Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, hämatopoetische Vorläuferzellen im Dottersack und ihre Nachkommen in vivo mithilfe eines mausbasierenden, durch Tamoxifen induzierten Fate-Mapping-Systems und der Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immunologie bezüglich der Entwicklung und Differenzierung hämatopoetischer Vorläuferzellen, die sich von hämatopoetischen Stammzellen unterscheiden, zu beantworten. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass hämatopoetische Vorläuferzellen, die innerhalb eines begrenzten Zeitfensters markiert wurden, sowie ihre Nachkommen, beispielsweise residente Makrophagen, während der Entwicklung und im Erwachsenenalter verfolgt werden können.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der großen Anzahl an Zellen im embryonalen Gewebe und des hohen Volumens der gleichzeitig behandelten Proben. Um das Experiment zu beginnen, überführen Sie zunächst die dissezierten Uterushörner der Maus in eine 10-Millimeter-Petrischale, die mit etwa 30 Milliliter eiskalter PBS gefüllt ist. Unmittelbar danach fassen Sie die Muskelgewebe des Uterus am zervikalen Ende des Horns und führen eine feine Schere zwischen die Muskelgewebeschicht und das dekidualisierte Gewebe ein, um die Embryonen freizusetzen.

Danach mit feiner Pinzette die Membrana reichertii entfernen und die Plazenta entfernen. Vorsichtig das Dottersack präparieren und in eine 24-Loch-Gewebekulturplatte überführen, die mit 0,5 Milliliter der Digestionslösung gefüllt ist. Nach Durchtrennen der Nabel- und Vitellin-Gefäße das Embryo unverzüglich in eine 12-Loch-Gewebekulturplatte überführen, die mit 2 Milliliter 10 Millimolar kalter EDTA auf Eis gefüllt ist.

Nachdem der Kopf des Embryos mit einer scharfen Feinschere entfernt wurde, den Körper und den Kopf auf Eis für 10 bis 15 Minuten inkubieren, anschließend den Embryo entfernen und das EDTA, das das Blut enthält, sammeln. Danach die das Embryo umgebende Amnionhaut entfernen. Anschließend die Hintergliedmaßen und Fremdgliedmaßen vom Embryo entfernen.

Öffnen Sie mit einem Paar feiner Pinzetten den Thorax. Greifen Sie dann das vordere Ende des Herzens und ziehen vorsichtig am Gewebe, während Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten die inneren Organe vom Körper lösen. Trennen Sie unter einem Stereomikroskop die fetale Leber vom Herzen und vom Darm.

Und überführen Sie das Organ in eine 24-Well-Platte, die mit 0,5 Millilitern der Digestionslösung gefüllt ist. Die anatomische Verbindung mit dem kardiovaskulären System ist entscheidend für die Identifizierung der fetalen Leber. Die fetale Leber befindet sich zu diesem Entwicklungsstadium noch in diesem Stadium, und je jünger die Embryonen sind, desto schwieriger kann die Dissektion sein.

Um primäre Zellsuspensionen herzustellen, inkubieren Sie die gesammelten Organe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in der Verdauungslösung. Geben Sie das Gewebe in der enzymatischen Lösung auf einen 10-Mikrometer-Filter, der über einem der sechs Näpfe einer Gewebekulturplatte angebracht ist, die mit 1 Milliliter FACS-Puffer gefüllt ist. Verwenden Sie einen schwarzen Gummipiston aus einer 2-Millimeter-Spritze, um das Gewebe durch vorsichtiges Zermahlen zu dissoziieren und eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Anschließend die Zellsuspension mit einer Pasteur-Pipette aufsaugen und in ein 15-Milliliter-Gefäß umpipettieren. Die Suspension bei 320 ×g und 4 °C für 7 Minuten zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig abpipettieren und verwerfen.

