Name: Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Lernen Sie, den Paarungstrieb männlicher Drosophila melanogaster zu messen und zu manipulieren. Diese hochdurchsatzfähige Verhaltensanalyse erlaubt die Untersuchung genetischer und neuronaler Mechanismen der Motivation.

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Die Autoren danken Mike Crickmore, Dragana Rogulja und Michelle Frank für ihre Kommentare zum Manuskript. Pavel Gorelik leistete technische Unterstützung bei der Herstellung der Verhaltensarenen. Diese Arbeit wurde im Labor von Mike Crickmore durchgeführt und wird auch von der Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja) unterstützt. S.X.Z. ist Stuart H.Q. und Victoria Quan Fellow an der Harvard Medical School.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (§§ 1 - 3), Durchführung (Abschnitt 4) und Analyse (Abschnitt 4) von 2-D-Sättigung-Assays. Dann dopaminerge Stimulation als Beispiel, Abschnitt 5 zeigt, wie thermogene Stimulation zu kombinieren mit 2-D-Sättigungsassays hypersexuality zu induzieren. Abschnitt 6 beschreibt drei Möglichkeiten, um die Ergebnisse der 2-D-Sättigungstests zu verifizieren. Schließlich Abschnitt 7 zeigt, wie die Erholung der Paarung Antrieb in männlichen Fliegen zu messen. 1. Die Herstellung von 8- und 32-Kammer Behavioral Arenas HINWEIS: Jede Verhaltens Arena besteht aus mehreren Schichten aus lasergeschnittenen Kunststoffplatten zusammengehalten durch Sechskantschrauben und Flügelmuttern an jeder der vier Ecken (1A). <ol><li> Fabrizieren die Schichten der Arena. Fabrizieren jede Schicht eine Laserschneider Blätter aus Acrylkunststoff in die entsprechende Form zu schneiden (siehe 1B, 1C für Produkte). HINWEIS: Viele Forschungs Institutions Laserschneider in ihren Maschinenhallen oder Hersteller Plätze. Wenn das Organ den Zugang zu einem Laserschneider hat, fahren Sie mit den folgenden Schritten. Wenn nicht, folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.2 statt. <ol><li> Für jede Schicht, öffnen Sie das Design-Muster in der Software des Laser-Cutter. HINWEIS: Die Entwürfe können in entsprechend benannten PDF - Dateien (zB 8-Kammer - Arena - Schicht 2 - Doors.pdf) zu finden in ergänzendes Material 1. Diese Datei enthält auch Anmerkungen für die Art von Kunststoff (zB verwendet werden, 1 / 8 Zoll (dh 3,175 mm) klar Acryl). Die genaue Dicke jeder Schicht ist nicht kritisch. Die Hauptanforderung ist 0,12 Zoll (3 mm) oder mehr freier vertikalen Raum in den Kammern zu ermöglichen. </li><li> Passen Sie die Lasereinstellungen (Power, Fokus, etc.) für die Art und Dicke der Kunststoff verwendet werden. Legen Kunststoff in der Laser-Cutter Bett und führen Sie den Laser-Cutter. HINWEIS: Diese Einstellungen weitgehend auf der Basis der Laser cutte variierenr Modell und die Stärke seines Lasers. Finden Sie die entsprechenden Einstellungen auf Basis von Erfahrungen aus der Vergangenheit oder indem Testschnitte auf Schrott Kunststoff. Die tiefen hexagonal Gravuren sind in das Design einbezogen werden die Sechskantschraubenköpfe zu versenken. Diese Funktion ermöglicht eine einhändige Anziehen der Flügelmuttern und ermöglicht die Arenen flach auf der Bank zum Ausruhen (ohne Schraubenköpfe vorsteht). Dennoch tiefe Gravuren machen, ist oft schwer zu erreichen, und zeitaufwendig, mit einem Laserschneider. Dieser Schritt ist optional und kann ohne Auswirkung auf die Verhaltensergebnisse übersprungen