Name: Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Messung der T-Zell-Alloreaktivität mittels Imaging-Durchflusszytometrie für die Transplantationsimmunologie. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzanalyse einzelner Immun-Synapsen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen.

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SCJ wurde von einer Internationalen Gesellschaft für Herz- und Lungentransplantation Research Fellowship und ein Royal College of Physicians und Chirurgen von Kanada Detweiler Reisen Fellowship.SM unterstützt wurde teilweise durch eine internationale Gesellschaft für Herz- und Lungentransplantation Career Development Award (bis SCJ) unterstützt. SS wurde von den National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH unterstützt wird, ist der Empfänger einer Niere Research UK Profi-Non-Clinical Fellowship. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse an AB und KW finanziert: eine Wellcome Trust Programm Grant (082519Z07Z), eine British Heart Foundation Programm Grant (PG / 10 / 62,28504) und das EU-Rahmenprogramm 7 (eine Studie, BioDRIM). Die Autoren möchten Michael Parsons und die Flow Cytometry Core Facility am Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto für die Bereitstellung von Zugang zu und Unterstützung bei der Image Mark X Instrument danken.

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<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Imaging Durchflusszytometrie wurde verwendet , um Immunsynapsenbildung zwischen monoklonaler T - Zellen und APCs zu zeigen , oder in Gegenwart von Superantigenen 24, 25, 26, 27, 28. Dieses Verfahren nutzt die Tatsache , dass nach einem produktiven T - Zell-APC - Kontakt, die T - Zelle ihrer Aktinzytoskeletts umordnet, sie in Richtung der Kontaktstelle 21 polarisierend. Diese Umlagerung tritt nicht ohne TCR - Signalisierung, und es ist daher eine frühe Korrelat der T-Zell - Aktivierung 19, 20, 21. Die hier vorgestellte Methode paßt sich diesen Ansatz auf die Messung von alloreaktiven T-Zellen-Frequenz in polyklonalen T-Zellpopulationen. Als solches ist es in Zukunft als Grundlage für die Entwicklung von Assays für Spender reactivi dienen<html> ty in der klinischen Transplantation. Obwohl direkte Vergleiche noch nicht gemacht wurden, wird der Nachweis von alloreaktiven Immun Synapsen überlegen Vorhersagekraft als bei der herkömmlichen MLR zu haben. Zum Beispiel haben frühere Arbeiten gezeigt, dass in dem oben beschriebenen Protokoll tolerisierenden versagen die Ergebnisse eines MLR zuverlässig mit Transplantats Ergebnis 2 korrelieren. Eine Reihe von Tests wurde für den betrieblich tolerant Zustand beim Menschen 9, 10, 11, obwohl diese nicht misst Effektor - Zell - Funktion in Antwort auf Alloantigen entwickelt. Im Gegensatz dazu Funktion IFNy ELISPOT - Tests messen 8 Effektor - T-Zellen , aber nicht das gesamte Spektrum der Zytokinsekretion erfassen , die 38 bis akute und chronische Allotransplantatabstoßung, wie IL-17 von Bedeutung sein kann,&gt; 39. Der limitierende Verdünnungstest 4, der arbeitsintensiv ist, und die trans-vivo - Assay 6, die Mäuse, haben erhebliche praktische Einschränkungen erfordert , die deren Anwendung in einer klinischen Umgebung behindern würde. Die jüngsten Verbesserungen auf der Analyse von wuchernden Zellen unter Verwendung von TCR - Sequenzanalyse von T - Zellen in der MLR reagieren können von Wert sein, aber wie der Test hier vorgestellt, erfordern eine weitere Validierung in klinischen Studien 18, 40. Die weitere Entwicklung des Immun Synapse Nachweistest erfordert, dass eine Reihe wichtiger Fragen beantwortet werden. Zunächst wird, wie der Test entwickelt misst Direkt Alloreaktivität. Der direkte Weg beinhaltet die Präsentation von allogenen MHC / Peptid-Komplexen auf dem Spender abgeleiteten APCs. Letztere werden in der Regel nach der Transplantation schnell beseitigt und weitere Alloantigen Präsentation ist Carried durch Empfänger APCs aus intaktem MHC-Donor (semi-direkten