Als Nächstes frischen Fc-Blockierpuffer herstellen und das Pellet in 60 Mikroliter resuspendieren. Anschließend 50 Mikroliter der Einzelzell-Suspension in einen Wells einer 96-Loch-Rundbodenplatte überführen. Die Platte mindestens 15 Minuten auf Eis inkubieren.

Überführen Sie anschließend die verbleibenden 10 Mikroliter der Suspension in ein 5-Milliliter-Polystyrol-FACS-Röhrchen, um einen Pool von Proben zu erhalten, die aus verschiedenen Geweben stammen. Überführen Sie 50 Mikroliter des Pools für FMO-Kontrollen für jeden Fluorochrom in die 96er-Multiwellplatte. Um mit der Oberflächenmarkierung der Antigene fortzufahren, verwenden Sie einen Satz aus sechs Fluorochrom-Antikörpern, um eine Antikörperlösung und FACS-Puffer herzustellen.

Danach sechs Antikörperlösungen sowie FACS-Puffer vorbereiten, die für die FMO-Kontrollfärbung verwendet werden. Anschließend 50 Mikroliter der Antikörperlösungen zu den Proben in der 96er-Multiwellplatte geben. Die Proben durch vorsichtiges doppeltes Pipettieren mischen und die Platte dann 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Zentrifugieren Sie die 96-Multiwell-Platte bei 320 ×g und 4 °C für 7 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 200 µL FACS-Puffer und zentrifugieren Sie die Platte ein weiteres Mal. Bei der Entfernung des Überstands durch Platteninversion ist besondere Vorsicht geboten.

Die 96-Multiwell-Platte muss mit einer einzigen, kurzen Handgelenksbewegung umgedreht werden, um ein Lösen der Zellen zu vermeiden. Schließlich werden das Gewebe und die Kontrollproben mithilfe eines 70-Mikrometer-Filters in 6-Millimeter-Polystyrolröhrchen filtriert. Anschließend kann die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt werden.

Eine Population lebender nicht-erythrozytärer zytoplasmatischer Einzelzellen wurde auf die Expression des Vorläufermarkers Kit und des hämatopoetischen Zellmarkers CD45 analysiert. Innerhalb der Zielpopulation wurden drei verschiedene Teilpopulationen unterschieden: Kit-positiv, CD45-negativ; Kit-positiv, CD45-schwach; sowie Kit-negativ, CD45-positiv.

Unter den Kit-positiven Vorläuferzellen des Dottersacks enthielten sowohl die CD45-negativen als auch die CD45-schwachpositiven Zellpopulationen AA4.1-positive Zellen, die das gelbe fluoreszierende Protein oder YFP exprimieren, was darauf hindeutet, dass unreife KIT-positive Vorläuferzellen zuerst AA4.1 unabhängig von der CD45-Expression exprimieren. AA4.1-positive, YFP-positive Zellen in der Leber und im Gehirn wurden ausschließlich in der KIT-positiven, CD45-schwachpositiven Vorläuferpopulation gefunden und entsprechen vermutlich zirkulierenden Vorläuferzellen, die ursprünglich aus den Dottersack-Vorläufern stammen. Makrophagen wurden in der kit-negativen, CD45-positiven Population gefunden und als F480-hell CD11b-positive Zellen identifiziert.

Makrophagen im Dottersack, der Leber und dem Gehirn wurden durch eine einzige Gabe von 4-Hydroxy-Tamoxifen effizient markiert, was auf ihren ENP-Ursprung hindeuten könnte. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Zellisolierung und Färbung in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Proben unmittelbar nach der Entnahme auf Eis zu stellen.

Frische FACS-Puffer sollten täglich frisch hergestellt und filtriert werden. Mit dieser Vorgehensweise können auch andere Mash-Reporter- oder Flux-Stämme wie die Rosa-MTMG- oder Rosa-confetti-Linien verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Undifferenzierung und zum Potential in der Proto-Phase der nach der Markierung verfolgten Zellen zu beantworten.