werden. </li><li> Wenn die Türrahmen Schneiden (Layer 2, Abbildung 1A), ferner geeignete Lasereinstellungen zur Gravur der Kammernummern in das Design einbezogen werden (wie in 1B, 1C). </li></ol></li><li> Legen Sie eine Bestellung mit einem Online-Laserschneiden fabricator. Laden Sie alle PDF - Design - Dateien für die 8- und / oder 32-Kammer - Arena , und geben Sie den Materialtyp (zB 1/8 Zoll (dh 3,175 mm) clear Acryl), basierend auf den Anmerkungen in den Dateien. Die Ergebnisse werden angezeigt , wie in den 1B (8-Kammer - Arena) und 1C (32-Kammer - Arena). </li><li> Montieren Sie Arenen mit vier Sechskantschrauben und vier Flügelmuttern ausrichten und halten zusammen , um die Kunststoffschichten (1A). Die Arenen erscheint , wie in Abbildung 1D, 1E (8-Kammer) und 1F, 1G (32-Kammer). HINWEIS: Die Nahrungsmittelwand (Schicht 4 in Figur 1A) nur dann für 2-D Sättigungsassays verwendet und in 32-Kammer - Arenen weggelassen, die in der Balz - Assays verwendet werden. </li></ol> 2. Nahrungszubereitung für 2-D Satiety Assay Hinweis: Da ein 2-D-Sättigungstest 4,5 h reicht, fliegen Essen in der Arena verwendet wird Nahrung und Wasser zu versorgen. Dieses Protokoll verwendet, ist aber nicht beschränkt auf, die herkömmliche Maismehl-Agar Nahrungs fliegen. <ol><li> Teilweise montieren Sie die 2-D-Sättigungs Arena (8-Kammer) mit Schichten 3 bis 6und ziehen Sie es mit Flügelmuttern und Sechskantschrauben (Abbildung 1A für Schicht Zuweisungen sehen). </li><li> Legen Sie frische fliegen Lebensmittel in einen sauberen, mikrowellengeeignet Flasche. Fügen Sie gerade genug Wasser , um die Unterseite der Flasche (2A) zu decken. </li><li> Essen aus der Mikrowelle auf hoch für 30 - 45 s. Überprüfen Sie den Fortschritt und rühren alle 15 s , bis sie geschmolzen (2B). VORSICHT! Fly Essen leicht überkocht. </li><li> Verwenden Sie ein abgestumpft 1000-ul Pipettenspitze (2C) zu langsam übertragen ~ 1 ml geschmolzen Lebensmittel in jede Kammer (2D). </li><li> Lassen Sie Lebensmittel bei 4 ° C für ~ 10 min (Abbildung 2E) wieder zu verfestigen , bevor vollständig in die Arena (2F) zusammenbauen. </li><li> Verwenden Sie den ausgefüllten Arena für Experimente (siehe Abschnitt 4) oder bei 4 ° C. </li><li> Lagern Sie das übrig gebliebene Essen bei 4 ° C und Wiederverwendung. </li></ol> 3. Vorbereitung Virgin Frauen für Verhaltenstests HINWEIS: 2-D Sättigungs Assays verwenden eine große Anzahl von jungfräulichen weiblichen Fliegen (~ 120-160 für eine vollständige Verhaltens Arena), die schwierig mit Standardmethoden zu sammeln. Dieser Abschnitt beschreibt einen alternativen Ansatz mit dem hs-hid Transgen auf dem Y - Chromosom 28, die erfolgreich 25, 29 bei der Balz - Assays verwendet wurde. Die Lager verwendet weiß-eyed jungfräulichen Weibchen zu erzeugen, hat den Genotyp w1118 (X) / hs-hid (Y); + / +; + / + (Bloomington Artikelnummer 24638). <ol><li> Flip fliegt in eine neue Flasche einmal 20-50% der Puppen haben geschlüpften (siehe 3A zum Beispiel) , und es gibt genug Männer (5-10) , um die Lager zu propagieren. </li><li> Hitzeschock die ursprüngliche Flasche in einem 37 ° C heißen Wasserbad 1 h ausreichend aktivieren hs-hid Männer zu töten (3B). Nach dem Hitzeschock, wird nur Frauen aus diesen Flaschen schlüpfen und so jungfräulich bleiben, bis dieAssays. HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass alle Seiten der Flasche gleichmäßig erwärmt (siehe 3A für