Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa
11. März 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Erkennung von H2O2 Lokalisierung innerhalb Solea Senegalensis Spermien mit einem sensiblen Fluorochrom RLKV-DA für ROS, ein Leben Mitochondrien Fleck für Mitochondrien und DAPI für Kerne Visualisierung, beziehungsweise. Das Protokoll soll innerhalb von 2 h mit frischen oder aufgetauten Spermien durchgeführt werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die intrazelluläre Lokalisation reaktiver Sauerstoffspezies in Spermatozoen von Solea senegalensis mittels konfokaler Mikroskopie zu bewerten. Reaktive Sauerstoffspezies beeinträchtigen die sichere Aufrechterhaltung der effektiven Spermienfunktion und verursachen zelluläre Schäden auf verschiedenen Ebenen. Spermatozoen könnten besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress sein, da Lipidperoxidation negative Auswirkungen auf die Motilität und die Befruchtungsfähigkeit haben kann.
Reaktive Sauerstoffspezies können sogar eine intrinsische apoptotische Kaskade auslösen. Peroxid wird aus den Mitochondrien freigesetzt und kann, da es ein kleines, ungeladenes Molekül ist, in den Zellkern eindringen und die DNA beeinflussen. In diesem Protokoll verwenden wir einen Fluorophor, der nach Einbau in die Zelle durch eine Oxidationsreaktion modifiziert werden kann und grüne Fluoreszenz emittiert.
Daher können Sie die Lokalisation reaktiver Sauerstoffspezies exakt bestimmen. In diesem Video arbeiten wir mit Spermatozoen von Solea senegalensis, aber Sie können dieses Protokoll auch mit verwandten Arten mit kommerziellem Interesse oder mit Müttern wie Sibrifis oder Mirica verwenden. Einige Beispiele für den Einsatz dieser Technik in den Bereichen physiologisch-reaktive Biologie oder Imkerei sind.
Die Auswertung der Kryopräzipitation gemäß Protokoll. Der Vergleich der reaktiven Sauerstoffspezies-Markierungen vor und nach dieser Spermienaktivierung. Oder Sie können die Markierungen reaktiver Sauerstoffspezies mit guten und schlechten Atmern korrelieren.
Bereiten Sie zunächst die Stammlösungen Ihrer Fluorochrome vor. Berücksichtigen Sie, dass die Handhabung der Fluorochrome gemäß den Empfehlungen des Sicherheitsdatenblatts erfolgen muss. Besondere Vorsicht ist beim Wiegen und Herstellen der Stammlösungen geboten.
Bewahren Sie die Stammlösungen in Aliquoten bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie benötigt werden. In diesem Protokoll verwenden wir drei Fluorochrome. Der fernroten fluoreszierende Farbstoff färbt Mitochondrien in lebenden Zellen und kann für die mitochondriale Lokalisation verwendet werden.
DAPI, das ein weit verbreiteter Farbstoff in der fluoreszenzmikroskopischen DNA-Färbung ist. Es bindet stark an adenin-thyminreiche Bereiche in der DNA. Und 27-Dichlorofluorescein diacetat ist ein zellgängiger, nicht fluoreszierender Farbstoff.
Es wird intrazellulär deestifiziert und bildet bei Oxidation hochfluoreszierendes 27-Dichlorofluorescein. Dieses Protokoll kann mit frischen oder kryokonservierten Spermatozoen begonnen werden. In diesem Fall verwendeten wir eine kryokonservierte Probe.
Bereiten Sie ein Bad zum Auftauen bei 40 Grad Celsius vor. Reinigen Sie das Material. Unter Verwendung des geeigneten Körperschutzes wählen Sie Ihren kryokonservierten Strohhalm aus.
Tauchen Sie den Strohhalm sieben Sekunden lang in das Wasserbad ein. Geben Sie die aufgetaute Probe mithilfe einer Schere in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Arbeiten Sie stets bei vier Grad Celsius.
Zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang. Entfernen Sie vorsichtig die Kryoprotektiva, ohne die pelletierten Sowels zu beeinträchtigen. Resuspendieren Sie in einem kleinen Volumen von 50 oder 100 Mikrolitern RINGA-Lösung.
Geben Sie eine Verdünnung Ihrer Zellsuspension in eine neue Bürker-Zählkammer oder eine ähnliche Zählkammer ein und zählen Sie die Zellen. Berechnen Sie die Konzentration der Probe. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf insgesamt eine bis zwei Millionen Zellen pro Milliliter in einem Endvolumen von 0,5 Milliliter in vorgekühlter RINGA-Lösung.
Die Spermatozoen müssen beim Pipettieren und Wiederaufschlammen vorsichtig behandelt werden. Geben Sie 3,125 µL der Dichlorofluorescein-diacetat-Stammlösung zur Arbeitsprobenlösung hinzu. Die Endkonzentration in der Probe beträgt 25 µmol.