Weg) oder verarbeiteten Spenderantigene auf MHC selbst (indirekter Weg) zu präsentieren. Der indirekte Weg ist ein wichtiger Treiber der chronischen Allograft - Abstoßung 33, 41. Im Prinzip soll es möglich sein , indirekte Immun Synapsen zu erkennen , diesen Test verwendet wird , sondern indirekt haben alloreaktiven T - Zellen , die eine viel niedrigere Frequenz als Direktfluege 42, 43, was bedeutet , dass die Analyse einer größeren Anzahl von Veranstaltungen benötigt werden. Eine zweite Überlegung ist , dass wir nur diesen Test unter Verwendung von CD4 + T - Zellen getestet, während der CD8 + T - Zellen , auch ein wichtiger Bestandteil der Anti-Donor - Antwort sind. Auch hier soll es möglich sein , CD8 + T - Zell-APC Synapsen mit dieser Methode zu erkennen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass das Verfahren die manuelle Überprüfung und Analyse von Zellbildern in der letzten memb erfordertrane Kontakt Tor, und wir arbeiten derzeit an der Automatisierung von diesem Schritt. Schließlich erfordert die Methode Test und Entwicklung bei Menschen und Vorstudien mit humanen Proben zur Zeit durchgeführt werden. Weitere phänotypische T-Zell - Untergruppe Analyse (dh Effektor, Speicher, regulatorische, etc.) in Kombination mit dem Nachweis von Immun Synapsen bei Transplantatempfängern würde einen leistungsfähigen Ansatz stellt das alloreaktiven T-Zell - Repertoire zur Charakterisierung und wird ein wichtiger Schwerpunkt sein zukünftige Arbeit.

Organtransplantation hat die Versorgung von Patienten im Endstadium von Erkrankungen der Niere, Leber, Herz und Lunge verwandelt. Durch Unterschiede in der Haupt- und Neben Histokompatibilitatsantigene sind jedoch Allotransplantate von Empfänger-T-Zellen sofort abgelehnt, wenn Immunsuppressiva verwendet werden, nicht. Diese Mittel haben zahlreiche Nebenwirkungen, einschließlich der Risiken für Krebs und Organdysfunktion. Ein großes klinisches Ziel ist es daher, die Dosis der Immunsuppression auf das Minimum zu senken erforderlich Allograft-Abstoßung zu verhindern. Diese Ebene ist wahrscheinlich, je nach dem Grad der Aktivierung des angeborenen Immunsystems variieren; der Grad der Nichtübereinstimmung Alloantigen Spender-Empfänger; und zwischen den Patienten Unterschiede in der Immunfunktion, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik. Leider 1, Transplantation Ärzte haben keine Werkzeuge zum genauen Spender Reaktivität bei einzelnen Patienten zu beurteilen. die gemischteLeukocyten Reaktion (MLR) kann Donator Reaktivität detektieren, aber es funktioniert nicht zuverlässig Transplantats Ergebnis 2, 3, vorherzusagen. Limitierenden Verdünnungsassays, Zytokin -ELISPOTs und die trans-vivo - Assay entweder Messung eine begrenzte Anzahl von Antworten oder nicht praktikabel 4, 5, 6, 7, 8 .Gene Expressionsprofile haben ergeben Signaturen Betriebstoleranz bezogen 9, 10, 11, 12 und Ablehnung 13, 14, 15, aber diese sind nicht immer verallgemeinerbar über Bevölkerung 16 und hat letztlich Nützlichkeit bei einzelnen Patienten beschränkt. Sequenzbasierte Analyses des T-Zell - Rezeptor (TCR) von T - Zellen im peripheren Blut 17 oder 18 in der MLR proliferierenden sind ebenfalls entwickelt worden, erfordern jedoch eine weitere Validierung. Konzeptionell wäre es wünschenswert, einen Assay zu haben, dass die frühesten erforderlichen Schritte in Empfänger-T-Zellen-Aktivierung durch ein Spenderantigen erkennt. Da die Zellen über Tage Kultivierung (wie in der MLR) Artefakte einführen kann, ein solcher Test würde erfordern, idealerweise nicht die Messung von nachgelagerten Ereignisse wie Proliferation oder Effektor-Funktion. Ebenso wäre es jedoch auch wünschenswert sein, dass der Test da rein beschreibende Einschätzungen auf ein Element von T-Zell-Funktion, abhängig (ZB TCR - Sequenzierung) kann nicht zwischen anergisch und funktionellen T - Zellen zu unterscheiden. