Name: Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Samengewinnung bei Vögeln durch Kloakenmassage und die anschließende DNA-Isolation aus Spermien. Diese schonende Methode ermöglicht genetische und epigenetische Studien an wilden und gefangenen Vögeln.

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Wir danken Jose Noguera für frühe Hilfen mit Blasenekstrophie Massage und Jeffrey Kittilson für Labor zu unterstützen. Diese Arbeit wurde durch einen ND EPSCoR FAR0022429 Award, BJH unterstützt. Publikationskosten waren der NDSU Abteilung der biologischen Wissenschaften großzügig unterstützt.

Dieses Protokoll beinhaltet vertebrate Tiere Themen und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der North Dakota State University genehmigt wurde.
1. die Samengewinnung aus dem passerine Vogel mit Blasenekstrophie massage
Hinweis: Blasenekstrophie Massage ist eine wirksame Sperma Sammlung Technik auf nur reproduktiv aktive Vögel, aber außerhalb der Brutzeit im entsprechenden gefangen Situationen erfolgreich durchgeführt werden kann. Vermehrungstätigkeit sollte für Zielarten vor mit Blasenekstrophie Massage bestimmt werden. Diese Technik kann verwendet werden, auf Wildvögel bei der Erfassung oder Vögel in Gefangenschaft gehalten.
<ol><li>Beginnend mit einem Männchen (bei der Zucht Zustand) Bander es halt in der nichtdominanten Hand übertragen den Vogel auf die dominante Hand mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche (Abbildung 1).<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Vogels am nächsten der seitliche Rand der Palme ist. Kopf und Körper mit dem kleinen Finger, Ring und Mittelfinger leicht zu sichern. Dies lässt des Vogels Vent und Tail ausgesetzt.</li>
		<li>Lassen Sie den Vogel Beine lose oder leicht zurückhaltend mit der Handfläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Abbildung 1 : Griff für Blasenekstrophie Massage. Der Vogel ist mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche und Kopf gesichert durch den kleinen Finger leicht in die dominante Hand gesichert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>Legen Sie die dominanten Zeigefinger und Daumen auf beiden Seiten des überlegenen Ende der Kloake und auseinanderziehen Sie leicht der Finger während der Anwendung sehr leichten Druck in Richtung Heck ( Abbildung 2). Die Kloake wird evert, Freilegung der Blasenekstrophie Schleimhaut (rosa innen). Hinweis: Wenn der Vogel nicht produziert derzeit Sperma, Blasenekstrophie Protuberanz kann klein sein und die Kloake ist schwierig, evert. Mit Erfahrung ist es leicht zu unterscheiden zwischen den Cloacas reproduktiv aktive und inaktive Männchen5,11.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Abbildung 2 : Finger Position und Blasenekstrophie Protuberanz. Evert der Kloake durch leichten Druck auf die überlegene Ende (A). In einem reproduktiv aktiven männlichen Botaniker Blasenekstrophie Protuberanz ist offensichtlich und Firma (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="3"><li>Legen Sie mit der nichtdominanten Hand das Pad des Zeigefingers an der dorsalen Seite der Schwanzwurzel, die Hand zu stabilisieren, und platzieren Sie die Spitze des Daumens direkt unter der ausladenden Kloake. Hinweis: Kurze und glatte Miniaturansicht ist vorteilhaft für die Durchführung von Blasenekstrophie Massage und den Vogel vor Verletzungen schützt.</li>
	<li>Den nicht-dominanten Daumen tief und cranially in eine sich ständig wiederholende Bewegungen mit mittlerem Druck, bleiben unterhalb der Kloake zu bewegen. Fortgesetzt, bis der Vogel ejakuliert. Abhängig von der Einzelperson geschieht dies in der Regel zwischen 1 und mehreren Dutzend Schläge.</li>
	<li>Sobald der Vogel ejakuliert, sammeln Sie das Sperma in einem Microhematocrit Rohr. Wiederholen Sie bei Massage um mehrere ejakuliert zu erhalten. Hinweis: Sperlingsvögel Samen ist hellbraun und hat in der Regel eine etwas dicke Konsistenz. Weiße oder dunkle Stoffe aus der Kloake ausgeworfen nicht Sperma, und können die Samenprobe kontaminieren. Das Aussehen einer kleinen Menge von Blut auf der Kloake oder gemischt in mit das Sperma wird in der Regel verursacht durch zuviel Druck während der Massage.</li>
