Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, neuartige eisbindende Proteine oder IBPs aus Pflanzen zu identifizieren, indem die Eisbindungsaktivität getestet und native Peptide mittels Eisaffinitätsreinigung isoliert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Frosttoleranz von Pflanzen zu beantworten, insbesondere zu eisbindenden Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie eisbindende Proteine aus nativen Extrakten isolieren können, ohne komplizierte Reinigungsmethoden verwenden zu müssen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Aufbau der Apparatur schwierig zu konzipieren sein kann. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Einrichtung des Splat-Geräts, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Expression von eisbindenden Proteinen (IBPs) in frosttoleranten Gräsern oder anderen frosttoleranten Pflanzenarten zu induzieren, werden die Pflanzen bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius bei schlechten Lichtverhältnissen kalt akklimatisiert.

Gewinnen Sie etwa 0,1 Gramm Blattgewebe, indem Sie an der Basis des Stiels abschneiden und dann in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben. Die Probe sofort in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Zellen zu lysieren, zerkleinert man die Gewebeprobe mit einem Mörser zu einem feinen Pulver und stößelt sie unter flüssigen Stickstoff ab.

Stellen Sie sicher, dass der flüssige Stickstoff während des Homogenisierungsprozesses nicht verdampft. Legen Sie die gemahlenen Proben sofort auf Eis und lassen Sie den flüssigen Stickstoff vollständig verdampfen. Fügen Sie dann einen Milliliter eines nativen Proteinextraktionspuffers hinzu und pipettieren Sie zum Mischen.

Schütteln Sie die Proben über Nacht vorsichtig bei vier Grad Celsius und führen Sie die restlichen Schritte bei gleicher Temperatur durch. Entfernen Sie am nächsten Tag Zelltrümmer, indem Sie die Proben fünf Minuten lang bei etwa 1.600 G zentrifugieren. Bewahren Sie die lösliche Fraktion auf und zentrifugieren Sie weitere fünf Minuten, wenn Zelltrümmer bestehen bleiben.

Geklärte Proben können bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Gießen Sie 100 Milliliter Hexan in die äußere Kammer, die mit der polarisierten Folie eingerichtet ist, und fügen Sie fünf bis sechs Trockenkugeln hinzu, um Feuchtigkeitsablagerungen auf den Objektträgern zu verhindern. Geben Sie dann eine kleine Menge Vakuumfett auf die Platte, die das Bad abdeckt, und drehen Sie sie, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten und eine Verdunstung des Hexans zu verhindern.

Legen Sie den Kühlblock 40 Minuten vor Beginn des Experiments in eine Styroporbox direkt unter das Kunststoffrohr und bedecken Sie diese vollständig mit Trockeneis. Stellen Sie vor Beginn des Assays sicher, dass das Röhrchen waagerecht ist. Entfernen Sie dann das Trockeneis von der Oberseite des kalten Blocks.

Testen Sie dieses Verfahren zunächst mit Wasser, um festzustellen, wo die Probe auf den Kühlblock fallen wird. Tauchen Sie die Einwegspitze, die an einer automatischen Pipette befestigt ist, in Tauchöl, damit die Probe fallen kann, anstatt an der Außenseite der Pipette zu kleben. Verwenden Sie ein Papiertuch, um überschüssiges Öl zu entfernen.

Saugen Sie dann 10 Mikroliter Wasser an. Platzieren Sie die Pipette direkt über dem Kunststoffschlauch, bevor Sie das Wasser ablassen. Ein deutliches Spritzgeräusch sollte zu hören sein, wenn das Wasser auf den Kühlblock trifft und eine Monoschicht aus Eiskristallen bildet.

Legen Sie anschließend einen Objektträger aus Glas auf die mit Wasser bestimmte Tropfenmarkierung. Schalten Sie unmittelbar vor Beginn des Assays die Lichtquelle ein und kratzen Sie das Eis ab, das sich auf dem Boden der Glaskammer gebildet hat. Führen Sie dann den Splat-Assay mit der Probe durch, wie es für das Wasser der Fall ist, und geben Sie 10 Mikroliter der Probe auf den Glasdeckel ab, um eine Monoschicht aus Eiskristallen zu erzeugen.

Nehmen Sie den Objektträger schnell und vorsichtig mit einer Pinzette aus dem kalten Block und legen Sie ihn im Hexanbad auf den Polarisationsfilm. Mit dem Blick unter das Mikroskop schieben Sie den Objektträger in das Sichtfeld und stellen Sie die Objektivlinse so ein, dass die Kreuzpolarisation die Visualisierung von kontrastreichen Eiskristallen ermöglicht. Schließen Sie die Kamera an das Mikroskop an und stellen Sie die Einstellungen auf Makro ein, um eine klare Visualisierung von Eiskristallen zu ermöglichen und das Bild aufzunehmen.

