Name: Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung von Neurosphären zur Untersuchung der Biogenese und des Traffickings primärer Zilien in neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht wichtige Einblicke in ziliäre Signalwege.

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Die Arbeit in S.M.s Labor wird durch Rekrutierungszuschüsse von CPRIT (R1220) und NIH (1R01GM113023-01) finanziert.

1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn <ol><li> Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat. </li><li> Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn. </li><li> Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode 48 die SVZ von der lateralen Ventrikel zu erhalten. </li><li> Platzieren Sie den lateralen Ventrikel in ein 1,5 ml-Röhrchen, 500 &amp; mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS, und inkubieren das Röhrchen für 15 min bei 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Nach 15 min, 500 &amp; mgr; l Stoppmedium und pipettieren sanft 20 - 30 mal mit einer 1 ml-Spitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren zu bilden. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zelle. </li><li> Spin down die Zellen bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen, 1 ml PBS und Resuspendieren ter Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 5 x 1 ml-Spitze. </li><li> Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium. </li><li> (Optional) Falls Zelldebris beobachtet werden, passiert die Zellen durch eine 70 &amp; mgr; m-Sieb-Zelle. </li><li> Zähle die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer; in der Regel etwa 30.000 - 60.000 Zellen / SVZ erhalten. </li><li> Platte , die die Zellen von einem SVZ in eine 10 - cm - Schale mit 10 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> (Optional) Fusion zwischen 49 Kugeln zu vermeiden, setzte 1.000 Zellen in einer einzelnen Vertiefung einer Ultra-Low-bindenden 6-Well - Platte , die mit 1,5 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2 vorbefüllt ist. HINWEIS: Nach 5-7 Tagen können Neurosphären (2A) beobachtet werden. Die Kultivierungszeit kann mit dem Alter der Maus oder dem genetischen Hintergrund unterscheiden. </li><li> In 2 ml NSC Medium alle 3-4 Tage, um die Kultur zu pflegen(Nicht entfernt das vorhandene Medium). </li></ol> 2. Analyse der Differenzierungskapazität von Neurosphären und Ciliogenesis Tests <ol><li> Um die Differenzierungsfähigkeit zu analysieren, analysiert die Neurosphären unter adhärenten Bedingungen in Differenzierungsmedium. </li><li> Sterilisieren 12 mm runde Deckgläser durch Autoklavierung oder mit UV-Exposition vor der Verwendung. Für eine adhärente Zellkultur, legte ein sterilisiertes 12 mm rundes Deckglas in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Coat das Deckglas für 10 s mit 500 ul 0,002% Poly-L-lysin (PLL). Aspirieren die Lösung und trocknen Sie es für 10-15 min. </li><li> In 500 ul Laminin-Lösung (5 ug / ul). Inkubieren des Deckglases für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Absaugen Laminin und füge 500 ul Differenzierungsmedium oder NSC Medium (undifferenzierte Kontrolle). </li><li> Für die Differenzierung Assay, Pick-up eine 100 bis 200 &amp; mgr; m-Kugel mit einer 200 &amp; mgr; l Spitze unter dem Mikroskop. Hinzufügen5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 7-10 Tage in Differenzierungsmedium. </li><li> Zur Analyse undifferenzierten Neurospheres, fügen 5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 1-2 Tage in Medium