Name: Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die intrazelluläre Lokalisation von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea senegalensis Spermatozoen mittels konfokaler Mikroskopie und spezifischer Fluorochrome. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse oxidativen Stresses.

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Wir danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Diese Arbeit wurde von AGL201568330-C2-1-R-Projekt (MINECO/FEDER) finanziell unterstützt. David G. Valcarce wurde finanziert durch die Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) und Fondo soziale Europeo. Autoren anerkennen Dr. Ana Riaza und Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero und José Ramón Guiérrez. Wir danken auch Paula Fernández Colado für Videografie.

Hinweis: Fluorochrom Inkubation und konfokale Analyse dauert mindestens 2-3 h für ein Steuerelement und einer behandelten Probe. Datenverarbeitung ist in dieser Berechnung nicht enthalten. Benötigten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien. Dieses Protokoll kann auf frische oder kryokonservierten Samenzellen angewendet werden. Solea Senegalensis ist eine Fischart, die in kaltem Wasser, arbeiten immer unter kalten Bedingungen (4-7 ° C) laicht. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über das Protokoll.
1. vorbereitende Arbeiten vor dem Experiment
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 mM, die Mitochondrien Fleck Stammlösung in analysenrein DMSO.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1 μg/mL 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Stammlösung in entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 200 mOsm/kg-Ringer-Lösung (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)</li>
	<li>Bereiten Sie einen 4 mM 2, 7-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (RLKV-DA)-Stammlösung in analysenrein Methanol. Hinweis: Halten Sie die Stammlösungen in Aliquote bei-20 ° C bis benötigt.</li>
	<li>Legen Sie die Microcentrifuge bei 4-7 ° C.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung vor der Fluorochrom Inkubation
Hinweis: Schonende Behandlung von Spermien ist wünschenswert, beim Pipettieren und resuspending.
<ol><li>Arbeiten mit kryokonservierten Zellen bereiten Sie ein Wasserbad Auftauen bei 40 ° C für Solea Senegalensis Spermien10 vor. Tauchen Sie die Stroh Proben im Wasserbad für 7 s.</li>
	<li>Mit einer Schere um zu schneiden, die Probe in ein Microfuge Gefäß entleeren und 1000 X g, 4-7 ° C für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie Seminalplasma oder Seminalplasma mit Kryoprotektanten aus der kryokonservierten Probe durch pipettieren, um jede Komponente zu verwerfen, die die Färbung Protokoll stören könnten.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 50-100 μL von 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer-Lösung.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Samenzellenkonzentration mit einem Neubauer oder eine ähnliche Zählkammer unter eine stereoskopische Mikroskop.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension bis auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in einem Endvolumen von 0,5 mL bei 4 ° C Ringer-Lösung.</li>
</ol>(3) Fluorochrom Inkubation
Hinweis: Bei schlechten Lichtverhältnissen, vor allem in Lösung müssen Fluorochromes behandelt werden.
<ol><li>Hinzufügen von 3.125 μl der Stammlösung RLKV-DA (endgültige Konzentration in der Probe: 25 μM) zu den Arbeiten Probenverdünnung. 40 min in Dunkelheit10bei 4-7 ° C inkubieren.</li>
	<li>Nach 30 min hinzufügen 0,5 μL der Vorratslösung DAPI (endgültige Konzentration in der Probe: 2 μM) und 0,5 μL der Mitochondrien Stammlösung Fleck (endgültige Konzentration in der Probe: 100 nM) auf die Probe. Inkubieren Sie beide Fluorochromes für 10 Minuten im Dunkeln.</li>
</ol>(4) Probenvorbereitung für die konfokale Mikroskopie
<ol><li>Nach der Inkubationszeit Zentrifugieren der Zellsuspension bei 1000 X g, 4-7 ° C für 1 min.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand sorgfältig durch pipettieren.</li>
	<li>Fügen Sie eine 10-20 μl 200 mOsm/kg Ringer-Lösung.</li>
	<li>Platz 5 μl einer konzentrierten Zellsuspension drop auf einer Folie.</li>
	<li>Sorgfältig, legen Sie eine Abdeckung über die Vorbereitung und mit Lack zu versiegeln. Sobald der polnischen trocken ist, ist die Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie bereit.</li>