Wiederholen Sie diese Schritte für alle Proben. Platzieren Sie in der Regel bis zu sechs Objektträger mit einer anderen Probe in der Hexankammer. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Lichtquelle aus.

Legen Sie dann eine Kunststoffplatte über das Hexanbad, um einen dichten Verschluss zu gewährleisten, und lassen Sie die Eiskristalle über Nacht glühen. Nehmen Sie nach der Inkubation wie zuvor Bilder der Eisfilme auf. Nachdem Sie das Pflanzengewebe wie zuvor kalt akklimatisiert haben, sammeln Sie etwa 100 bis 150 Gramm der gemahlenen Biomasse in 20-Milliliter-Röhrchen.

Gefrieren Sie die Proben sofort im Schockfrost und bewahren Sie sie vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius auf. Bereiten Sie die Probe wie zuvor vor, wobei Sie ein Eins-zu-Eins-Verhältnis für die Resuspension des Blattgewebes verwenden. Verwenden Sie zusätzliche Proteasehemmer-Tabletten, um den Abbau von IBPs durch endogene Proteasen zu vermeiden.

Um Zelltrümmer zu entfernen, sieben Sie das Lysat dreimal durch zwei Schichten Käsetuch. Pelletieren Sie den Schmutz durch Zentrifugieren bei 30.000 Mal G für 40 Minuten bei vier Grad Celsius. Erhöhen Sie dann das Probenvolumen auf 120 Milliliter mit nativem Proteinextraktionspuffer und verwenden Sie das Lysade sofort für die Eisaffinitätsreinigung, um einen Verlust der Eisbindungsaktivität zu vermeiden.

Nachdem Sie den Eisfinger auf minus 0,5 Grad Celsius abgekühlt haben, tauchen Sie ihn anschließend in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit kaltem, destilliertem Wasser. Fügen Sie ein paar Eiswürfel hinzu, um die Eiskeimbildung zu erleichtern, und lassen Sie eine dünne Eisschicht auf dem Finger bilden. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwischen 20 und 30 Minuten.

Geben Sie die Probe in ein 150-Milliliter-Glasbecherglas mit einem kleinen magnetischen Rührstab, der in einem Styroporbehälter auf dem Magnetrührer platziert wird. Stellen Sie sicher, dass der Eisfinger zentriert und mindestens zur Hälfte in die flüssige Probe gesenkt ist. Verschließen Sie dann den Behälter.

Lassen Sie das Programm etwa zwei Tage lang laufen, und überprüfen Sie es alle 24 Stunden. Sobald 50 % der Probe eingefroren sind, stoppen Sie das Programm. Der Einbau von IBPs in die Eishalbkugel führt zu Eisätzungen.

Um die Eishalbkugel zu entfernen, erwärmen Sie die Sonde auf vier Grad Celsius. Spülen Sie dann die Hemisphäre mit destilliertem Wasser ab, um ungebundenes Protein zu entfernen, und tauen Sie sie bei vier Grad Celsius auf. Wenn die Eishalbkugel noch Pigmente enthält, oder um die Probenreinigung zu erhöhen, wiederholen Sie die Reinigungsschritte zwei- bis dreimal.

Hier sind Extrakte aus einer Pufferkontrolle ohne IBPs und Extrakte aus Wildtyp-Arabidopsis thaliana zu sehen, die keine IBPs enthalten. Nach 18 Stunden sind die Pufferkontrolle und die Extrakte von A.thaliana nicht mehr in der Lage, das Wachstum der Eiskristalle zu bremsen. Im Gegensatz dazu schränken die kleinen Eiskristalle, die bei Extrakten von transgenen A. thaliana beobachtet werden, die IBPs aus kälteakklimatisierten Lolium perenne exprimieren, das Wachstum von Eiskristallen erheblich ein.

Nach der ersten Reinigungsrunde deutet der hohe Grad der Eisätzung auf der Oberfläche der Hemisphäre darauf hin, dass IBPs an das Eis adsorbiert und das Wachstum der Eiskristalle verändert haben. Um zusätzliche gelöste Stoffe, Pigmente und kontaminierende Proteine zu entfernen, wurde eine zweite Runde der Eisaffinität verwendet, was zu einer klareren Eishalbkugel führte. Im Anschluss an dieses Verfahren können die Eisformung und die thermische Hysterese mit einem Nanoliter-Osmometer ausgewertet werden, um eisbindende Proteine weiter zu charakterisieren.

Zusätzlich können isolierte Fraktionen zur Massenspektrometrie geschickt werden, um die Peptidsequenzen zu identifizieren.