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine längere T-APC Kontakt für die Bildung eines Immun Synapse erforderlich ist, was ein erster wichtiger istSchritt in der T-Zell - Antwort 19, 20, 21, 22. Wir berichteten vor kurzem , dass, während des dynamischen In - vitro - Zeitraffer - Bildgebung, etwa 5 - 10% der Maus - CD4 + T - Zellen mit allogenen Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen (BMDCs) 23 lang anhaltende Kontakte bilden. Die Häufigkeit des längeren Kontakts wurde bei Tieren erhöht , die ein Pfropf verworfen, während bei Mäusen zuvor tolerant auf die gleichen Antigene , gerenderte, blieb es in untransplanted Mäusen auf Niveau 23 gesehen. Längere Wechselwirkungen wurden in Gegenwart des Empfänger Tregs reduziert und in ihrer Abwesenheit erhöht, und wir beobachteten ähnliche Phänomene unter Verwendung von humanen T - Zellen und allogenen Monozyten abgeleiteten DCs (MoDCs) 23. Allerdings machte die Aufzählung der verlängerten Kontakte innerhalb eines polyklonalen T-Zell-population ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Wir haben daher den Einsatz von Imaging-Zytometrie allogenen Immunsynapsenbildung zu untersuchen, fließen. Imaging Fluss umfasst die Zytometrie multiparametrischer Datenerfassungs- und Analysefunktionen herkömmlicher Durchflusszytometrie mit den Einzelzellen-Bildgebungsfähigkeiten der Fluoreszenzmikroskopie. Diese Technik wird von anderen Forschern verwendet worden , durch monoklonale T - Zellen 24, 26, 27 oder in der Anwesenheit von Superantigenen 28 immune Synapsenbildung zu untersuchen. In solchen Einstellungen jedoch reicht die Frequenz der reagierenden T - Zellen von 30-100%, während alloreaktiven T - Zellen in der Regel 5-15% des gesamten T-Zellen - Repertoires 29, 30, 31, 32 zu repräsentieren geschätzt. Wichtigerweise haben wir gezeigt, dass Abbildungs ​​Durchflusszytometrie av produzieren kannery vergleichbares Maß der alloreaktiven T-Zellen - Frequenz 23 und dass Änderungen in der Synapse Frequenz innerhalb einer polyklonalen T-Zellpopulation prädiktiven sind Pfropf Ergebnis 23. Derzeit hat dieser Ansatz optimierte die direkte Alloreaktivität von CD4 + T - Zellen zu messen, aber im Prinzip könnte es auch zu untersuchen , CD8 + T - Zellen und den indirekten Weg entwickelt werden. Indirekte Alloreaktivität wird angenommen , dass zunehmend relevant wird bei längeren Zeiten nach der Transplantation , 33. Wir entwickeln derzeit diese Methode menschliche Zellen zu verwenden, die für die Prüfung bei Patienten ermöglichen. So wird in der Zukunft kann das Gesamtkonzept für die funktionelle Bewertung der T-Zell-Antworten bei Transplantatempfängern vor der Transplantation nützlich sein; unmittelbar nach der Transplantation; und in den langfristigen, wenn Drogen Minimierung wird ein wichtiges Ziel.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Verschiedene</td><td>Variiert</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamentetraessigsäure, 0,5 M Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 nichtionisches Detergens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Lösung besteht zu 37 % aus Formaldehyd und muss daher für 1,5 % ige Lösung 25-mal verdünnt werden</td></tr><tr><td>Zellsiebe, 70 & mu; m Porengröße</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Fluorescein-Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycin D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Rekonstitution in DMSO</td></tr><tr><td>Allophycocyanin-konjugiertes Anti-Maus-CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Pazifisches Blau-konjugiertes Anti-Maus-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Pazifikblau wurde ersetzt durch eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-MHC Klasse II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-Mittel B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte Anti-Maus-CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS magnetischer Zellseparator</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Human TGF&beta; 1 hat Aktivität auf Mauszellen</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II Amnis</td><td>/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Imaging Durchflusszytometer; Details finden Sie unter http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Kostenloser Download (Registrierung erforderlich): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Zellkulturmedium&nbsp;</td><td>Verschiedenes</td><td>Variiert</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Verschiedenes</td><td>Verschiedenes Variiert</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td>Verschiedenes</td><td>Variiert</td><td></td></tr></tbody></table>