</ol>5. konfokale Setup vor dem Experiment
Hinweis: Je nach dem Mikroskop konnte RLKV-DA "verbrennen". Die besten Voraussetzungen mit einer nicht-wertvolle Probe zuerst zu etablieren.
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop, Laser, Kamera und den Computer unter dem Mikroskop.</li>
	<li>Erregung Laser unter Berücksichtigung der Anregung und Emission Maxima jedes Fluorochrom festgelegt:<ol>
<li>Für DAPI, verwenden eine Erregung bis zu 358 nm und eine Emission maximal 465 nm.</li>
		<li>Für den mitochondrialen Fleck verwenden eines Anregung maximal 644 nm und eine Emission maximal 662 nm.</li>
		<li>Für RLKV-DA, verwenden eine Erregung bis zu 504 nm und eine Emission maximal 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beginn der Arbeit mit 25 X Objektiv auf die Spermien konzentrieren. Wählen Sie den DAPI-Kanal zu konzentrieren, weil diese Fluorochrom die höchste Intensität meldet. Nachdem die Zellen konzentriert sind, verwenden Sie ein 63 X oder 100 X Objektiv für eine gründliche Bewertung weil Solea Senegalensis Spermien etwa 2 μm beträgt.</li>
	<li>Optimieren Sie für jeden Kanal die Lochkamera, die Verstärkung und die Spannung. Passen Sie auf die gleiche Weise den digital Offset um Hintergrund zu verringern an. Nachdem alle Parameter für die verwendeten Fluorochrom optimiert sind, speichern Sie die Einstellungen. Für eine routinemäßige Experiment für eine einzige Samenzelle Solea Senegalensis wir verwendet die folgenden (diese Parameter können in jedem Experiment ändern): Loch 1 und die Gewinn-Spannung von 750 V.</li>
</ol>6. Erwerb von Bildern
<ol><li>Wählen Sie die gewünschte Qualität-Bedingungen für die Bildaufnahme. Definieren Sie Übernahme Einstellungen wie Bildformat, Bit-Tiefe, leichte Blechdicke zu, und wählen Sie einzelne beidseitige Beleuchtung. Für eine routinemäßige Experiment für einen einzigen Solea Senegalensis Spermien verwendet wir folgende (diese Parameter können in jedem Experiment ändern): Rahmengröße von 1024 px; Bits pro Pixel 16; Scan-Geschwindigkeit von 2-4).</li>
	<li>Öffnen Sie und zentrieren Sie den Scan-Bereich zu beginnen und nehmen ein Bild des Feldes.</li>
	<li>Mit dem Crop-Werkzeug, wählen Sie die Region von Interesse und live.</li>
	<li>Einstellen Sie mit Hilfe des Werkzeugs Range Indikator den digital Offset um den Hintergrund zu verringern. Dies gilt für jeden Kanal und nehmen Sie das Bild.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Qualität der einzelnen Kanäle für jede Fluorochrom und deren Kombinationen.</li>
</ol>7. erstellen ein 3D Bild Video
<ol><li>Z-Stapel Erwerb Einstellungen.<ol>
<li>Wählen Sie in der Software Z-Stapel.</li>
		<li>Wählen Sie die einzelne Zelle, einer Gruppe von Zellen oder Interessenbereich und konzentrieren Sie es zu.</li>
		<li>Die Z-Stapel mit den Optionen "Erste Scheibe" und "Letzte Schicht" abzugrenzen und den Z-Schritt zum Intervall bis 0,2 µm mit Hilfe der Feinfokus zu etablieren. Wählen Sie DAPI Kanal konzentrieren, denn diese Fluorochrom möglicherweise die höchste Intensität und Sie können problemlos den ganzen Kopf der Spermien auswählen. Wählen Sie den optimalen Aufnahmeparameter für jeden Kanal und führen Sie das Experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie das Z-Stapel-Experiment. Die Kanäle aufgeteilt und die Lokalisierung von jedes Signal innerhalb der Zellen zu beobachten.</li>
	<li>Z-Stapel-Prozess.<ol>
<li>Volumen-Rendering: Sobald das Experiment beendet ist, wählen Sie die Optionen der Z-Stapel-Verarbeitung-Software und wählen Sie das Volume Option rendern. Wählen Sie die Anzahl der Schritte und den Grad der Drehung (360°). Speichern Sie die Datei mit einem video-Erweiterung.</li>
		<li>Stereo Anaglyph: Stereo Anaglyph in den Optionen wählen Prozessfenster. Dieses Tool ermöglicht es, um ein 3D-Bild mit Kanäle teilen video zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es ist bekannt, dass Mitochondrien wichtigen Organellen für die Beweglichkeit der Spermien und Funktion sind. Diese Organellen sind gleichzeitig direkt an ROS-Produktion beteiligt. Interessanterweise sind kontrollierte ROS für richtige Sperma Funktion1benötigt. Positive Beziehungen zwischen Fruchtbarkeit und oxidativen Stress sind Säugetiere11 erwiesen, aber übermäßigen Niveaus beeinflussen Spermien Qualität12. Ein entscheidender Faktor, die entschei...