NSC. Befestigt Neurosphären ausbreiten und wachsen als Monoschicht (2B). </li><li> Nach vorsichtigem Entfernen des Mediums, fixiert die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min bei RT und dann mit PBS wäscht zweimal für 5 min bei RT. Die Platte kann bei 4 ° C für 1-2 Monate gelagert werden. HINWEIS: Neuronale Stammzellen / Vorläuferzellen in NSC Medium und differenzierten Zellen in Differenzierungsmedium zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Nestin (neurale Stammzellen / Vorläuferzellmarker), β-Tubulin III (TuJ1 monoclonal, neuronaler Marker), GFAP (saures Gliafaserprotein , Astrozyten - Marker) und O4 (Oligodendrozyten - Marker) (2B-E). Zur Analyse der Zilien, führen Immunofärbung gegen Arl13b (primäre cilia marker) und Gpr161 (ciliary GPCR) (Abbildung 3). </li><li> Montieren Sie das Deckglas mit der Lösung auf ein Objektglas montieren. Kippen Sie den Glasobjektträger überschüssige Lösung zu entfernen. </li></ol> 3. Analyse von Ciliogenesis in Neurosphären <ol><li> Um Zellen in intakten Neurosphären durch Immunfärbung, 1 ml des Kultivierungsmediums, enthaltend mehrere Neurosphären in ein 1,5 ml-Röhrchen und Abschalten bei 500 · g für 8 min zu analysieren. Fix die Kugeln mit 4% (PFA), nachdem das Medium für 15 min entfernt und waschen mit PBS. Spin-Down-Kugeln bei 500 · g für 8 min, Überstand entfernen, und Inkubieren der Kugeln O / N mit 30% Saccharose bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze verwendet, und fügen 500 ul der OCT-Lösung mit einer 1 ml cut Spitze verwendet wird. Schneiden Sie die Kante der Spitze um die Öffnung zu erweitern, wie Oktober viskos ist. </li><li> Überträgt die OAT Lösung, die die Neurosphären in eine Einweg-Kunststoff-Gefrierform enthält (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Frieren Sie das malt auf Trockeneis für 15 Minuten mindestens. </li><li> (Optional) Stoppen Sie das Experiment und speichern Sie die Form in einer -80 ° C Gefrierschrank für bis zu 1 Jahr. </li><li> Schneiden Sie die Abschnitte mit einem Kryostaten; die Dicke der Abschnitte sollten 15-30 um betragen. </li><li> Um die primären Zilien in einer Neurosphäre zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Arl13b (Abbildung 4). </li></ol> 4. Kultur und Passage von Neurosphären und Adherent NSCs <ol><li> Passage der Neurosphären, während die Kugelgröße zwischen 100-200 &amp; mgr; m ist; wenn die Neurosphären zu groß sind (300 &amp; mgr; m oder darüber), sind sie für Experimente nicht ideal. </li><li> Übertragen der Neurosphären in ein 50 ml-Röhrchen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von Spin-Down bei 500 · g für 8 min. </li><li> Überstand verwirft einen Sauggebläses verwendet, 500 &amp; mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Die Menge an Trypsin, variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Kugeln. </li><li> Fügen 500 ul Serummedium und sanft Rohrt 20-mal mit einer 1 ml-Spitze. </li><li> Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium. </li><li> (Optional) Falls Zelldebris oder undissoziierten Neurosphären zu sehen sind, übergeben Sie die Zellen durch ein 70 &amp; mgr; m-Sieb-Zelle. </li><li> Passage der Zellen in einer 10 cm - Schale in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 in NSC Medium; die Zellen werden für den nächsten Durchgang nach einer Woche fertig sein. </li><li> (Optional) um die Zellen gefrieren, fügt Medium Einfrieren 500.000 bis 1.000.000 Zellen / ml-Suspension zu erzeugen. Einfrieren der Zellen unter Verwendung von Kryo-Gefrierbehältern; undissoziiertes