	<li>Legen Sie für DNA-Extraktion das Sperma in einem Microcentrifuge Schlauch mit 20 µL 1 X PBS (pH 7,4). Hinweis: Samen mit 1 X PBS-Puffer gespeichert ist nicht geeignet für künstliche Befruchtung, aber kann für DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden wenn bei-80 ° c gelagert Die PBS ist Raumtemperatur oder gekühlt, aber sollte in einem flüssigen Zustand sein, wenn die Samenprobe hinterlegt ist.<ol>
<li>Bestätigen Sie das Vorhandensein von Samenzellen in der Probe, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Probe unter dem Mikroskop Compound (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bis zur Extraktion lagern Sie der Samenlösung bei-80 ° C.</li>
</ol>(2) Extraktion von DNA aus Vogel-Samen
Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit mehreren kommerziellen DNA Extraktion Kits getestet, aber es wurde nur erfolgreich, wenn Sie mit einem DNA-Kit12verwendet. Schritte, die geändert werden aus dem Kit-Protokoll sind gekennzeichnet durch *.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 M Lösung von Dithiothreitol (DTT) in Wasser und mischen mit einem vortex.*<ol>
<li>Aliquoten die DVB-t-Lösung und bei-20 ° C bis unmittelbar vor der Anwendung zu speichern. Jede Probe extrahiert werden erfordert 10 µL 1 M DVB-t-solution.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie einen Puffer mit 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; und 4 % SDS. Jede Probe extrahiert werden erfordert 90 µL von diesem buffer.*<ol>
<li>Lagern Sie den Puffer bei Raumtemperatur. Wenn es ausgefällt hat, warm es auf 56 ° C zu dissolve.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Heizen Sie einen Inkubator mit einer Wippe oder Shaker auf 65 ° C.*</li>
	<li>Unmittelbar vor Beginn der Extraktion, mix 10 µL DVB-t-Lösung mit 90 µL des Puffers in Schritt 2.2 für jede Probe extrahiert werden, z. B. 900 µL Puffer plus 100 µL DVB-t-Lösung bereit, wenn 10 Proben zu extrahieren. Diese Mischung wird DVB-t-buffer.* aufgerufen werden</li>
	<li>Die gesamte verdünnte Samenprobe 70 µL 1 X PBS hinzu und mischen Sie gut mit einer vortex.*</li>
	<li>Hinzufügen von 100 µL DTT-Puffer und 10 µL Proteinase K-Lösung zur Probe. Wirbel für 20 Sekunden, dann brüten in den vorgewärmten Brutkasten für 1 Stunde auf einer Wippe oder shaker.*</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Puffer AL und 200 µL frische EtOH (100 %) und Vortex für 20 seconds.*</li>
	<li>Übertragen Sie das gesamte Sample auf einer Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und fügen Sie 500 µL vorbereitet Buffer AW1 hinzu. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und 500 µL vorbereitet Puffer AW2. Zentrifuge für 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen durchströmte und die Spalte mit der u-Bahn zurück.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 20.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule an einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Pipettieren 35 µL AE-Puffer direkt auf die Spalte Membran und in 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 14.000 x g. verwerfen die Spin-Spalte und speichern Sie entnommene Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
<li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347296904236">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li>
<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wir beschreiben eine einfache und zuverlässige Methode für das Sammeln von Samen von kleinen und mittleren Vögel in reproduktiv aktiven Zustand und Extrahieren von DNA aus Vogelgrippe Sperma.
Die beschriebenen Samen DNA Extraktion Protokoll ist aus einem Bausatz für Einfachheit geändert, aber wurde für den Einsatz auf Vogelgrippe Sperma veredelt. Spermien sind resistent gegen lyse von standard-Extraktion Chemikalien9,13, und Spermaprob...

