Environmental Screening von Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa im Zebrafisch-Systeme

Das übergeordnete Ziel dieser Probenahmetechnik ist es, die Anzahl der für die Gesundheitsüberwachung verwendeten Fische zu reduzieren und den Umsatz, die Kosten und die Empfindlichkeit des Erregernachweises zu optimieren, auch beim Screening von Importen in Quarantäne. Diese Technik hilft dabei, die Gesundheitsstatuten der Zufluchtskolonien zu definieren. Diese Methode ist ein nützliches Instrument beim Ablesen oder Beurteilen der Behandlungswirksamkeit.

Ein Hauptvorteil dieser Technik ist das Screening und die Triage von Importen in Quarantäne. Es stärkt den Biosicherheitsplan der Wasseranlage. Um das Protokoll zu starten, stellen Sie einen sauberen Acht-Liter-Tank aus einem Umlaufsystem auf.

Füllen Sie den Tank mit etwa acht Litern Wasser aus Sümpfen. Geben Sie zwei Keramikkügelchen oder Schwammwürfel mit Biomedien aus den Systemen zum Sieb. Als nächstes fügen Sie einen Danio rerio pro Liter hinzu, indem Sie Wildtyp-Fische mit dem dominanten genetischen Hintergrund in der Einrichtung verwenden, z. B. A B.Wählen Sie mindestens sechs Fische aus.

Füttern Sie die Fische einmal am Tag. Variieren Sie die Fütterungen, um sicherzustellen, dass die Wächter allen Futtersorten ausgesetzt sind, die in der Zebrafischanlage verwendet werden. Um den Wasserwechsel durchzuführen, werden die Wächter in Biomedien in einen provisorischen Tank umgefüllt.

Entleeren Sie den Sentinel-Tank vollständig und reinigen Sie ihn. Füllen Sie den Wächtertank nur mit Sumpfwasser und setzen Sie die Wächter und Biomedien wieder ein. Nachdem Sie die Wächter vier Monate lang dem Sumpfwasser ausgesetzt haben, euthanasieren Sie die Fische durch eine zugelassene Methode, wie z. B. das Eintauchen in eine Überdosislösung von 2-Phenoxyethanol.

Um den Tod zu bestätigen, warten Sie zehn Minuten nach Beendigung der Operculumbewegung. Greifen Sie den Leichnam mit einer Pinzette und frieren Sie ihn vollständig bei minus 80 Grad Celsius in einem dafür vorgesehenen Behälter ein. Bereiten Sie einen sterilen, trockenen Tupfer mit einem Kunststoffschaft vor und ziehen Sie Handschuhe an.

Suchen Sie die zu tupfende Oberfläche. Wählen Sie eine Sumpfoberfläche mit geringem Durchfluss, die Sumpfwand an der Wasseroberfläche, und entfernen Sie alle Gegenstände, die einen einfachen Zugang zur Oberfläche verhindern. Enthüllen Sie anschließend den Tupfer, indem Sie die Außenverpackung entfernen und das sterile Wattestäbchen der Luft aussetzen.

Tupfen Sie die Sumpfwand über fünf bis 10 Zentimeter ab, um das Wasser und den Biofilm an der Oberfläche des Sumpfwassers aufzunehmen. Stecken Sie dann den Tupfer zurück oder brechen Sie die Spitze in ein steriles Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie die Probe und senden Sie sie zum PCR-Test oder zum Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius.

Um eine Schlammanalyse durch Mikroskopie durchzuführen, verwenden Sie eine 60-Milliliter-Spritze, um den Schlamm am Boden eines Sumpfes abzusaugen. Teilen Sie die Probe in 15-Milliliter-Röhrchen auf. Schrauben Sie die Kappen auf und beschriften Sie die Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die 15-Milliliter-Röhrchen bei der 175- bis 250-fachen Schwerkraft für zehn Minuten in einer Zentrifuge mit Schwenkbechern. Dekantieren Sie die Tuben. Bewahren Sie die Sedimente nach dem Dekantieren auf.

Bereiten Sie anschließend die mit Zucker gesättigte Lösung vor, indem Sie 227 Gramm Kristallzucker und 177 Milliliter heißes Wasser mit einem Magnetrührer mischen. Füllen Sie die Röhrchen zur Hälfte mit der mit Zucker getränkten Lösung. Schrauben Sie die Kappen auf und mischen Sie das Sediment gründlich mit der Lösung.