die messung der t-zell-alloreaktivität mit imaging durchflusszytometrie

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der immunologischen Reaktivität gegenüber Spender-Antigenen bei Transplantatempfängern ist wahrscheinlich für die erfolgreiche Reduktion oder den Entzug der Immunsuppression von entscheidenden Bedeutung. Die gemischte Leukozytenreaktion (MLR), limitierenden Verdünnungsassays und trans-vivo Allergien vom verzögerten Typ (DTH) Assay werden alle auf diese Frage angewandt worden, aber diese Verfahren beschränkt sind prädiktive Fähigkeit und / oder erhebliche praktische Beschränkungen auf, die ihre Nützlichkeit verringern. Imaging Durchflusszytometrie ist ein Verfahren, das die quantitativen multiparametrischer Potenzen von Durchflusszytometrie mit den bildgebenden Fähigkeiten der Fluoreszenzmikroskopie kombiniert. Wir haben vor kurzem die Verwendung eines bildgebenden Durchflusszytometrie Ansatz gemacht, den Anteil an Empfänger-T-Zellen zur Bildung von reifen immune Synapsen mit Donor- Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in der Lage zu definieren. Mit einem gut charakterisierten Maus Herztransplantation Modell haben wir gezeigt , dass die Häufigkeit von in - vitro - Immun Synapsen unter T-APC membrane Kontaktereignisse vorhergesagt stark Ergebnis Allograft in Ablehnung, Toleranz und eine Situation, in der Transplantation das Überleben auf induzierte regulatorische T-Zellen abhängt. Die Häufigkeit von T-APC Kontakten erhöht mit T-Zellen von Mäusen während der akuten Abstoßung und verringerte mit T-Zellen von Mäusen, nicht reagierenden gerendert Alloantigen. Die Zugabe von regulatorischen T - Zellen auf das in vitro - System reduziert verlängerte T-APC - Kontakte. Entscheidend ist, wurde dieser Effekt auch mit humanem polyklonal erweitert, natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen zu sehen, die dafür bekannt ist, um die Abstoßung von menschlichen Geweben in humanisierter Maus-Modellen zu steuern. Die Weiterentwicklung dieses Ansatzes kann für eine tiefere Charakterisierung des alloreaktiven T-Zellkompartiment bei Transplantatempfängern ermöglichen. In Zukunft Weiterentwicklung und Evaluierung dieser Methode menschliche Zellen verwendet, können die Grundlage für die Tests verwendet bilden Patienten zur Immunsuppression Minimierung auszuwählen, und es kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Tolerogen zu messenic-Therapien in der Klinik.

Diese Methode wurde verwendet , CD4 + T-Zell - Alloreaktivität in Mäusen Spender Alloantigene vor heterotope Herztransplantation Allograft tolerant gemacht zu untersuchen. CBA - Mäuse (H-2 k) wurden ein Protokoll gegeben tolerisierenden eines spenderspezifischen bestehend (B6, H-2 b) Bluttransfusion kombiniert mit einem nichtdepletierenden CD4 - Antikörper eines Monat vor einer B6 Herztransplantation erhalten. Dieses Protokoll führt zu einer langfristigen Überleben Allotransplantat , die auf Foxp3 + regulatorische T - Zellen 36, 37 abhängig ist. Sieben Tage nach der Transplantation wurden Milz- CD4 + T - Zellen aus tolerisiert erhalten und nicht-tolerierten Empfänger von B6 Herzallotransplantaten und wurden coinkubiert mit B6 - Knochenmark abgeleitete DCs entsprechend dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten aus diesem Experiment. Die Membran - Kontakt Gate ist in 2 gezeigtA, mit grünem Fadenkreuz auf einem synaptischen Ereignisse (linkes Feld, 1) angeordnet und auf einem nicht-synaptischen Ereignisse (rechtes Feld). 