Inkubieren Sie bei vier bis sieben Grad Celsius für 40 Minuten. Nach 30 Minuten geben Sie 0,5 Mikroliter der DAPI-Standardlösung und 0,5 Mikroliter der mitochondriellen Farbstoff-Standardlösung zur Probe hinzu. Beide Fluorochrome haben eine Inkubationszeit von 10 Minuten.
Platzieren Sie einen fünf Mikroliter großen Tropfen der konzentrierten Zellsuspension auf einem Objektträger. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Probe und versiegeln Sie sie. Schalten Sie das Gerät ein und wählen Sie im Bedienfeld das 100-fache Vergrößerungsobjektiv aus.
Positionieren Sie die Probe am Mikroskop, und schalten Sie die Lampe ein. Über die Systemsoftware können die benötigten Fluorochrome direkt aus einer Liste ausgewählt werden. Wählen Sie den Satz aus.
DAPI mit einer Emissionsmaximum bei 465 Nanometern, MitoTracker Deep Red mit einem Emissionsmaximum bei 662 Nanometern und DCF mit einem Emissionsmaximum bei 525 Nanometern. Leiten Sie den Strahl zu den Okularen um. Fokussieren Sie ein Bereich von Interesse.
Zurück zur Software, wählen Sie die Bildgröße aus. Stellen Sie den bidirektionalen Abtastmodus für eine bessere Auflösung ein. Wählen Sie die gewünschte Scan-Geschwindigkeit.
Öffnen und zentrieren Sie den Scan-Bereich, um zu beginnen. Machen Sie eine Aufnahme des Feldes. Wählen Sie mit dem Zuschneidewerkzeug den Bereich von Interesse aus, und drücken Sie auf Live.
Dann haben Sie Ihren Arbeitsbereich ausgewählt. Passen Sie mit Hilfe des Bereichsanzeigewerkzeugs den digitalen Offset an, um den Hintergrund zu reduzieren. Tun Sie dies für jeden Kanal und machen Sie Ihre Aufnahme.
Dies ist ein Beispiel der Ergebnisse. Für ein Überlagerungsbild einzelne Kanäle für jeden Fluorochrom und deren Kombinationen. Dies ist ein Beschriftungsschema einer Spermazelle von Solea senegalensis.
Nachdem Sie die aufgenommenen Bilder gesehen haben, können Sie beobachten, dass DAPI und MitoTracker wie erwartet im Kern bzw. im mitochondrialen Ring lokalisiert sind. Der erste Schritt besteht darin, ein Z-Stapel-Experiment durchzuführen. Gehen Sie zum Z-Stapel-Fenster und wählen Sie mithilfe des Feinfokus die erste und die letzte Position der Aufnahme aus.
Wählen Sie die optimalen Erfassungsparameter aus, und führen Sie das Experiment durch. Sie erhalten Bilder für jeden Objektträger. Dies ist ein Beispiel für ein Z-Stack-Ergebnis.
Sie können die Kanäle aufteilen und die Lokalisation jedes Signals innerhalb der Zellen beobachten. Im 3D-Fenster können Sie verschiedene Diagrammoptionen auswählen. Viele Parameter lassen sich anpassen, und die Kanäle können aufgeteilt und zusammengeführt werden.
Dies ist ein Beispiel für 3D-Ansichten, die unterschiedliche Muster der Lokalisation reaktiver Sauerstoffspezies innerhalb von Spermien von Solea senegalensis zeigen. Im oberen Bildbereich ist DCF hauptsächlich mit den Mitochondrien koinzident, während im unteren Bildbereich das Signal bis zum Zellkern reicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, wissen Sie, wie man die intrazelluläre Lokalisation von Peroxiden in diesen Spermatozoen mittels konfokaler Mikroskopie bewertet.
Sie finden Fehlerbehebungstipps und weitere Informationen im Text.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Detektion der Lokalisation von H2O2 in Spermatozoen von Solea senegalensis unter Verwendung von DCFH-DA für reaktive Sauerstoffspezies, einem Farbstoff für lebende Mitochondrien und DAPI zur Visualisierung der Kerne. Das Verfahren kann innerhalb von 2 Stunden mit frischen oder aufgetauten Spermatozoen durchgeführt werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Reproduktionsbiologie
Hintergrund
- Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine entscheidende Rolle bei der Spermienfunktion.
- Oxidativer Stress kann die Spermienmotilität und die Befruchtungsfähigkeit negativ beeinflussen.
- Wasserstoffperoxid, das aus Mitochondrien freigesetzt wird, kann in den Zellkern eindringen und die DNA schädigen.
- Das Verständnis der Lokalisation von ROS ist entscheidend, um die Gesundheit von Spermien zu beurteilen.