Vögel sind ideale Motive für Studien mit Spermien-Qualität und Wettbewerb1, Sperma Telomere Dynamik2Epigenetik3und ähnliche Themen, wie sie weit in der biologischen Forschung verbreitet sind und Spermien leicht entnommen werden können, mit Blasenekstrophie Massage. Blasenekstrophie Massage ist eine sanfte, nichtinvasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel4,5,6. Wiederholte Proben können leicht erhalten werden und sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich, so dass es einfach in das Feld oder Labor durchzuführen. Obwohl Blasenekstrophie Massage seit Jahrzehnten im Einsatz gewesen ist, ist es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen geschrieben zu lernen. Diese Veröffentlichung dient zur Verringerung der Zeit und Unsicherheit Blasenekstrophie Massage lernen.
Samen gesammelt von Vögel mit Blasenekstrophie Massage kann sofort für Motilität Bewertung4,7 oder künstliche Befruchtung8verwendet, oder für andere Nutzungen wie erweiterte Bildgebung und DNA-Extraktion eingefroren. Spermaproben von passerine Vögel sind klein, aber dicht gepackte Spermien enthalten. DNA wird mit einer kommerziellen Extraktion Kit für Einfachheit, mit Modifikationen, die speziellen Schutzfunktionen von Spermien9zu überwinden. Nach der Extraktion können Sperma Telomere mit qPCR10gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Jeder Lieferant kann verwendet werden. Kleinere Röhrchen können effektiver sein, um kleine Samenproben zu entnehmen, z. B. von sehr kleinen Sperlingsvögeln wie Spatzen.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Wird zur Lagerung von Samenproben vor der DNA-Extraktion verwendet.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Jeder Lieferant kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Jeder Lieferant kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Jeder Lieferant kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Jeder Lieferant kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA-Mikrokit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA-Mikrokit wird speziell empfohlen. Dieses DNA-Extraktionsprotokoll wurde mit anderen kommerziellen Kits versucht, jedoch mit wenig Erfolg. Die Gründe dafür sind uns nicht bekannt.</td></tr></tbody></table>

vogelgrippe samengewinnung von blasenekstrophie massage und isolierung von dna aus spermien

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Sammlung des Samens möglicherweise nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Studien, die Qualität der Spermien, Sperma Telomere Dynamik und Epigenetik. Vögel sind weit verbreitete Themen in der biologischen Forschung und sind ideal für Studien mit wiederholter Spermaproben. Einige Ressourcen sind jedoch derzeit für diejenigen, die lernen, wie man sammeln und Vogelgrippe Samenzellen DNA extrahieren. Hier beschreiben wir Blasenekstrophie Massage, eine sanfte, nicht-invasive manuelle Technik zur Vogelgrippe Sperma zu sammeln. Obwohl diese Technik in der Literatur hergestellt ist, kann es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen zu lernen sein. Wir bieten auch Informationen zur Extraktion von DNA aus Vogelgrippe Samen mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen. Blasenekstrophie Massage kann leicht auf jede kleine bis mittlere männliche Vogel in reproduktive Zustand verwendet werden. Nach Sammlung kann das Sperma sofort für Motilität Assays verwendet oder eingefroren für DNA-Extraktion nach dem hier beschriebenen Protokoll. Diese Extraktion-Protokoll wurde für Vogelgrippe Sperma verfeinert und auf Proben von mehreren Sperlingsvögel (Passer Domesticus, Spizella Passerina Haemorhous Mexicanusund Turdus Migratorius erfolgreich eingesetzt ) und eine Columbid (Columba Livia).