Reaktive Sauerstoff-Spezies-Produktion mit Spermienqualität verknüpft wurde vor kurzem1. ROS-Produktion in den Mitochondrien einen normalen physiologischen Prozess betrachtet werden kann, zwar oxidativer Stress durch ein Übermaß an ROS-Produktion eine klare Ursache des Schadens in Spermien auf verschiedenen Ebenen. Beim Menschen ist oxidativer Stress zugeordnet männliche Unfruchtbarkeit, Motilität und die Fähigkeit zur Rechtsfähigkeit2unterziehen zu verändern; bei Säugetieren ist Veränderung der DNA-Integrität in Tiefgefriersperma Proben auch zur Synthese von H2O23verbunden.
Kryokonservierung ist ein gängiges Verfahren für gen-banking in der Aquakultur. Diese Technologie ist besonders wichtig bei Arten mit reproduktiven Problemen wie Solea Senegalensis. Dieses wertvollen Arten auf dem Markt zeigt reproduktiven Dysfunktion bei Personen, die in Gefangenschaft aufgrund mangelnder Balz geboren. Diese Tatsache macht die Kryokonservierung von Spermien Spermien Verfügbarkeit für künstliche Befruchtung erforderlich. Jedoch könnte die Kryokonservierung eine Quelle von oxidativem Stress, die schädlich für Spermien4 sein könnte, wie Studien eine positive Wirkung von antioxidativen Supplementierung berichtet haben. ROS-Hemmung durch mitochondriale gezielte antioxidative war angeblich vorteilhaft für die Kryokonservierung von Spermien in gelbe Wels5.
Daher sind die Konzentrationen von ROS in Spermaproben wichtig zu wissen, vor allem nach Kryokonservierung6,7 , weil diese Moleküle als ein Nachteil für das Überleben der Spermien und Fruchtbarkeit8erkannt worden sind. Darüber hinaus könnte lernen die Verteilung von ROS innerhalb der Zelle entscheidend für die Höhe des potenziellen Schadens ableiten. Als Beispiel könnte niedrigen Niveau von ROS in den Mitochondrien können davon ausgegangen werden, normal und mit Spermienfunktion kompatibel, aber hohe Konzentrationen von ROS im Zellkern Indikatoren der Spermien-DNA-Schäden. H2O2 ist eines der wichtigsten ROS, die von den Mitochondrien freigesetzt werden könnten und den Kern zu durchdringen, denn es ist eine kleine und weniger Ladung-Molekül-9. Dichlorofluoresceins Diacetat (RLKV-DA) kann insbesondere intrazelluläre Peroxid emittierenden grünen Fluoreszenz zeigen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Erfassung von H2O2 intrazelluläre Lokalisation in Solea Senegalensis Spermien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlordidihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Mikroskopie</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Analytische Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Analytische Sorte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerDeep Red&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge (gekühlt)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der intrazellulären lage von reaktiven sauerstoffspezies in solea senegalensis spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidativer Stress ist einer der wichtigsten Faktoren in abnehmender Qualität der Spermien. Entwicklung von effizienten Protokolle zur Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Spermien ist von großer Bedeutung in irgendeiner Sorte, aber diese Methoden sind selten genutzte und noch weniger in teleost. Kryokonservierung ist eine nützliche Technik in der Aquakultur für verschiedene Zwecke, einschließlich gen Banking und garantierte Verfügbarkeit der Spermien im Laufe des Jahres. Einfrieren/Auftauen Verfahren könnte dazu führen, dass ROS-Produktion und schädigen die Spermien. Bedenkt, dass die potenziellen Schäden kann ein Übermaß an ROS-Produktion in Spermien je nach ihrer Lokalisation, hier eine detaillierte Methode, H2O2 erkennen und bewerten die intrazelluläre Lokalisation durch konfokale Mikroskopie führen steht zur Verfügung. Zu diesem Zweck eine Kombination von 3 Fluorochromes (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV-DA), ein live Mitochondrien Fleck und 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)) werden verwendet, um die Co Lokalisierung von H2O 2bewerten mit Samenzellen Kerne oder Mitochondrien in Solea Senegalesis Spermaproben.

