Grad Celsius, bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Fahren Sie anschließend mit der Färbung und Einbettung fort. Geben Sie PBS zu den Pinzetten-Schutzschalen hinzu.
Überführen Sie dann die Twin-Spot-MARCM-Tiere in die Schalen. Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop Pinzette, um die Gehirne aus den Twin-Spot-MARCM-Tieren zu präparieren. Entfernen Sie zuerst den Kopf vom Körper der Fliege.
Entfernen Sie dann vorsichtig die Cuticula, ohne das Gehirn zu beschädigen. Anschließend entfernen Sie sorgfältig die Tracheen, die als weißliche Fasern erscheinen. Überführen Sie die Gehirne in eine Glas-Objektträgerplatte, die 4 % Formaldehyd und PBS enthält.
Und 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Beginnen Sie die Färbeprozedur, indem Sie die Fliegenhirne dreimal mit 1% PBT spülen und anschließend dreimal mit 1% PBT waschen.
Unter Schütteln jeweils 30 Minuten. Inkubieren Sie die Fliegenhirne über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur mit einer Mischung aus primären Antikörpern. Spülen und waschen Sie die Fliegenhirne jeweils dreimal mit 1 % PBT unter Schütteln wie zuvor.
Anschließend inkubieren Sie die Fliegengehirne vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem Gemisch sekundärer Antikörper. Nach dem erneuten Spülen und Waschen der Gehirne wie zuvor werden die Gehirne mit einem Antifade-Reagenz auf einem Objektträger montiert. Danach legen Sie ein Deckglas auf, um die Fliegengehirne zu bedecken und zu schützen.
Versiegeln Sie die Ränder des Mikro-Deckglases und des Objektträgers mit klarem Nagellack. Schließlich nehmen Sie fluoreszierende Bilder von Twin-Spot-MARCM-Klonen aus den Proben mithilfe des gewünschten konfokalen Mikroskopiesystems auf. Diese Abbildung zeigt Ergebnisse aus dem Twin-Spot-MARCM-Klon, einem anterodorsalen olfaktorischen Projektionsneuron des Typs VL2p, das durch die Induktion von Flippase hervorgerufen wurde.
Um die meiotische Rekombination im adPN-Neuroblasten im embryonalen Stadium zu vermitteln. Dieses erste Diagramm zeigt das Neurogenesemuster. In dieser konfokalen Mikroskopieaufnahme des Gehirns sind die VL2p-adPNs grün dargestellt und assoziiert mit multizellulären Neuroblasten-adPNs in Magenta.
Dieses Bild zeigt die Zellen im lateralen Horn. Hier ist die neuronale Morphologie des antenalen Lobus zu sehen. Dieses Bild zeigt die Daten für DL1 adPNs.
Wie hier zu sehen ist, treten die DL1-adPNs in der Entwicklung später auf als die VL2p-adPNs. Die Induktion von Twin-Spot-MARCM-Klonen von DC3-adPNs zeigt, dass dieser Neuronentyp später in der Entwicklung erscheint. Dieses Bild zeigt, dass das Twin-Spot-MARCM-Ereignis in einem GAL4-negativen Neuron innerhalb der adPN-Linie stattfindet.
Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, kann sie Forschern helfen, die neuronale Linie zu analysieren und verschiedene Marker bereitzustellen, um Neuronen von Neuroblasten-Klonen zu unterscheiden. Außerdem kann die Twin-Spot-MARCM-Methode homozygote Mutantenklone erzeugen, um molekulare Mechanismen in einem heterozygoten genetischen Hintergrund zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Twin-Spot-MARCM-Protokoll vor, das für hochauflösende Zelllinienanalysen und Genfunktionsstudien in Neuronen konzipiert ist. Durch die Markierung von Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen mit zwei unterschiedlichen Farben können Forscher die Entwicklung und Altersbestimmung einzelner Neuronen effektiv verfolgen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Gehirngewebe besteht aus einer vielfältigen Ansammlung von Neuronen.
- Das Verständnis der Neuronenanordnung während der Entwicklung ist komplex.
- Aktuelle Techniken liefern möglicherweise nicht ausreichend Auflösung für die Herkunftsspurverfolgung.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, diese Herausforderungen zu bewältigen.
Zweck der Studie
- Für detaillierte Analysen der Zelllinien.
- Zur Verbesserung von Untersuchungen zur Genfunktion in Neuronen.
- Zur Erleichterung der Erforschung zellulärer und molekularer Mechanismen in der neuralen Entwicklung.
Verwendete Methoden
- Zwillingsfleck-MARCM-Protokoll zur Neuronenmarkierung.
- Verwendung unterschiedlicher Farbmarker für die Linienträgung.
- Hochauflösende Bildgebungstechniken.
- Analyse der neuronalen Entwicklung und Genfunktion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Markierung von Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen.