Wasserlinie). Verlängern Sie diese Zeit für bis zu 2 h, wenn 1 h nicht ausreicht, um alle Männer einschläfern. </li><li> Isolieren gesammelter Weibchen für mindestens 3 d vor Experimenten zu gewährleisten , dass sie alt genug sind , um sexuell empfänglich 25, 29 zu sein. HINWEIS: Y-Chromosom-weniger Männchen gelegentlich aus diesem Lager entstehen. Diese Männer haben weiße Augen und sind unabhängig von den Hitzeschock, weil sie nicht das hs-hid Transgen enthalten. Sie können nicht Spermien produzieren und daher nicht Empfänglichkeit bei Frauen verringern kann 30, 31. </li></ol> 4. Performing und Scoring 2-D Satiety Assays HINWEIS: Es ist wichtig, das Alter des Mannes zu steuern, fliegt als Gegen Antrieb ändert sich mit dem Alter. Dieses Protokoll verwendet Männer , die 3 - 4 d alt 25 </sup&gt;. <ol><li> Stellen Sie den Inkubator auf die gewünschte Temperatur (zB 23 ° C für Standard-, RT Experimente) und Luftfeuchtigkeit (&gt; 30%). Für Inkubatoren ohne Feuchtigkeitskontrolle, eine Tasse Wasser in den Inkubator verlassen, ist ausreichend. </li><li> Legen Sie eine 2-D-Sättigungstest Arena im Inkubator für ~ 30 min, um die Temperatur zu äquilibrieren und zur Vermeidung von Kondensation in den Kammern im Verlauf des Experiments. Die Drehtüren sollten in der offenen Position sein. </li><li> Verwenden Sie 32 eine Fliege Aspirator 15 abzusaugen - 20 jungfräulichen Weibchen in jede Kammer der Arena (Abbildung 4). Hinweis: Es ist wichtig, dass die Weibchen und Männchen sind am selben Tag wie dem Assay nicht anästhesiert. Nach unserer Erfahrung kann die weibliche Empfänglichkeit und männliche Paarungsverhalten dabei auswirken. </li><li> Absaugen 1 Männchen in jede Kammer. </li><li> Legen Sie die geladenen Arena im Inkubator unter einem Standard - Consumer - Camcorder (Abbildung 5) und Film für 4,5 h. </li><li> Ergebnis Videos mit der Feststellung , wenn jeder männliche fliegen beginnt und endet jeder Paarung (dh Kopulation). Dieser Schritt kann auf den ersten zeitraubend sein. Mit etwas Übung kann man die Videos bei 5x Geschwindigkeit oder höhere Punktzahl. HINWEIS: Da fliegt für ~ 20 min bei ~ 23 ° C (kürzere Dauer bei höheren Temperaturen) paaren 29, kann man die ersten 15 Minuten von jeder Paarung überfliegen. </li><li> Nach der Anmeldung alle Paarungszeiten, die Anzahl der Paarungen für jede Fliege Summe (siehe repräsentative Ergebnisse). </li><li> Verwenden Sie den bereitgestellten Code ein Ethogramm zu erzeugen. Siehe Supplemental Material 2 für den Code, Anweisungen und Beispieldaten. </li><li> Verwenden Sie CO 2 oder kalten Temperaturen , um die Fliegen zu betäuben , bevor sie zu entfernen. </li></ol> 5. Mit thermogene Manipulation Satiety Reverse in 2-D Satiety Assays Hinweis: Dieses Protokoll prüft, ob thermogene Stimulation einer definierten neuronalen Population Sättigung zu überwinden. Die experimentelle flies der wärmeempfindlichen Kationenkanal TRPA1 in definierten Populationen von Neuronen (UAS-TRPA1) auszudrücken. Die Schritte gelten unten auf die Stimulation von dopaminergen Neuronen (TH-Gal4), die Aufnahme der Antriebs 25 zu fördern gezeigt wurden. Diese Schritte können in Verbindung mit anderen neuronalen Treiber verwendet werden, um andere Populationen zu entdecken, die Aufnahme der Antriebs fördern. <ol><li> Um thermogenePaarungsVerhalten in satiated Fliegen induzieren, um die Temperatur im Inkubator erhöhen ( zum Beispiel von 23 ° C bis 28,5 ° C) nach einer