Legen Sie die Röhrchen in die Zentrifugenschwenkeimer und füllen Sie sie bis zum Rand mit zuckergesättigter Lösung. Setze ein Deckglas vorsichtig auf jedes Röhrchen, so dass es mit der zuckergesättigten Lösung in Berührung kommt. Beachten Sie, dass die vier Röhrchen für jede 60-Milliliter-Probe für den Fall dienen, dass während der Zentrifugation Deckglas herunterfällt und zerbricht.

Sobald die Drehung abgeschlossen ist, heben Sie das Deckglas an, setzen Sie es auf einen Objektträger, dann beschriften Sie den Objektträger mit einem Bleistift oder Markierungsstift. Falls zu viele Deckglasbrüche auftreten, füllen Sie das Röhrchen größtenteils mit der zuckergesättigten Lösung und zentrifugieren Sie das Röhrchen. Füllen Sie die mit Zucker getränkte Lösung bis zum Rand auf, setzen Sie dann das Deckglas vorsichtig fest und warten Sie 30 Minuten.

Suchen Sie mit dem Mikroskop nach den Eiern der Pseudocapillaria tomentosa. Identifizieren Sie die bipolaren Stecker bei einer Vergrößerung von 400X. Um nach importierten Tieren in Quarantäne auf P.tomentosa-Eier zu suchen, setzen Sie männliche und weibliche Danio rerio in ein Aquarium und fügen Sie die Laichschale im Aquarium hinzu, aber verwenden Sie sie hier, um Kot zu sammeln.

Entfernen Sie nach einer Woche das Brutgerät und ernten Sie den gesammelten Schlamm in der Brutvorrichtung wie zuvor beschrieben. Der Schlamm wird am Boden eines Tanks oder Sumpfes mit einer 60-Milliliter-Spritze abgesaugt und die Probe in ein 60-Milliliter-Röhrchen überführt. Verschließen Sie die Tube mit dem Schraubverschluss und beschriften Sie die Tube.

Entsorgen Sie die Spritze. Schütteln Sie das 60-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 15 Milliliter in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Verschließen Sie die Tube mit dem Schraubverschluss und beschriften Sie die Tube.

Zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen bei der 175- bis 250-fachen Schwerkraft für zehn Minuten in einer Zentrifuge mit Schwenkbechern. Dekantieren Sie die Röhrchen und halten Sie das Sediment im Röhrchen. Enthüllen Sie den Tupfer, indem Sie die Außenverpackung entfernen, und setzen Sie das sterile Wattestäbchen der Luft aus.

Tupfen Sie das Sediment 15 Sekunden lang in das Röhrchen. Hüllen Sie den Tupfer zurück oder brechen Sie die Spitze in ein steriles Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie die Probe.

Bei minus 80 Grad Celsius einfrieren und zur PCR-Untersuchung schicken. Unter Verwendung der Sumpfabstrichmethode von 115 getesteten Fischen wurde Mycobaterium chelonae in fünf Prozent und Mycobaterium haemophilum in drei Prozent der Proben nachgewiesen und waren die einzigen pathogenen Arten, die identifiziert wurden. Aus denselben Systemen ergaben 49 Auffangabstriche das Vorhandensein von fünf Mycobaterial-Arten.

Die Odds Ratios zeigen, dass die Technik des Oberflächensumpfabstrichs eine wertvolle Alternative zum alleinigen Einsatz von Wächtern ist, um die Zebrafischanlage auf Mycobacterium zu untersuchen. Die Umweltproben wurden auch zum Screening auf Aeromonas hydrophila verwendet, die in Fisch-, Schlamm- und Oberflächenproben nachgewiesen wurden, was die Fähigkeit der vorgeschlagenen Techniken zum Screening des Fischbiotops unterstützt. Mycobacterium chelonae und Mycobacterium fortuitum werden mittels PCR häufiger in den Oberflächensumpfabstrichen nachgewiesen als in der Fischprobe.

Sobald die Probenahme gemeistert ist, dauert es nur wenige Minuten und der Nachweis von Pseudocapillaria tomentosa-Eiern kann in einer Stunde erfolgen. Diese Technik macht das Umweltscreening zu einem wichtigen Bestandteil des routinemäßigen Gesundheitsüberwachungsprogramms. Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Fischpathologie zu beantworten, wie z.B. die Beziehung zwischen bakteriellem Biofilm und bakterieller Infektion.