Konfokale Mikroskopie ist eine ideale Methode zur intrazellulären ROS-Auswertung in teleost Spermien. Die Kombination der drei Fluorochromes (DAPI, Mitochondrien Fleck und RLKV-DA) präsentiert in dieser Studie (Abbildung 1) bietet viele nützliche Informationen, die in der Grundlagenforschung aufgebracht werden kann und kann Anwendungen bei der Verbesserung von Verfahren, die in industrielle Aquakultur Anlagen, z. B. Kryokonservierung Protokolle. Verschiedene ...

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Erkennung von H2O2 Lokalisierung innerhalb Solea Senegalensis Spermien mit einem sensiblen Fluorochrom RLKV-DA für ROS, ein Leben Mitochondrien Fleck für Mitochondrien und DAPI für Kerne Visualisierung, beziehungsweise. Das Protokoll soll innerhalb von 2 h mit frischen oder aufgetauten Spermien durchgeführt werden.

Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die intrazelluläre Lokalisation reaktiver Sauerstoffspezies in Spermatozoen von Solea senegalensis mittels konfokaler Mikroskopie zu bewerten. Reaktive Sauerstoffspezies beeinträchtigen die sichere Aufrechterhaltung der effektiven Spermienfunktion und verursachen zelluläre Schäden auf verschiedenen Ebenen. Spermatozoen könnten besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress sein, da Lipidperoxidation negative Auswirkungen auf die Motilität und die Befruchtungsfähigkeit haben kann.Reaktive Sauerstoffspezies können sogar eine intrinsische apoptotische Kaskade auslösen. Peroxid wird aus den Mitochondrien freigesetzt und kann, da es ein kleines, ungeladenes Molekül ist, in den Zellkern eindringen und die DNA beeinflussen. In diesem Protokoll verwenden wir einen Fluorophor, der nach Einbau in die Zelle durch eine Oxidationsreaktion modifiziert werden kann und grüne Fluoreszenz emittiert.Daher können Sie die Lokalisation reaktiver Sauerstoffspezies exakt bestimmen. In diesem Video arbeiten wir mit Spermatozoen von Solea senegalensis, aber Sie können dieses Protokoll auch mit verwandten Arten mit kommerziellem Interesse oder mit M

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Messung von oxidativem Stress in lebenden Zebrafischembryonen. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowohl in ganzen Embryogeweben als auch in Einzelzellpopulationen. Mit diesem Protokoll werden sowohl qualitative als auch quantitative Analysen durchgeführt.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Spermatozoan Membran Integrität, eine zelluläre Funktion verbunden mit Sperma Befruchtung Kompetenz zu bewerten. Wir beschreiben drei Techniken für die fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen: gleichzeitige Färbung mit spezifischen fluoreszierende Sonden, Fluoreszenz-Mikroskopie und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie. Beispiele für die Kombination der Methoden werden ebenfalls vorgestellt.

Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Untersuchung von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma vorgestellt. Mit Hilfe eines computergestützten Samenanalysesystems (CASA) kann die Konzentration von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma innerhalb von insgesamt 60 Minuten ermittelt werden, wodurch die Effizienz des andrologischen Labors und der Andrologen effektiv verbessert wird.

Die Untersuchung von Peroxidase-positiven Leukozyten im Sperma

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Lernen Sie die intrazelluläre Lokalisation von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea senegalensis Spermatozoen mittels konfokaler Mikroskopie und spezifischer Fluorochrome. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse oxidativen Stresses.

Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa

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