vollständigen 4,5 h 2-D Sättigungs Experiment abgeschlossen. </li><li> Nachdem der Inkubator die gewünschte Temperatur erreicht, Wärme Stimulation fortzusetzen und die Paarungen Score (dh. Paarungen) der Männchen für 1 h (Repräsentative Ergebnisse sehen). HINWEIS: Die Temperatur und die Dauer der Stimulation auf dem Genotyp variieren kann, so ist es notwendig, die optimalen Bedingungen zu beheben, die Reizüberflutung von Neuronen zu verhindern, während immer noch eine robu Herstellungst Phänotyp. </li></ol> 6. Mit Umwerbung und Locomotion Satiety zu überprüfen: HINWEIS: In diesem Abschnitt werden drei optionale Methoden, die verwendet werden können, um die Ergebnisse von 2-D-Sättigung Assays zu überprüfen. Sie sind nicht für jeden Test erforderlich. <ol><li> Verwenden Sie Balz Assays Sättigung zu überprüfen. <ol><li> Absaugen eine männliche und eine weibliche Jungfrau in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena. </li><li> Film die Fliegen für ~ 20 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden. </li><li> Ergebnis der Balz - Index (CI) zu quantifizieren Balz 25; dies ist der Bruchteil der Zeit Balzverhalten verbrachte Durchführung (Singen, folgende usw.) und Paarung (dh Kopulation) über 5 min Fenster. Dieses Fenster geht von der ersten Instanz von Balzverhalten. Wenn ein Mann nicht fliegen Balz in den ersten 15 Minuten beginnen, seine CI ist 0. Naïve WT fliegt ein CI größer als 0,9 zeigen sollte, während ein voll gestillt Fliege ein CI b haben sollteelow 0,2. Andere Balz Maßnahmen können auch 23 in Betracht gezogen werden, 33. </li></ol></li><li> Scoring Balz in 2-D Sättigungsassays <ol><li> Score die Menge an Zeit , die eine männliche fly aufwendet, über einen Zeitraum von einer 2-D Sättigungs Assay courting (beispielsweise der ersten h). Balz wird als männlich definiert jeden Schritt des Rituals Durchführung (Gesang, folgende, etc.). Anders als in Abschnitt 6.1.3, ist dieser Schritt nicht Zeit das männliche Paarungs verbringt umfassen. </li><li> Teilen Sie die Balz Zeit oben durch die Gesamtzeit der Männchen war nicht Paarung (dh nicht kopulierenden) im gleichen Zeitraum. Wenn zum Beispiel ein männlicher Plätze für 15 min und 20 min für mates über der ersten h fliegen, ist das Verhältnis 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Das Verhältnis wird als &quot;Fraktion der nonmating Zeit in der Balz&quot; gezeigt in Repräsentative Ergebnisse. </li></ol></li><li> Mit Fortbewegung Assay Erschöpfung zu bewerten <ol><li> zusammenbauen teilweise die 32-Kammer-Arena mit allen Teilen, aber die Kontrastfolie. </li><li> Absaugen eine männliche Fliege (keine weibliche Fliegen) in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena. </li><li> Film die Fliegen für ~ 10 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden. </li><li> Verfolgen Sie die Fliegen mit dem MTrack2 Plugin in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html). </li></ol></li></ol> 7. Nach der Paarung Laufwerk Wiederherstellen von 2-D Satiety Assay <ol><li> Führen Sie eine 2-D-Sättigung Test, wie in Abschnitt 4 beschrieben, aber aspirieren das Männchen fliegt am Ende des Tests aus. </li><li> Isolierung der männlichen Fliegen bei 23 ° C für die gewünschte Anzahl von Tagen. </li><li> Führen Sie eine 2-D - Sättigungstest mit den gewonnenen Männern und sammle ihre Paarungen (dh Paarungen) für nur 1 h (siehe Repräsentative Ergebnisse). </li></ol>