2B zeigt die Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle für dieses Ereignis. Zur Reduzierung bias, wurden die Daten von einem Beobachter zu Behandlungszuordnung 23 verblindet analysiert. Wie in mehreren Beispielen in 3 gezeigt ist , beide aus nicht-tolerant gemacht (3A-B) und tolerant gemacht (3C-D) CBA Empfänger von B6 Herzen, sind Synapsen leicht von nicht-synaptische Kontakten durch das Vorhandensein eines dichten FITC-positiven Grat an der T-APC - Schnittstelle. Diese Ergebnisse zeigen, dass die visuelle Erkennung von Immun Synapsen gemacht durch Empfänger-T-Zellen-Spuren mit dem Grad der Alloreaktivität in dem Empfänger. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Abbildung 2. Identifizierung von T-APC Dubletten mit MembranKontakt und Immune Synapse Formation. Ereignisse in dem letzten Dublett Gatter (1F) analysiert. A. T-Zell - Marker Fluoreszenz in der Objektmaske APC wird aufgetragen gegen APC Marker Fluoreszenz in DC Objektmaske. Einige Dublette Ereignisse haben eine APC und ein T-Zell ohne Zell-Zell-Kontakt und erscheinen in der linken unteren Ecke des Grundstücks (Bilder nicht gezeigt). Ein Membran-Kontakt Gate kann so gezogen werden, dass nur Dubletts, in denen T-Zellen und APCs in Kontakt sind, umfasst. Bilder von jedem Ereignis in diesem Tor sind auf Anzeichen von Aktin Zytoskelett-Umlagerung in Phalloidin-FITC Kanal überprüft und kann mit Hilfe der Analysesoftware markiert werden. Die linke Tafel zeigt eine Immunsynapsenereignis (mit 1 gekennzeichnet und von grünem Fadenkreuz angedeutet), während die rechte Tafel einer Membrankontaktereignis ohne Immunsynapsenbildung (Fadenkreuz markiert durch grünes und 2 angegeben) angibt. Die Bestimmung der Synapsenbildung erfordert eine manuelle Überprüfung dieserBilder, Die obere Reihe zeigt Hellfeld- und Fluoreszenzkanal Bilder für ein Dublett mit einem Immun Synapse in B. B gezeigt (entspricht Ereignis 1 in A); Die untere Reihe zeigt ein Dublett mit Membran-Kontakt aber ohne Synapsenbildung (entspricht Ereignis 2 in A). Die Daten wurden in verblindet mit Bezug auf Behandlungszuordnung und werden von einem zuvor veröffentlichten Experiment 23 analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiele für T-APC Synapsenbildung. CBA - Mäuse erhielten Allotransplantate von kardialen B6 Spender nach entweder keine Vorbehandlung (AB) oder nach der Toleranzinduktion mit B6 Vollblut unter der Abdeckung eines nichtdepletierenden Anti-CD4 - Antikörper ( <st<html> rong&gt; CD). Nach 7 Tagen wurden Milz- CD4 + T - Zellen für die Synapsenbildung mit B6 DCs getestet. A. Drei Beispiele für nicht-synaptischen Dubletts mit Membrankontakt aus einem nicht-tolerant gemacht Tiere. B. Drei Beispiele von Immun Synapsen von einem nicht-tolerierten Tiere. C. Drei Beispiele für nicht-synaptischen Dubletts mit Membran Kontakt von einem Tier tolerant gemacht. D. Drei Beispiele von Immun Synapsen von einem tolerisiert Tiere. Synapse-Bildung wird durch die Anwesenheit von einem hellen, FITC-positiven Grat an der T-APC-Schnittstelle (CH03) angegeben. Die Daten wurden in verblindet mit Bezug auf Behandlungszuordnung und werden von einem zuvor veröffentlichten Experiment 23 analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Antikörper / Dye </td><td> Fluorochrom </td><td> Kanal </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> Ch02 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml, titrieren empirisch </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml, titrieren empirisch </td></tr><tr><td> Phalloidin </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0,05 bis 0,5 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 ug / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Antikörper und Farbstoffe in dieser Studie verwendet. Fluorochrom konjugierte Antikörper, Farbstoffe, Lieferanten und empfohlenen Konzentrationen sind in der Tabelle dargestellt. Die Abbildungs ​​Durchflusszytometer Kanal, der verwendet wurde jedes Fluorochrom zu erkennen ist auch in der Tabelle gezeigt.