Blasenekstrophie Massage und DNA-Extraktion verwenden, die das beschriebene Protokoll für mehrere Sperlingsvögel Arten und eine Columbid (Tabelle 1) ausgeführt wurde. Das Vorhandensein von Samenzellen im Spermaproben von Blasenekstrophie Massage wurde bestätigt, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Proben unter dem Mikroskop Verbindung bei 400 X Vergrößerung (Abbildung 3). Nach Extraktion von DNA aus Spermaproben von Haussperli...

Dieses Protokoll beschreibt Blasenekstrophie Massage, eine nicht-invasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel und DNA-Extraktion aus Vogelgrippe Spermien mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen.

Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Samenflüssigkeit von männlichen Vögeln zu sammeln und DNA aus den Spermaproben zu isolieren. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen der Verhaltens- und Evolutionsökologie im Zusammenhang mit Spermienkonkurrenz und epigenetischer Vererbung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach anzuwenden ist. Die Kloakenmassage kann schnell im Feld oder Labor durchgeführt werden, und die DNA-Extraktionsmethode verwendet ein im Handel erhältliches Kit mit Modifikationen. Diese Technik kann während der Fortpflanzungszeit bei wildlebenden oder in Gefangenschaft gehaltenen Vögeln angewendet werden, und in bestimmten Fällen der Gefangenschaftshaltung kann sie ganzjährig wirksam sein. Halten Sie den reproduktiv aktiven männlichen Vogel mit einem Bandgriff in der nicht-dominanten Hand fest.Übertragen Sie es dann in die dominante Hand, wobei die Ventralseite die Handinnenfläche berührt und der Kopf am seitlichen Rand der Handfläche liegt. Befestigen Sie nun Kopf und Körper leicht mit dem kleinen, dem Ring- und dem Mittelfinger. Nun sind die Ventralöffnung und der Schwanz des Vogels freigelegt.Die Beine können lose bleiben oder leicht mit der Handfläche fixiert werden. Danach wird die Kloake durch Platzieren des Zeigefingers und Daumens der dominanten Hand auf beiden Seiten ihres oberen Endes nach außen gedreht, wobei leicht zusammengedrückt und sanfter Druck in Richtung des Schwanzes ausgeübt wird. Die rosa gefärbte Kloakenschleimhaut sollte deutlich sichtbar werden, es sei denn, der Vogel produziert kein Sperma.Mit Erfahrung ist es einfach, zwischen den Kloaken von reproduktiv aktiven und inaktiven Männchen zu unterscheiden. Um Sperma zu gewinnen, legen Sie die Fingerkuppe des Zeigefingers der nicht-dominanten Hand zur Stabilisierung auf die dorsale Seite der Schwanzwurzel und setzen dann die Fingerspitze des Daumens direkt unterhalb der evagierten Kloake an. Eine kurze, glatte Fingernagelkante wird dringend empfohlen.Bewegen Sie nun den Daumen tief und kranial mit einer wiederholten Bewegung und mittlerem Druck, wobei Sie unterhalb der Kloake verbleiben, bis der Vogel ejakuliert. Dies kann von einer einzigen bis zu mehreren Dutzend Bewegungen dauern. Sobald der Vogel ejakuliert, sammeln Sie das viskose, hellbraune Ejakulat in einem Mikroh&auml;matokritrohr.Weißer oder dunkler Ausfluss weist auf Verunreinigungen hin, während jegliche Blutbeimischung anzeigt, dass zu starker Druck angewendet wurde. Wiederholen Sie die Massage nach Bedarf, um mehrere Ejakulate zu gewinnen. Überführen Sie die Probe für die DNA-Extraktion mit 20 Mikrolitern PBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Um das Vorhandensein von Spermien in der Probe zu bestätigen, betrachten Sie eine kleine Menge der verdünnten Probe unter einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400facher Vergr&ouml;&szlig;erung. Bewahren Sie die Spermienproben anschließend bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius auf. Dieses Protokoll ist eine Modifikation eines kommerziellen Kits.Bereiten Sie 