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<li>Ni, J. Q., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature. 8 (5), 405-407 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Motivation Zustände können gesättigt, aufrechterhalten werden und erholte 34. Wir stellen eine 2-D Sättigungs Assay, schnell und robust all dieser Aspekte der Paarung Antrieb im fly misst. Dieser Assay eröffnet die Möglichkeit, fortgeschrittene fly genetische Manipulationen der Verwendung der molekularen und Schaltungskomponenten eines motivierten Verhalten zu untersuchen. Der Sättigungs Assay beruht auf der Fähigkeit des männlichen erfolgreich vor Gericht und kopulie...

Die Arbeit in Drosophila hat tief und Pionier Einblick in viele biologische Phänomene zur Verfügung gestellt, einschließlich der Art des Gens 1, Prinzipien der Embryonalentwicklung 2, zirkadianen Rhythmen 3 und die Entwicklung und die Verdrahtung des Nervensystems 4, 5, 6. Motivation bleibt weit weniger gut als diese Phänomene zu verstehen, vielleicht wegen der Einschränkungen auf den Systemen, die bisher untersucht wurden. Motivation in der Fliege wird im Rahmen des Hungers in erster Linie untersucht, die durch viele Herausforderungen mit sich bringt, um ihre verschwindend klein Nahrungsaufnahme pro Fütterung Kampf und Exoskelett, die deutliche Zeichen für eine Fettablagerung ausschließt. Folglich besteht ein Bedarf, die Systemen zu erweitern Motivation in the fly zu studieren. Wir beschreiben eine Verhaltens Rahmen für die Untersuchung von zusammenpassenden Antriebs inDrosophila. Dieses System nutzt die neurogenetischer Werkzeuge im fly sowie die Zugänglichkeit 7, 8, 9, 10, 11, 12 und der putative Connectome seiner geschlechtsdimorphischen Schaltung 8, 13. Darüber hinaus viel von der angeborenen 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 und erlernten 22, 23, 24 sensomotorischen Schaltung Steuerung Balz wurde im Detail ausgearbeitet, eine seltene Gelegenheit,zu finden, trifft die genaue Schaltungsknoten, auf die Motivation. Vor kurzem berichteten wir , dass in der Fliege, wie beim Menschen, Dopaminspiegel 25 bis Paarung Antrieb von zentraler Bedeutung sind, 26, 27. Wir haben genetische Zugang zu den relevanten Dopamin produzierenden gewonnen und Empfangen von Neuronen in der Fliege, die Erleichterung detaillierte Molekular- und Circuit-Level - Analysen dieser konservierten Phänomen der Assays nutzen wir hier 25 beschreiben. Wir fügen den Verhaltenstests in Zhang et al. 25 eine neue Wohnung Verhaltens Arena , die Video - Scoring ermöglicht, die wir eine 2-dimensionale (2-D) Sättigungs Test, eine wichtige Verbesserung gegenüber früheren Methoden aufrufen. Folglich ist der neue Test skalierbarer und quantifizierbar, und daher besser geeignet für die genetische Screens von Genen und in der Motivation beteiligten Neuronen. Wir verwenden diese neuen Tests, zusammen mit der Balz-Assays und neurogetische Manipulationen, zu zeigen, wie Paarung Antrieb in der Fliege zu messen und zu verändern.

