Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die alloreaktive Aktivität von T-Zellen mittels bildgebender Durchflusszytometrie zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Transplantationsimmunologie zu beantworten, beispielsweise welcher Anteil der T-Zellen eines Empfängers auf allogene Antigene des Spenders reagiert. Diese Technik kombiniert die multiparametrischen quantitativen Möglichkeiten der Durchflusszytometrie mit den bildgebenden Fähigkeiten der fluoreszenzmikroskopischen Analyse, um die hochdurchsatzfähige Untersuchung einzelner Synapsen zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen zu ermöglichen.

Den Ablauf wird Sajad Moshkelgosha, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, 0,5 × 10⁶ dendritische Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Zellkulturplatte zu säen, gefolgt von 1 × 10⁶ T-Zellen und einem endgültigen Gesamtvolumen von bis zu 50 µL Kulturmedium pro Vertiefung.

Die kalten Kulturen vier Stunden bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren. Anschließend das Dreifache des Kulturvolumens an 1,5 % Formaldehyd in PBS zu jedem Well für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Fixierung die Zellen aus jedem Well in ein entsprechendes 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführen.

Färben Sie die Zellen mit den geeigneten fluorochromkonjugierten Antikörpern in 100 µL Waschpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Anschließend waschen Sie die Zellen in 1 mL Waschpuffer und resuspendieren die Pellets in Perm/Wash-Puffer, der Phalloidin-FITC enthält. Nach weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, waschen Sie die Zellen in 1 mL frischem Perm/Wash-Puffer.

Suspendieren Sie die Pellets in dem gewünschten Kernfarbstoff in Permeabilisierungs-/Waschpuffer und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Permeabilisierungs-/Waschpuffer, gefolgt von einer Wäsche mit Waschpuffer allein. Suspendieren Sie die Zellen anschließend in 50 bis 100 Mikrolitern frischem Waschpuffer.

Überführen Sie die Zellen in kleine verschließbare Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Zell-Zell-Interaktionen zu analysieren, reservieren Sie zunächst einen Kanal für die Aufnahme von Hellfeldbildern und laden Sie das erste Kontrollröhrchen. Mit ausgeschaltetem Hellfeldkanal erstellen Sie im Arbeitsbereichsfenster für jeden verwendeten Kanal ein neues Streudiagramm mit dem Seitenverhältnis über der Fläche.

Die Singletts eingeben, bei denen das Seitenverhältnis nahe bei eins liegt. Für jeden Fluorochrom die positive Population überprüfen und die Laser-Spannung im Beleuchtungsfeld gegebenenfalls anpassen. Im Kanäle-Feld die geeigneten Kanäle für die bei der Färbung verwendeten Fluorochrome auswählen.

Klicken Sie dann auf „Aufzeichnen“. Wenn die Anzahl der Ereignisse den festgelegten Schwellenwert erreicht, wird die Datenaufnahme automatisch gestoppt. Nachdem alle Einzelfärbungs-Kontrollen aufgenommen wurden, laden Sie das erste experimentelle Probenröhrchen und nehmen mehrere zehntausend Ereignisse unter den geeigneten Analysekanälen einschließlich des Hellfeldkanals auf.

Um eine Kompensationsmatrix zu erstellen, laden Sie die Einzelfärbungs-Kontrolldateien in den Kompensationsassistenten und wählen die entsprechenden fluoreszenten Kanäle für das Experiment aus. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die korrekten positiven Populationen ausgewählt wurden, doppelklicken Sie auf einen Wert in der Matrix und fügen das Diagramm für jeden Kanal in den Analysebereich ein. Klicken Sie auf „Fertig stellen“, um die Kompensationsmatrix als CTM-Datei zu speichern.

Laden Sie die RIF-Datei in die geeignete Analyse-Software. Konvertieren Sie die RIF-Datei in eine DAF-Datei für die Datenanalyse. Öffnen Sie die erste Beispiel-Datei.

Tragen Sie die quadratische Mittelabweichung der Änderungsrate der Bildintensität im Hellfeldkanal auf. Tragen Sie anschließend das Seitenverhältnis über der Fläche für den Marker der antigenpräsentierenden Zelle auf. Gehen Sie die Doubletts, die eine einzelne antigenpräsentierende Zelle enthalten, ein.

Stellen Sie das Seitenverhältnis in Abhängigkeit von der Fläche für den T-Zell-Marker dar. Gehen Sie auf die Doubletts, die eine einzelne T-Zelle enthalten. Um die Zellen zu identifizieren, die miteinander in Kontakt stehen, verwenden Sie unter dem Analysemenü die Option Masken, um den Masken-Manager zu öffnen, und benennen Sie die neue Maske in T-Zell-Objekt-Maske um.

Klicken Sie auf die Funktionsschaltfläche und wählen Sie im Dialogfeld Objekt aus. Wählen Sie den Kanal aus, in dem der T-Zell-Marker detektiert wird, und klicken Sie auf OK. Erstellen Sie auf die gleiche Weise eine Maske für den Antigen-präsentierenden-Zell-Marker im entsprechenden Kanal. Tragen Sie die Fluoreszenzintensität des T-Zell-Markers in der Objektmaske der Antigen-präsentierenden Zelle gegen die Fluoreszenzintensität der Antigen-präsentierenden Zelle in der Objektmaske der T-Zelle auf.

Zeichnen Sie anschließend ein Gate, das nur die Zellen umfasst, die miteinander in Kontakt stehen. Überprüfen Sie abschließend manuell die Phalloidin-FITC-Bilder der Ereignisse innerhalb dieses Gates, um reife Immun-Synapsen anhand der Tag-Bilder-Funktion von einfachen Zell-zu-Zell-Kontakten zu unterscheiden, indem Sie diese Bilder markieren. Hier ist das Membrankontakt-Gate für aus Milz gewonnene CD4-positive T-Zellen dargestellt, die von tolerierten und nicht-tolerierten Empfängern von B6-Kardialallografts sieben Tage nach der Transplantation stammen und gemeinsam mit dendritischen Zellen aus B6-Knochenmark koinkubiert wurden, wie gezeigt.

Bei den synaptischen und nicht-synaptischen Ereignissen handelt es sich um die grünen Fadenkreuze. Die Analyse der Helligkeits- und Fluoreszenzkanäle ermöglicht ebenfalls die Visualisierung einzelner synaptischer und nicht-synaptischer Ereignisse. Tatsächlich lassen sich Synapsen sowohl von nicht-tolerogenen als auch von tolerogenen CDA-Empfängern von B6-Herzen anhand dichter, FITC-positiver Rippenstrukturen an der Grenzfläche zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle leicht von nicht-synaptischen Kontakten unterscheiden.

Nach weiterer Entwicklung könnte diese Technik möglicherweise in klinischen Anwendungen eingesetzt werden, beispielsweise bei der Reduktion oder dem Absetzen von Immunsuppressiva oder bei der Vorhersage des Transplantatergebnisses bei menschlichen Transplantatempfängern.