10&nbsp;µL-Aliquote von einem Mol DTT in Wasser vor, die bei minus 20&nbsp;°C gelagert werden. Mischen Sie kurz vor Beginn der DNA-Extraktion für jede Probe ein Aliquot DTT mit einem Aliquot Tris-Chlorid. Geben Sie anschließend 70&nbsp;µL PBS zu jeder Probe hinzu und wirbeln Sie die Ansätze kurz im Vortex. Fügen Sie dann je eine DTT-Puffermischung und 10 µL Proteinase-K-Lösung zu jeder Probe hinzu. Um die Proben zu vermischen, führen Sie eine Vortexisierung für 20 Sekunden durch. Geben Sie die Proben anschließend auf einen Schüttler in einen 65 °C warmen Inkubator und inkubieren Sie sie eine Stunde lang mit sanfter Bewegung.Nach der Inkubation 200 µL Puffer AL und 200 µL frisches 100 % Ethanol hinzufügen und die Proben 20 Sekunden lang verwirbeln. Anschließend jede Probe auf eine Säulchen spin column übertragen und eine Minute bei 6.000 × g zentrifugieren. Den Sammelbehälter entsorgen und die Säulchen auf neue Röhrchen setzen.Fügen Sie 500 µL Puffer AW1 zur Säule hinzu und zentrifugieren Sie die Säulen erneut. Entsorgen Sie erneut die Sammelröhrchen und setzen Sie die Säulen auf neue Röhrchen. Geben Sie nun 500 µL Puffer AW2 hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugierungsschritt.Entfernen Sie anschließend den Durchlauf und setzen Sie die Säule erneut in die Zentrifuge ein, um sie drei Minuten lang bei 20.000G zu zentrifugieren. Danach entsorgen Sie das Sammelgefäß und stellen die Säule auf ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie nun direkt auf die Membran der Säule 35 Mikroliter Puffer AE und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur die DNA eluieren.Danach den Elutionspuffer mit der DNA mithilfe eines 60-Sekunden-Spins in das Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Entsorgen Sie nun die Säulen und lagern Sie die DNA bei minus 80 Grad Celsius. Die beschriebenen Methoden zur Kloakenmassage und DNA-Extraktion wurden erfolgreich bei mehreren Arten von Singvögeln sowie bei einer Taubenart angewendet.Wenn bei einer Gelelektrophorese der extrahierten DNA deutliche Banden ohne Verschmierung sichtbar sind, deutet dies auf eine erfolgreiche Isolierung von hochwertiger DNA hin. Dieses Beispiel zeigt DNA aus Haussperlingsperma. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Spermienproben schonend von reproduktionsfähigen männlichen Vögeln mittels Kloakenmassage gewinnt und wie man DNA aus diesen Spermienproben mithilfe eines Extraktionskits isoliert.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Kloakenmassage bei korrekter Durchführung innerhalb von Sekunden durchgeführt werden.

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

Ein Protokoll für die Isolierung und Aktivierung von Spermatiden von...

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In-vivo-Markierung stabiler Isotope zur massenspektrometrischen Identifizierung von väterlichen Metaboliten, die während der Befruchtung von Spermien auf die Eizelle übertragen werden

Dieses Protokoll bietet eine einfache Mikroaspirationstechnik, um lebensfähige somatische Zellen (SCs) aus kryokonserviertem Pferdesamen zu isolieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen vermeidet diese Technik lange In-vitro-Kulturen und verhindert die Spermienkontamination, was den sofortigen Einsatz beim somatischen Zellklonen ermöglicht.

Eine einfache Mikroaspirationstechnik zur Isolierung somatischer Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen als Kernspender für das Klonieren

Erfahren Sie die Samengewinnung bei Vögeln durch Kloakenmassage und die anschließende DNA-Isolation aus Spermien. Diese schonende Methode ermöglicht genetische und epigenetische Studien an wilden und gefangenen Vögeln.

Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien

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