<table><tbody><tr><td>1/16 Zoll klares Acryl</td><td>McMaster-Carr</td><td>8589K12</td><td>Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.</td></tr><tr><td>1/8 Zoll klares Acryl</td><td>McMaster-Carr</td><td>8589K42</td><td>Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.</td></tr><tr><td>3/16 Zoll klares Acryl</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K219</td><td>Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.</td></tr><tr><td>1/32 Zoll schwarzer Delrin</td><td>McMaster-Carr</td><td>8575K132</td><td>Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.</td></tr><tr><td>Sechskantschrauben, 1 Zoll lang (50x)</td><td>McMaster-Carr</td><td>92314A115&nbsp;</td><td>Wird verwendet, um Arenen zu bauen. Kann durch 3/4-Zoll-Schrauben (92314A113, McMaster-Carr) für 32-Kammer-Arenen ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Rändelmuttern (25x)</td><td>McMaster-Carr</td><td>92741A100</td><td>Wird zur Herstellung von Arenen verwendet. Kann durch normale Sechskantmuttern (90480A005, McMaster-Carr) ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Camcorder</td><td>Canon</td><td>Vixia HF R700</td><td>Kann durch jeden Consumer-Comcorder ersetzt werden.</td></tr></tbody></table>

messen und Ändern von mating antrieb in male<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Trotz jahrzehntelanger Forschung, bleiben die neuronalen und molekularen Grundlagen der motivierenden Staaten mysteriös. Wir haben vor kurzem eine neue, reduktionistische und skalierbares System für eingehende Untersuchung der Motivation zur Aufnahme der Antriebs der männlichen Drosophila melanogaster (Drosophila) verwenden, werden die Methoden , für die hier Detail , das wir. Das Verhaltensparadigma Zentren auf der Erkenntnis, dass männliche Gegenplatte neben Fruchtbarkeit im Laufe von wiederholten Paarungen ab und erholt sich über ~ 3 d. In diesem System konvergieren die mächtigen neurogenetische Werkzeuge zur Verfügung, in der Fliege mit dem genetischen Zugänglichkeit und vermeintlichen für das Sexualverhalten zur Verfügung Schaltplan. Diese Konvergenz ermöglicht eine schnelle Isolierung und Befragung von kleinen neuronalen Populationen mit spezifischen Motivations Funktionen. Hier stellen wir ausführlich die Planung und Ausführung des Sättigungs Assay, der verwendet wird, zu messen und Balz Motivation in der männlichen Fliege verändern. Mit dieserTest zeigen wir auch, dass niedrige männliche Paarungs Antrieb durch die Stimulierung dopaminergen Neuronen überwunden werden können. Der Sättigungs Test ist einfach, kostengünstig und robust gegenüber Einflüssen von genetischen Hintergrund. Wir erwarten, dass das Sättigungs Test viele neue Einblicke in die Neurobiologie der Motivationszustände zu erzeugen.

Zur Charakterisierung Drosophila Gegen - Antrieb, 3 Tage alten, WT Canton-S Männer wurden in einem 2-D - Sättigungstest getestet. Im Laufe des Tests (4,5 h), Männchen im Durchschnitt 4,8 ± 0,3 paaren (Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert, SEM) Zeiten. Paarungen initiieren meist in den ersten 2 h (78%) (6A, 6B) und weniger häufig , wie der Test fortschreitet (6A, 6B). Dieser Rückgang ist auf den Mangel an passenden Partner nicht durch (...

Dieser Artikel beschreibt einen Verhaltenstest , die männliche Paarungs Laufwerk verwendet in Drosophila melanogaste r Motivation zu studieren. Mit dieser Methode können die Forscher fortgeschrittene Fliegenneurogenetischen Techniken verwenden, um die genetischen, molekularen aufzudecken und zellulären Mechanismen, die diese Motivation zu Grunde liegen.

Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die Paarungsmotivation männlicher Drosophila zu messen und zu beeinflussen, um die Motivation in einem reduktionistischen System zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Erforschung der Motivation zu beantworten, beispielsweise, welche Gene und Neuronen die Paarungsmotivation steuern, wodurch möglicherweise die Funktionsweise der motivationalen Schaltkreise aufgeklärt wird. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie einen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der Paarungsmotivation bereitstellt, der in Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen, die in der Fliege verfügbar sind, eingesetzt werden kann.Mindestens drei Tage vor einem 2-D-Sättigungsassay weibliche Fliegen aus einer Flasche mit weißem 11 18 über Hitzeschock hid-Fliegenstamm vorbereiten. Sobald 20 bis 50 % der Puppen geschlüpft sind und mindestens fünf Männchen vorhanden sind, um den Stamm weiterzuzüchten, die Fliegen in eine neue Flasche überführen. Anschließend die ursprüngliche Flasche eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad hitzebehandeln, um den Hitzeschock hid ausreichend zu aktivieren, sodass männliche Larven und Puppen abgetötet werden.Nach dem Hitzeschock schlüpfen aus diesen Flaschen nur Weibchen. Um die Versuchsarena vorzubereiten, montieren Sie die 2-D-Sättigungsarena teilweise und befestigen sie mit Daumensicherungsmuttern und Sechskantschrauben. Anschließend geben Sie frisches Fliegenfutter in eine saubere, mikrowellengeeignete Flasche und fügen gerade so viel Wasser hinzu, dass die Bodenfläche bedeckt ist.Erhitzen Sie das Lebensmittel bei voller Leistung für 30 bis 45 Sekunden in der Mikrowelle. Überprüfen Sie den Fortschritt visuell und rühren Sie das Lebensmittel alle 15 Sekunden um, bis es geschmolzen ist. Sobald das Lebensmittel geschmolzen ist, verwenden Sie eine abgerundete 1000-Mikroliter-Pipettenspitze, um etwa 1 Milliliter des geschmolzenen Lebensmittels langsam in jede Kammer zu übertragen.Lassen Sie das Futter bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang wieder verfestigen, bevor Sie die Versuchsanlage vollständig zusammenbauen. Die fertige Anlage kann für Experimente verwendet werden. Bewahren Sie das übrige Futter bei vier Grad Celsius zur Wiederverwendung auf.Bevor Sie den 2-D-Sättigungs-Assay beginnen, stellen Sie den Inkubator auf 23 Grad Celsius für Experimente bei Standardraumtemperatur ein und stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit über 30 % liegt. Stellen Sie ein Glas Wasser in den Inkubator, falls dieser keine Feuchtigkeitsregelung besitzt. Stellen Sie die 2-D-Sättigungs-Assay-Arena für 30 Minuten in den Inkubator, um die Temperatur auszugleichen und Kondensation in den Kammern während des Experiments zu vermeiden. Halten Sie die Drehtüren in geöffneter Position.Verwenden Sie anschließend einen Fliegenaspirator, um 15 bis 20 jungfräuliche Weibchen in jede Kammer der Versuchsanordnung zu aspirieren. Nachdem die weiblichen Fliegen übertragen wurden, aspirieren Sie jeweils ein Männchen in jede Kammer. Stellen Sie dann die bestückte Versuchsanordnung unter eine handelsübliche Camcorder-Kamera in den Inkubator und filmen Sie die Fliegen 4,5 Stunden lang.Nach der Aufnahme betäuben Sie die Fliegen mithilfe von CO2 oder Kälte, bevor Sie sie aus der Versuchsanlage entfernen. Werten Sie die Videos aus, indem Sie dokumentieren, wann jede männliche Fliege mit welchem Verhalten beginnt und es beendet. Verwenden Sie den bereitgestellten Code, um ein Ethogramm zu erstellen.Nachdem alle Paarungszeiten erfasst wurden, summieren Sie die Anzahl der Paarungen für jede Fliege. Saugen Sie jeweils ein Männchen in jede der 32 Kammern einer Balzarena. Danach saugen Sie jeweils ein Weibchen in jede Kammer.Die Fliegen für zwanzig Minuten mit einer handelsüblichen Videokamera aufnehmen. Den Balzindex ermitteln, um die Balzaktivität innerhalb eines Zeitfensters von fünf Minuten zu quantifizieren. Wenn eine männliche Fliege innerhalb der ersten fünfzehn Minuten nicht mit der Balz beginnt, beträgt der Balzindex null.Naive Wildtyp-Fliegen sollten einen Balzindex von mehr als 0,9 aufweisen, während eine vollständig gesättigte Fliege einen Balzindex unter 0,2 haben sollte. Nach Durchführung eines 2-D-Sättigungsassays saugen Sie die männlichen Fliegen aus den Kammern in Futtergefäße. Isolieren Sie die männlichen Fliegen von den Weibchen bei 23 Grad Celsius für die gewünschte Anzahl von Tagen.Führen Sie anschließend einen zweidimensionalen Sättigungs-Assay mit den gewonnenen Männchen durch und bewerten Sie ihre Kopulationen innerhalb von nur einer Stunde. Um den Paarungstrieb von Drosophila zu charakterisieren, wurden drei Tage alte Wildtyp-Männchen des Canton-S-Stamms in einem zweidimensionalen Sättigungs-Assay getestet. Innerhalb von 4,5 Stunden paaren sich die Männchen durchschnittlich 4,8-mal.78 % der Paarungen beginnen in den ersten beiden Stunden. Die Paarungen werden im Verlauf des Tests seltener. Dieser Rückgang im Paarungsverhalten ist ebenfalls zu beobachten, wenn die Männchen in Balztests mit neuen Weibchen getestet werden, und normalisiert sich wieder, nachdem die Männchen drei Tage lang von Weibchen isoliert waren.Am Ende der 2-D-Sättigungs-Assays erhöhte die dopaminerge Stimulation sowohl das Balzverhalten als auch die Kopulation. Die umgekehrten Effekte werden bei kontrollierten Elterntypen nicht beobachtet. Einmal beherrscht, kann dieser Assay innerhalb von 30 Minuten vorbereitet und innerhalb von eineinhalb Stunden ausgewertet werden.Dieser Test kann in Kombination mit genetischen und neuronalen Eingriffen wie RNAi-Genabschaltung und Optogenetik durchgeführt werden, um festzustellen, welche Gene und Neuronen die Paarungsbereitschaft steuern.