Neurosphären können auch eingefroren werden. </li><li> Für die adhärente Kultur, dillute um die Zellen zu 50.000 Zellen / cm 2 auf PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser mit NSC Medium und die Kultur für 1-2 Tage. </li></ol> 5. Starvation und Analyse von Cilia <ol><li> Bereiten Hungermedium (Tabelle 1). </li><li> 1-2 Tage nach der ersten plating adhärenter Zellen nach dem Dissoziation Änderung NSC Medium in einer Vertiefung (Kontrolle) und Hungermedium in einer anderen Vertiefung (Versuch). </li><li> Kultur der anhaftenden Zellen für 24 h. </li><li> Fix die Zellen mit 4% PFA in PBS für 15 min bei RT und wäscht zweimal mit PBS für jeweils 5 min bei RT. </li><li> (Optional) Stoppen des Experiments und speichert die 24-Well-Platten mit Deckgläschen in PBS bei 4 ° C für 1-2 Monate. </li><li> Führen Sie ein Immunofluoreszenz - Protokoll zum Färben von 7, 50. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser mit Befestigungslösung. Trocknen Sie die Gleitglas O / N bei RT im Dunkeln. </li><li> Erwerben von Bildern auf einem zusammengesetzten Mikroskop bei der notwendigen Vergrößerung. Verwenden, um ein Mikroskop, eine Kamera und Ziele (40X / 63X 1.3 Öl und / 1,4-Öl), gesteuert, um die Software begleitet. Nehmen ausreichende z Schnitte an 0,5-0,8 &amp; mgr; m Intervallen (Abbildung 5). </li><li> Für die quantitative Analyse der Lokalisierung in ciliaryadhärenten Zellen erwerben Stapel von Bildern 3-8 aufeinanderfolgende Felder mit konfluenten Zellen durch Tauchen in die DAPI Kanal suchen. Quantifizierung der Anzahl der primären Zilien mit ImageJ / Fiji. Typischerweise nutzen das „Zellenzähler“ Werkzeug in der ImageJ Plugins&gt; Analysieren Dialogfeld die Zellen mit GPCR-positiven Zilien zu zählen; maximale Projektionen aus Stapeln von Bildern kann auch aus ImageJ / Fiji.Use ähnlicher Bildintensität und Kontrastparameter für alle Bilder aus dem gleichen Experiment zum Zählen und Exportieren Zwecke exportiert werden. </li></ol> 6. Transfektion von Neurosphären <ol><li> Adhere dissoziierten Zellen auf Deckgläser für 24 h. Verwenden, um eine Zelldichte typischerweise zwischen 75.000 und 150.000 Zellen in 500 ul Medium NSC in einem einzigen Well einer 24-Well-Platte. </li><li> Mischen 25 ul reduzierten Serummedium und 1,5 ul Transfektionsreagenz in ein 0,5 ml Mikroröhrchen durch Vortexen für 5 s. </li><li> Hinzufügen 2,5 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA mit einer getrennten 0,5 ml microtube 25 ul reduziert Serum enthaltenden Medien und mische für 5 s durch Vortexen. </li><li> 1 &amp; mgr; l Transfektionsreagenz an dem zweiten Mikroröhrchen, enthaltend DNA und mischt für 5 s durch Vortexen. </li><li> Fügen Sie die Mischung aus dem DNA-enthaltenden Rohr mit dem ersten Mikroröhrchen und Mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 10-15 min bei RT. Nach der Inkubation vorsichtig hinzu Das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Vertiefungen auf der Oberseite des NSC-Medium (500 ul / Vertiefung). </li><li> Ändert die Medium 24 h nach der Transfektion zu steuern Medium (NSC-Medium) oder Hungermedium (500 &amp; mgr; l / Well). </li><li> Fixieren Sie die Zellen durch das Medium zu 4% PFA Wechsel nach 24 h und führt Immunofärbung; typischerweise bis zu einem 10% igen Transfektionseffizienz wird dieses Protokoll erhalten werden. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 &amp; mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 &amp; mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, neurale S...

Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung 1, 2 und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion 3, 4 . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh - Rezeptor 5 Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) 6; und Gpr161 7 ein Orphan - G - Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die sich negativ auf die Shh - Weg reguliert, lokalisieren Zilien in einer dynamischen Art und Weise. Multiple GPCRs wurde auf die Zilien in Neuronen im Gehirn 7, 8, 9, 10 lokalisieren berichtet </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekte in Cilien und Zilien generierte Signalwege beeinflussen multiple Gewebe und werden als Ziliopathien 17, 18, 19 gemeinsam bekannt. Das Ziliopathie Krankheitsspektrum umfasst häufig die Entwicklung des Nervenstörung, wie kraniofazialen Anomalien 20, 21, 22. Außerdem regulieren primären Zilien in hypothalamischen Neuronen zentralen Sättigungswege und führen Defekte in 23 zentrale Fettleibigkeit, Übergewicht in syndromic Ziliopathien wie Bardet Biedel Syndrom 24 Spiegelung. Zusätzlich Signalisierungsneuropeptid-Rezeptor in Cilien reguliert central Sättigungsweg 11, 14. Ciliary Lokalisierung von Adenylylcyclase III (ACIII) und GPCRs wie Somatostatin - Rezeptor 3 in Hippokampus - Neuronen führt in neuartigen Objekterkennungsfehlern und Gedächtnisdefiziten 25, 26 und verläuft parallel einen Mangel an Integrität ciliary 27. Die Entwicklungsaspekte der Zilien-generated-Signalisierung sind eng mit Gewebshomöostase gebunden; insbesondere sind Zilien wichtig für die Progression von Shh-Subtyp Medulloblastom aus Granulat Vorläufern im Cerebellum 28, 29 entstehen. So spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, nach der Geburt, und adulter neuronaler Entwicklung und Funktion. Neuronale Stammzellen (NSC) befinden sich in der Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel, die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und derventrikulären Zone des dritten Ventrikels im Hypothalamus bei Säugetieren 30, 31, 32. NSCs sind multipotent , besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns und der regenerativen Medizin 30. Die meisten NSC in dem SVZ sind ruhende und besitzen ein einsames primäres cilium , die, in vielen Fällen 33 an den lateralen Ventrikel erstreckt. Die primären cilium Signale über die Lokalisierung der verschiedenen Rezeptoren, nachgeschaltete zelluläre Antworten zu induzieren, insbesondere in Bezug auf Shh, TGFß, und Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Wege 2, 34, 35, 36. Da primäre Zilien in die lateralen Ventrikel erstrecken, wird die Hypothese aufgestellt , dass die primären Zilien Cytokine in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfassen , 37 zu aktivieren NSC </sup&gt;. Neuere Studien legen nahe , dass der Shh - Signalweg und primäre Zilien sind entscheidend für die Aktivierung von Stammzellen bei der Reparatur und Regeneration von mehreren Geweben, einschließlich dem Riechepithel, Lunge, Niere und 38, 39, 40, 41. Jedoch kommuniziert die Mechanismen, durch die CSF mit NSC und ob primäre Zilien beteiligt sind, sind nicht bekannt. Adhärenten NSCs in Kultur sind bewimpert; Shh Stoffwechselweg Komponenten wie Smo und Gpr161 in Cilien lokalisieren; und Shh reaktions 42. Somit kann NSC als wichtiges Modellsystem dienen der Shh Stoffwechselweg, ciliary Handel und neuronalen Differenzierungswege zu untersuchen. Darüber hinaus von NSCs differenzierten Neuronen können auch für ciliare Handels-Assays verwendet werden. Neurosphären werden von Clustern von frei schwebenden Zellen gebildet aus der Proliferation von NEURA ergebendenl Stammzellen / Vorläuferzellen , die in Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und nicht klebender Oberflächen 43, 44 wachsen. Neurospheres dient in vitro Kulturmodellen als wichtiges neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in der normalen Entwicklung und Krankheit 31, 45, 46, 47 zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Neurosphäre basierende Assay zur Kultivierung von neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und zur Differenzierung zu Neuronen / Glia. Wir betonen , insbesondere den Handel mit Komponenten Zilien neuraler Stammzellen / Vorläuferzellen und differenziert Neuronen (Figur 1) signalisiert. Im Gegensatz zu primären Neuronen Kulti, sind primäre Neurosphären relativ leicht zu Kultur, zugänglich sind, um mehrere Durchgänge und Gefrier-Auftau-Zyklen, und die Differenzierung zu Neuronen / Glia eingehen können. Wichtig ist, stellten wir fest, dass die Neurosphäre abgeleiteten neuralenStamm- / Progenitorzellen und differenzierte Neuronen in Kultur bewimpert und lokalisieren Moleküle relevant Zilienfunktion in diesen Kompartimenten Signalisierung. Neurosphere Basis Kultivierungsverfahren kann als ein ideales Modellsystem dienen zur Untersuchung von ciliogenesis und ciliare Handel in NSCs und differenzierten Neuronen.