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen unter Verwendung von Mess Cytometry Abbildungsströmung.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die alloreaktive Aktivität von T-Zellen mittels bildgebender Durchflusszytometrie zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Transplantationsimmunologie zu beantworten, beispielsweise welcher Anteil der T-Zellen eines Empfängers auf allogene Antigene des Spenders reagiert. Diese Technik kombiniert die multiparametrischen quantitativen Möglichkeiten der Durchflusszytometrie mit den bildgebenden Fähigkeiten der fluoreszenzmikroskopischen Analyse, um die hochdurchsatzfähige Untersuchung einzelner Synapsen zwischen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen zu ermöglichen.Den Ablauf wird Sajad Moshkelgosha, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, 0,5 × 10⁶ dendritische Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Zellkulturplatte zu säen, gefolgt von 1 × 10⁶ T-Zellen und einem endgültigen Gesamtvolumen von bis zu 50 µL Kulturmedium pro Vertiefung.Die kalten Kulturen vier Stunden bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren. Anschließend das Dreifache des Kulturvolumens an 1,5 % Formaldehyd in PBS zu jedem Well für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Fixierung die Zellen aus jedem Well in ein entsprechendes 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführen.Färben Sie die Zellen mit den geeigneten fluorochromkonjugierten Antikörpern in 100 µL Waschpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Anschließend waschen Sie die Zellen in 1 mL Waschpuffer und resuspendieren die Pellets in Perm/Wash-Puffer, der Phalloidin-FITC enthält. Nach weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, waschen Sie die Zellen in 1 mL frischem Perm/Wash-Puffer.Suspendieren Sie die Pellets in dem gewünschten Kernfarbstoff in Permeabilisierungs-/Waschpuffer und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Permeabilisierungs-/Waschpuffer, gefolgt von einer Wäsche mit Waschpuffer allein. Suspendieren Sie die Zellen anschließend in 50 bis 100 Mikrolitern frischem Waschpuffer.Überführen Sie die Zellen in kleine verschließbare Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Zell-Zell-Interaktionen zu analysieren, reservieren Sie zunächst einen Kanal für die Aufnahme von Hellfeldbildern und laden Sie das erste Kontrollröhrchen. Mit ausgeschaltetem Hellfeldkanal erstellen Sie im Arbeitsbereichsfenster für jeden verwendeten Kanal ein neues Streudiagramm mit dem Seitenverhältnis über der Fläche.Die Singletts eingeben, bei denen das Seitenverhältnis nahe bei eins liegt. Für jeden Fluorochrom die positive Population überprüfen und die Laser-Spannung im Beleuchtungsfeld gegebenenfalls anpassen. Im Kanäle-Feld die geeigneten Kanäle für die bei der Färbung verwendeten Fluorochrome auswählen.Klicken Sie dann auf „Aufzeichnen“. Wenn die Anzahl der Ereignisse den festgelegten Schwellenwert erreicht, wird die Datenaufnahme automatisch gestoppt. Nachdem alle Einzelfärbungs-Kontrollen aufgenommen wurden, laden Sie das erste experimentelle Probenröhrchen und nehmen mehrere zehntausend Ereignisse unter den geeigneten Analysekanälen einschließlich des Hellfeldkanals auf.Um eine Kompensationsmatrix zu erstellen, laden Sie die Einzelfärbungs-Kontrolldateien in den Kompensationsassistenten und wählen die entsprechenden fluoreszenten Kanäle für das Experiment aus. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die korrekten positiven Populationen ausgewählt wurden, doppelklicken Sie auf einen Wert in der Matrix und fügen das Diagramm für jeden Kanal in den Analysebereich ein. Klicken Sie auf „Fertig stellen“, um die Kompensationsmatrix als CTM-Datei zu speichern.Laden Sie die RIF-Datei in die geeignete Analyse-Software. Konvertieren Sie die RIF-Datei in eine DAF-Datei für die Datenanalyse. Öffnen Sie die erste Beispiel-Datei.Tragen Sie die quadratische Mittelabweichung der Änderungsrate der Bildintensität im Hellfeldkanal auf. Tragen Sie anschließend das Seitenverhältnis über der Fläche für den Marker der antigenpräsentierenden Zelle