measuring-and-altering-mating-drive-in-male-drosophila-melanogaster

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Geringe Spermien Wettbewerbsfähigkeit...

Beurteilung Differenzen in Sperm Wettbewerbsfähigkeit in<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, kostengünstige Möglichkeit, Drosophila oder andere Insekten individuell zu identifizieren. Demonstrationsdaten, die den Paarungserfolg bei drei Drosophila-Arten untersuchen, zeigen, dass diese Methode vergleichbar oder besser ist als die Verwendung von CO2 -Anästhesie.

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

Während Fruchtfliege Kämpfe, die Verhaltensmuster beobachtet, kämpfen Dynamik, und die damit verbundenen Lern- und Gedächtnis werden von experimentellen Bedingungen beeinflusst. Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein neues Verfahren, das vollständig eliminiert Handhabung von Fliegen während der Experimente. Dies verbessert Kampf Dynamik und ermöglicht die Bildung von starken "Verlierer" Effekte.

Ein neuer Ansatz, die Handhabung für ein Studium Aggression Eliminiert und die &quot;Loser&quot; Effect in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Testen der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster bei Einzeltierauflösung.  Dieser Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform zur Identifizierung von Genen und Schaltkreiskomponenten, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion lohnend und nonrewarding Erfahrungen in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) mit freiwilligen Ethanolkonsum als Maß für Änderungen in Lohn Staaten.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Wir zeigen einen Assay, um die ökologischen und genetischen Cues zu analysieren, die das Paarungsverhalten in der Fruchtfliege beeinflussen Drosophila melanogaster .

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist aufzubauen, zu pflegen und aktualisieren eine Gefangenschaft Bevölkerung von Eristalis Tenax inmitten der Forschung.

Aufzucht und langfristige Wartung von Schwebfliegen Eristalis Tenax für Forschungsstudien

Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll soll die Lebensfähigkeit von Drosophila in jeder Entwicklungsphase vom Embryo bis zum Erwachsenen bewerten. Die Methode kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit verschiedener Genotypen oder Wachstumsbedingungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen

Lernen Sie, den Paarungstrieb männlicher Drosophila melanogaster zu messen und zu manipulieren. Diese hochdurchsatzfähige Verhaltensanalyse erlaubt die Untersuchung genetischer und neuronaler Mechanismen der Motivation.

Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male

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