<table><tbody><tr><td>12 mm rundes Deckglas</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm Petrischale, aufschiebbarer</td><td>Deckel Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm Schale</td></tr><tr><td>70 & Mikro; m-Zell-Sieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey Anti Rabbit, Alexa 488 Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Arl13B, Klon N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serumfrei</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Rinderpankrese</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Einweg-Vinyl-Probenformen</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10X, modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G Lösung</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Eindecklösung</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti Maus IgG1 Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Ziege Anti Maus IgG1, Alexa 555 Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti Maus IgG2a Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Ziege Anti Maus IgG2a, Alexa 555 Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>hausgemacht</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>human bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm tief</td><td>verbessert neubauer</td></tr><tr><td>Isothesie</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Isofluoran</td></tr><tr><td>Laminin aus Engelbreth-Holm-Swarm Sarkom Basalmembran</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Ergänzung (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT Verbindung</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes EGF-Protein, CF</td><td>F- und Entwicklungssysteme</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>EGF-Schere</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>COSTAR 6-Well-Platte, mit Deckel mit flachem Boden, Polystyrol mit extrem geringer Haftfläche, steril</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>6-Well-Platte</td></tr><tr><td>&beta;-Tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

mit dem hauptneurosphäre kulturen primäre cilia zu studieren

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Das primäre Zilium ist grundlegend wichtig für die Proliferation von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und für die neuronale Differenzierung während des embryonalen, postnatalen und adulten Lebens. Darüber hinaus besitzen die meisten differenzierten Neuronen primäre Zilien, die Signalrezeptoren wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Signalmoleküle wie Adenylylcyclasen beherbergen. Das primäre Zilium bestimmt die Aktivität mehrerer Entwicklungswege, einschließlich des sonic hedgehog Signalwegs während der embryonalen neuronalen Entwicklung, und unterstützt auch die kompartimentelle subzelluläre Signalübertragung während der adulten neuronalen Funktion. Es überrascht nicht, dass Defekte in der primären Zilienbiogenese und -funktion mit Entwicklungsanomalien des Gehirns, zentraler Adipositas sowie Lern- und Gedächtnisdefiziten in Verbindung gebracht wurden. Daher ist es unerlässlich, die primäre Zilienbiogenese und den ziliären Transport im Kontext von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen zu untersuchen. Kultivierungsmethoden für primäre Neuronen erfordern jedoch beträchtliches Fachwissen und sind nicht für Frost-Tau-Zyklen geeignet. In diesem Protokoll diskutieren wir Kultivierungsmethoden für gemischte Populationen von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen unter Verwendung primärer Neurosphären. Die Neurosphären-basierten Kultivierungsmethoden bieten die kombinierten Vorteile der Untersuchung primärer neuraler Stamm-/Vorläuferzellen: Zugänglichkeit für mehrere Passagen und Gefrier-Tau-Zyklen, Differenzierungspotenzial in Neuronen/Glia und Transfektionsfähigkeit. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass neurale Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierte Neuronen in Kultur zilieniert sind und Signalmoleküle, die für die Ziliarfunktion relevant sind, in diesen Kompartimenten lokalisieren. Unter Verwendung dieser Kulturen beschreiben wir außerdem Methoden zur Untersuchung der Ziliogenese und des Ziliartransports in neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen. Diese Neurosphären-basierten Methoden ermöglichen es uns, zilienregulierte zelluläre Signalwege, einschließlich der G-Protein-gekoppelten Rezeptor- und Sonic-Hedgehog-Signalwege, im Kontext von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen zu untersuchen.

Die Zellen aus dem SVZ in NSC - Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nestin. Zwei...

Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kultivierungsmethoden basierend auf Neurosphären für primäre neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen zu nutzen, um die Biogenese und den Transport in den primären Zilien zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der primären Zilien zu beantworten, wie beispielsweise die Biogenese der Zilien und der Transport von Zilienmolekülen zu den primären Zilien in primären neuronalen Stammzellen, neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die primären Zellkriterien von neuronalen Stammzellen, neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen nutzen können, um die Biogenese und ziliären Signalwege im Kontext des primären Ziliums zu analysieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Kultivieren neuronaler Stammzellen für Anfänger technisch anspruchsvoll ist. Wir werden zeigen, dass eine Demonstration dieser Methode entscheidend ist, da die Dissektion des Seitenventrikels sowie Schritte wie das Kultivieren von Neurokugeln und die Quantifizierung primärer Zilien leicht durch Beobachtung der kritischen Arbeitssc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Die Durchführung von In-vitro-Experimenten, um in vivo-Bedingungen so angemessen wie möglich zu reflektieren, ist keine leichte Aufgabe. Die Verwendung von primären Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Zellbiologie in einem ganzen Organismus. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie man erfolgreich wachsen und Kultur embryonale Maus Kleinhirn Neuronen.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

Primäre Zilien sind extrazelluläre Strukturen, die mit dem Centriole verbunden sind. Der primäre Ziliennachweis durch immunfluoreszierende Färbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern führt. In diesem Protokoll wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop abgebildet.

Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Der Einsatz von künstlicher Intelligenz (Ai) zur Analyse von Bildern entwickelt sich im Vergleich zu häufig verwendeten Methoden zu einem leistungsfähigen, weniger voreingenommenen und schnellen Ansatz. Hier trainierten wir Ai, eine zelluläre Organelle, primäre Zilien zu erkennen und Eigenschaften wie Länge und Färbeintensität rigoros und reproduzierbar zu analysieren.

Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Diese Methode beschreibt die Nutzung des endogenen Signals in einem transgenen ARL13B-CENTRIN-2-Mausmodell, um primäre Zilien in situ dreidimensional über große Bereiche mineralisierten Gewebes abzubilden, von der Gewebeentnahme bis zur Analyse der Zilienorganisation. Dieses Protokoll kann auch auf andere Arten von Geweben angewendet werden.

Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Lernen Sie die Kultivierung von Neurosphären zur Untersuchung der Biogenese und des Traffickings primärer Zilien in neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht wichtige Einblicke in ziliäre Signalwege.

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

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