Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neurosphärenbasierte Kultivierungsmethoden für primäre neurale Stamm- und Vorläuferzellen zu nutzen, um die primäre Zilienbiogenese und den Transport zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der primären Zilien zu beantworten, wie z.B. die Biogenese der Zilien und den Transport von Zilienmolekülen zu den primären Zilien. In primären neuralen Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen und Neuronen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die primären Zellkriterien der neuralen Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen und Neuronen verwenden können, um die Biogenese und die Ziliarwege im Kontext des primären Ziliums zu analysieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Kultivierung neuraler Stammzellen für Anfänger eine technische Herausforderung darstellt. Wir werden zeigen, dass eine Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da die Dissektion des lateralen Ventrikels und Schritte wie die Kultivierung von Neurosphären und die Quantifizierung primärer Zilien durch Beobachtung der kritischen Schritte leicht zu erlernen sind.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer subventrikulären Zone der lateralen Ventrikale, die von einer erwachsenen Maus mit der Methode der Whole Mount Dissektion präpariert wurde. Legen Sie das Gewebe mit dem SVZ in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter 0,05%iges Trypsin-EDTA in PBS und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad.

Nach der Inkubation fügen Sie 500 Mikroliter Stoppmedium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig 20 bis 30 Mal mit einer 1-Milliliter-Spitze. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen beim Pipettieren. Danach drehen Sie die Zellen acht Minuten lang bei 500 mal G herunter.

Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 Milliliter PBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie fünfmal vorsichtig mit einer 1-Milliliter-Spitze pipettieren. Zentrifugieren Sie acht Minuten lang bei 500 mal G. Aspirieren Sie dann das Medium mit einer 1-Milliliter-Spitze und fügen Sie 1 Milliliter Basalmedium hinzu.

Nach dem Zählen der Zellen werden die Zellen aus einer SVZ in eine 10-Zentimeter-Schale mit 10 Millilitern NSC-Medium gefüllt und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid kultiviert. Nach fünf bis sieben Tagen können Neurosphären beobachtet werden. Um Zellen in angehängten Neurosphären durch Immunfärbung zu analysieren, geben Sie 1 Milliliter des Mediums, das mehrere Neurosphären enthält, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie es acht Minuten lang mit dem 500-fachen G herunter.

Nach dem Entfernen des Mediums die Kugeln 15 Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd fixieren. Nach der Entfernung von Paraformaldehyd inkubieren Sie die Kugeln über Nacht mit 30%iger Saccharose. Und dann wieder zentrifugieren.

Mit PBS waschen. Nach dem Zentrifugieren wie zuvor wird der Überstand entfernt und verworfen. Setzen Sie dann eine Pipette mit einer abgeschnittenen 1-Milliliter-Spitze ein und pipettieren Sie 500 Mikroliter OCT-Lösung auf die Neurosphären.

Übertragen Sie die OCT-Lösung mit den Neurosphären in eine Einweg-Gefrierform aus Kunststoff. Frieren Sie die Form dann mindestens 15 Minuten lang auf Trockeneis ein. Schneiden Sie Abschnitte mit einem Kryostaten.

Um die Stammzellen in der Neurosphäre sichtbar zu machen, führen Sie eine Immunfärbung gegen den Stammzellmarker Nestin durch. Um die primären Zilien in einer Neurosphäre sichtbar zu machen, führen Sie eine Immunfärbung gegen ARL13B durch. Beginnen Sie dieses Experiment ein bis zwei Tage nach der Aussaat adhärenter dissoziierter neuraler Stammzellen auf Poly-L-Lysin- und Laminin-beschichtete Deckgläser.

Wechseln Sie das Medium in den Versuchsvertiefungen auf Hungermedium und in den Kontrollwells auf frisches NSC-Medium. Weitere 24 Stunden inkubieren. Fixieren Sie die Zellen am nächsten Tag mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Fixierung zweimal jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS waschen. Und führen Sie dann eine Immunfluoreszenz mit Standardprotokollen durch. Montieren Sie die Deckgläser mit einer Montagelösung.

Trocknen Sie das Objektträgerglas dann über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nehmen Sie am nächsten Tag Bilder mit einem Kompositmikroskop mit der erforderlichen Vergrößerung auf. Die Kamera und die Objektive des Mikroskops sollten mit der mitgelieferten Software gesteuert werden.

Nehmen Sie ausreichend Z-Schnitte in Abständen von 0,5 bis 0,8 Mikrometern vor. Für die quantitative Analyse der ziliären Lokalisation in adhärenten Zellen wählen Sie drei bis acht aufeinanderfolgende Felder mit konfluenten Zellen aus, indem Sie den DAPI-Kanal betrachten. Erfassen Sie Stapel von Bildern aus jedem Feld.

Quantifizieren Sie die Anzahl der primären Zilien mit ImageJ. Öffnen Sie das Dialogfeld "Plugins Analyze" und wählen Sie das Werkzeug "Zellzähler" aus, um die Zellen mit GPCR-positiven Zilien zu zählen. Verwenden Sie ähnliche Bildintensitäts- und Kontrastparameter für alle Bilder aus demselben Experiment zum Zählen und Exportieren.

24 Stunden nach der Kultivierung wurden dissoziierte Zellen im NSC-Medium oder Hungermedium fixiert und immungefärbt gegen GPR161 (grün dargestellt), ARL13B (rot dargestellt) und DNA (blau dargestellt). GPR161-positive Zilien werden in Kontrollzellen auf der linken Seite und ausgehungerte Zellen auf der rechten Seite beobachtet. Wie in diesen vergrößerten Ansichten zu sehen.

Die weißen Pfeile und Pfeilspitzen zeigen GPR161 positive bzw. negative Zilien an. Dieses Bild zeigt die Quantifizierung von ARL13B-positiven Flimmerzellen. Die Quantifizierung erfolgt anhand von zwei Sichtfeldern von jeweils zwei technischen Replikaten eines einzigen Experiments.

Der Anteil der ARL13B-positiven Flimmerzellen steigt nach dem Hungertod an. Dieses Bild zeigt die Quantifizierung der GPR161-Lokalisierung in ARL13B-positiven Zilien in Kontrollzellen und ausgehungerten Zellen. Der Prozentsatz von GPR161, der in ARL13B-positiven Zilien lokalisiert ist, steigt ebenfalls mit dem Hungertod an.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine weitere Methode zur Kultivierung von Primärtumorzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Rolle der Zilien bei der Tumorgenese zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der primären Zilien, um die ziliäre Biogenese und den Transport in primären Neurosphären-basierten Systemen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Zilien in neuralen Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen und Neuronen analysiert, die aus Neurosphären-basierten Kulturen stammen.