Zweck der Studie
- Die intrazelluläre Lokalisation von ROS in Spermatozoen von Solea senegalensis untersuchen.
- Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die Spermienviabilität bewerten.
- Die konfokale Mikroskopie zur detaillierten Visualisierung zellulärer Komponenten nutzen.
Verwendete Methoden
- Verwendung des DCFH-DA-Fluorochroms zum Nachweis von ROS.
- Färbung lebender Mitochondrien zur Visualisierung der mitochondrialen Aktivität.
- DAPI-Färbung zur Visualisierung der Kerne.
- Konfokale Mikroskopie zur Bildgebung und Analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Lokalisierung von H2O2 in Spermatozoen.
- Nachweis der Auswirkungen von oxidativem Stress auf die Spermienmotilität.
- Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien, Zellkern und reaktiven Sauerstoffarten (ROS).
- Beleg der Effizienz des Protokolls innerhalb eines Zeitraums von zwei Stunden.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll zeigt effektiv die Lokalisation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Spermatozoen auf.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis von oxidativem Stress in der Reproduktionsbiologie bei.
- Die Methodik kann auf weitere Studien zur Spermienfunktion und -gesundheit angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Lokalisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Spermatozoen adressiert eine zentrale Herausforderung in der Fortpflanzungsbiologie und der Forschung und Entwicklung im Bereich Aquakultur, bei der oxidativer Stress die Zellviabilität und genetische Integrität direkt beeinträchtigt. Dieser auf konfokaler Mikroskopie basierende Arbeitsablauf ermöglicht eine präzise Kartierung von H2O2 in Bezug auf mitochondriale und nukleäre Kompartimente und unterstützt damit die mechanistische Risikominimierung sowie die vorhersagende Bewertung von Kryokonservierungsprotokollen. Der Ansatz ist relevant für Entscheidungen in translationalen Entwicklungsprozessen, bei denen Spermienqualität und funktionelle Integrität für Genbanken und Zuchtprogramme entscheidend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Untersuchung von Oxidativstresswegen in der Gametenbiologie.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Klärung der Auswirkungen von reaktiven Sauerstoffspezies auf nukleäre und mitochondriale Zielstrukturen.
- Erleichtert die Vorhersagegenauigkeit bei der Spermienqualitätsbeurteilung für Zucht- und Genbankzwecke.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Bildgebungsassays zur Lokalisierung von ROS in kryokonservierten und frischen Proben.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für den Vergleich zwischen Proben.
- Bereitet standardisierte biologische Systeme für funktionelle Screening-Verfahren in nachgeschalteten Analysen vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Parameter des oxidativen Stresses mit translationsrelevanten Biomarkern der Spermienviabilität.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von mechanistischen Studien im Entdeckungsstadium zur präklinischen Bewertung von Konservierungsprotokollen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kryokonservierungs- und Fruchtbarkeitsbehandlungsverfahren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses konfokale Bildgebungsprotokoll integriert sich in den Entdeckungs- bis präklinischen Prozess für die Forschung und Entwicklung im Bereich Fortpflanzung und Aquakultur und dient sowohl frühen mechanistischen Studien als auch der translationsmedizinischen Validierung von Konservierungsstrategien.
- Entdeckungsbiochemie: Liefert direkte Belege für ROS-induzierte zelluläre Schäden und die Kartierung von Signalwegen.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare Bildgebungsdaten zur Standardisierung von Assays.
- Analytik: Ermöglicht statistische Vergleiche der ROS-Lokalisation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Endpunkten zur Spermienqualität und -lebensfähigkeit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist an verwandte Arten und weiterführende Anwendungen in der Reproduktionsbiologie anpassbar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Spermienqualität und das mechanistische Verständnis von oxidativem Stress.
- Operationaler Wert: Standardisiert ROS-Lokalisierungsanalysen hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über die Durchführung oder Unterlassung von Kryokonservierungs- und Zuchtprogramminvestitionen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Konservierungs- und Fruchtbarkeitstechnologien.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der konfokalen Mikroskopie und im Umgang mit fluoreszierenden Sonden.
- Benötigt Zugang zu hochentwickelten Bildgebungssystemen und analytischer Software.
- Setzt eine standardisierte Probenvorbereitung und Bildparameterüberwachung über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Anpassbar auf verschiedene Teleostier- und wirtschaftlich relevante Arten bei Optimierung des Protokolls.
- Hängt von einer zuverlässigen Fehlersuche und Qualitätskontrolle für reproduzierbare Ergebnisse ab.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:32
Preparatory work before the experiment
2:58
Sample preparation before fluorochromes incubation
4:40
Fluorochromes incubation
5:33
Sample preparation for confocal microscopy
5:51
Confocal setting up prior to the experiment
6:49
Acquisition of images
7:49
Results
8:24
Creating a 3D image video
9:53
Conclusions