- Möglichkeit, Geburtsinformationen einzelner Neuronen zu ermitteln.
- Verbessertes Verständnis der neuronalen Abstammung und Entwicklung.
- Potenzielle Anwendungen bei der Untersuchung der Genfunktion in verschiedenen Individuen.
Schlussfolgerungen
- Das Twin-Spot-MARCM-Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug für die Neurowissenschaftsforschung.
- Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der neuronalen Linie und der Genfunktion.
- Diese Technik kann unser Verständnis der neuralen Entwicklung erheblich voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Verständnis der neuronalen Linie und der Genfunktion in Modellorganismen liefert grundlegende Erkenntnisse für die Zielvalidierung in der Entwicklung von Neurotherapeutika. Die Twin-Spot-MARCM-Technik ermöglicht eine hochauflösende Kartierung der Reihenfolge der Neuronenbildung und die phänotypische Analyse genetisch identischer Neuronen über verschiedene Individuen hinweg, wodurch eine mechanistische Entschärfung im frühen Entdeckungsstadium unterstützt wird. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem er Entwicklungsmechanismen mit funktionellen Ergebnissen in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Verfolgung der neuronalen Linie von gemeinsamen Vorläufern zur Beurteilung der Genfunktion in definierten Zellpopulationen.
- Operativer Wert: Erleichtert die biologische Risikominimierung durch phänotypische Analyse homozygoter Mutantenklone in heterozygoten Hintergründen und verringert damit mechanistische Unschärfen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem quantitative Linien-Daten bereitgestellt werden, die mit Mechanismen neurodevelopmentaler Erkrankungen korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte, farbkodierte neuronale Systeme, die für die anschließende Wirkstoff-Screening in krankheitsrelevanten neuronalen Schaltkreisen geeignet sind.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch induzierbare, stadienspezifische, klonale Erzeugung, die durch die Dauer der Hitzeschockbehandlung gesteuert wird.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über mehrere neuronale Subtypen hinweg (z. B. adPN-Linien) für vergleichende phänotypische Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Nutzen: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem er die Analyse der Geburtsreihenfolge von Neuronen ermöglicht, die bei neurodevelopmentalen Störungen beteiligt sind.
- Mechanistische Ent风险minderung: Ermöglicht die phänotypische Analyse identischer Neuronen über verschiedene Tiere hinweg, um genetische von stochastischen Variabilitäten in Genfunktionsstudien zu unterscheiden.
- Präklinische Kontinuität: Verbindet Entdeckung und Validierung, indem er linienaufgelöste Daten für Target-Engagement- und Signalwegmodulationsstudien bereitstellt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Twin-Spot-MARCM-Methode ist in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien integriert, insbesondere für neurodevelopmentelle Indikationen, bei denen neuronaler Ursprung und Vernetzung entscheidend sind.
- Entdeckungsbereich Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem genetische Störungen mit linienabhängigen neuronalen Phänotypen verknüpft werden.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare neuronale Präparationen bereit, die quantitative Ergebnisse basierend auf dem klonalen Entstehungszeitpunkt und der Markerausprägung liefern.
- Analytik: Ermöglicht den vergleichenden Analysen der neuronalen Morphologie und Genexpression über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg unter Verwendung von Dual-Farben-Signalen.
- Translationale Forschung: Schließt an die präklinische Validierung an, indem linienübergreifende Modelle zur Modulation zielgerichteter Biomarker bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Kapazität zur Erzeugung standardisierter neuronaler Kohorten über Projekte und Modellsysteme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, indem verwandtschaftsbezogene Störfaktoren in Genfunktionsstudien reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch kontrollierte klonale Induktion sowie standardisierte Färbungs- und Montageprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühzeitige Erkennung linien-spezifischer phänotypischer Effekte ermöglicht wird und damit biologische Risiken in späteren Stadien verringert werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem mechanistische Klarheit bezüglich neuronaler Zielstrukturen in heterogenen Geweben geschaffen wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Drosophila-Genetik, Techniken zur Klonmarkierung und konfokaler Mikroskopie für eine genaue Interpretation der Linienabstammung.
- Benötigt spezifische Geräte wie einen Hitzeschock-Apparat, Auflichtmikroskope für die Dissektion und konfokale Abbildungssysteme zur Induktion und Visualisierung von Klonen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Dauer des Hitzeschocks, den Färbeprotokollen und den Bildaufnahmeparametern voraus, um die Klonkonsistenz zwischen verschiedenen Anwendern sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere neuronale Linien oder Entwicklungsstadien angewendet wird, die über das hier gezeigte adPN-Modell hinausgehen.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Abhängigkeit der klonalen Effizienz von der Dauer des Hitzeschocks sowie die Notwendigkeit einer Optimierung je Ziel-Linie, wie im Protokoll beschrieben.