auf. Gehen Sie die Doubletts, die eine einzelne antigenpräsentierende Zelle enthalten, ein. Stellen Sie das Seitenverhältnis in Abhängigkeit von der Fläche für den T-Zell-Marker dar. Gehen Sie auf die Doubletts, die eine einzelne T-Zelle enthalten. Um die Zellen zu identifizieren, die miteinander in Kontakt stehen, verwenden Sie unter dem Analysemenü die Option Masken, um den Masken-Manager zu öffnen, und benennen Sie die neue Maske in T-Zell-Objekt-Maske um.Klicken Sie auf die Funktionsschaltfläche und wählen Sie im Dialogfeld Objekt aus. Wählen Sie den Kanal aus, in dem der T-Zell-Marker detektiert wird, und klicken Sie auf OK. Erstellen Sie auf die gleiche Weise eine Maske für den Antigen-präsentierenden-Zell-Marker im entsprechenden Kanal. Tragen Sie die Fluoreszenzintensität des T-Zell-Markers in der Objektmaske der Antigen-präsentierenden Zelle gegen die Fluoreszenzintensität der Antigen-präsentierenden Zelle in der Objektmaske der T-Zelle auf.Zeichnen Sie anschließend ein Gate, das nur die Zellen umfasst, die miteinander in Kontakt stehen. Überprüfen Sie abschließend manuell die Phalloidin-FITC-Bilder der Ereignisse innerhalb dieses Gates, um reife Immun-Synapsen anhand der Tag-Bilder-Funktion von einfachen Zell-zu-Zell-Kontakten zu unterscheiden, indem Sie diese Bilder markieren. Hier ist das Membrankontakt-Gate für aus Milz gewonnene CD4-positive T-Zellen dargestellt, die von tolerierten und nicht-tolerierten Empfängern von B6-Kardialallografts sieben Tage nach der Transplantation stammen und gemeinsam mit dendritischen Zellen aus B6-Knochenmark koinkubiert wurden, wie gezeigt.Bei den synaptischen und nicht-synaptischen Ereignissen handelt es sich um die grünen Fadenkreuze. Die Analyse der Helligkeits- und Fluoreszenzkanäle ermöglicht ebenfalls die Visualisierung einzelner synaptischer und nicht-synaptischer Ereignisse. Tatsächlich lassen sich Synapsen sowohl von nicht-tolerogenen als auch von tolerogenen CDA-Empfängern von B6-Herzen anhand dichter, FITC-positiver Rippenstrukturen an der Grenzfläche zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle leicht von nicht-synaptischen Kontakten unterscheiden.Nach weiterer Entwicklung könnte diese Technik möglicherweise in klinischen Anwendungen eingesetzt werden, beispielsweise bei der Reduktion oder dem Absetzen von Immunsuppressiva oder bei der Vorhersage des Transplantatergebnisses bei menschlichen Transplantatempfängern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Alloreaktivität in gemischten T-Zellpopulationen durch Beobachtung von Wechselwirkungen mit Alloantigen-tragenden dendritischen Zellen, die zur Bildung immunologischer Synapsen führen. Die differentielle Färbung und Quantifizierung von synapsenhaltigen Dubletten mittels Durchflusszytometrie zeigt eine T-Zell-Alloreaktivität.

Messung der Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik, bei der zwei Fluorochrome verwendet werden, um CD4+ und CD8+ T-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und Monozyten in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu identifizieren. Nach der Inkubation der Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker werden die Zelluntergruppen mit einer optimalen durchflusszytometrischen Gating-Strategie...

Ein Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung von Immunzelluntergruppen in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Durchflusszytometrie kann genutzt werden, um den Zustand des Chromatins innerhalb der T-Zellen zu beurteilen. Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, Nachweis Chromatindekondensation während der T-Zellaktivierung durch einen Anstieg in der mittleren Fluoreszenz-Intensität (MFI) von fluoreszierenden Histone H3 Antikörper nachgewiesen interpretieren...

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Erfahren Sie die Messung der T-Zell-Alloreaktivität mittels Imaging-Durchflusszytometrie für die Transplantationsimmunologie. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzanalyse einzelner Immun-Synapsen zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

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