Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel des HS-MRM-Assays ist es, das MRM-Interferenzphänomen zu reduzieren, das die Peptid- oder Proteinquantifizierung beeinflusst, indem die Ionenmobilitätstrennung von Peptidvorläufern mit der hochauflösenden massenspektrometrischen Detektion von Fragmentionen kombiniert wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der biotherapeutischen Charakterisierung sowie der Quantifizierung von Protein- oder Peptid-Biomarkern und der quantitativen Proteomik zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Nachweis von Wirtszellproteinen in geringer Menge ermöglicht, die in biopharmazeutischen Proteinen vorhanden sein könnten.

Klicken Sie zunächst in der Datenerfassungssoftware auf Analysemethode erstellen und wählen Sie Methode generieren und erfassen und verarbeiten. Geben Sie den Methodennamen und die Beschreibung ein, navigieren Sie zum Methodenordner und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie als Analysetyp die Option Peptidkarte IMS aus und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie dann die aktuelle Systemkonfiguration aus und klicken Sie auf Weiter und fertig. Klicken Sie in der neu erstellten Methode auf die Registerkarte Instrumente, wählen Sie den binären Lösungsmittelmanager aus und bearbeiten Sie die Gradienteneinstellungen, um eine Peptidtrennung mit einer Flussrate von 0,2 Millilitern pro Minute zu erreichen. Verwenden Sie eine Gradientenverdünnung von einem auf 40 % Lösungsmittel B in 30 Minuten, gefolgt von einer zweiminütigen Säulenwäsche und einer 10-minütigen Äquilibrierung mit einer Gesamtlaufzeit von 45 Minuten.

Wählen Sie als Nächstes den Probenmanager aus und stellen Sie die Probentemperatur auf 10 Grad Celsius und die Säulentemperatur auf 60 Grad Celsius ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Instrumente das Instrument Vion IMS QTof aus. Wählen Sie im Einstellungsbereich die Empfindlichkeit für den Analysatormodus und geben Sie drei Kilovolt für die Kapillarspannung, 100 Grad Celsius für die Quellentemperatur, 250 Grad Celsius für die Desolvationstemperatur, 50 Liter pro Stunde für den Kegelgasfluss und 500 Liter pro Stunde für den Desolvatationsgasfluss ein.

Klicken Sie auf die Registerkarte Experiment und wählen Sie High Definition als Modus aus. Geben Sie dann 100 für geringe Masse, 2000 für hohe Masse und 0,4 Sekunden für die Scanzeit ein. Geben Sie im Abschnitt Kollisionsenergie sechs Elektronenvolt für die niedrige Energieeinstellung ein und wählen Sie eine Hochenergierampe von 15 bis 40 Elektronenvolt.

Verwenden Sie für die Erfassungszeit eine benutzerdefinierte Laufzeit zwischen fünf und 30 Minuten. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Optionen und wählen Sie den automatischen Sperrkorrekturmodus mit einem automatischen Sperrkorrekturintervall von fünf Minuten. Wählen Sie dann die Option Mit Sperrkorrektur fortfahren und stellen Sie sicher, dass die automatische Detektorprüfung deaktiviert ist.

Wählen Sie im aktuellen Systemkonfigurationsmenü das Instrument Vion IMS QTof aus und klicken Sie auf Tools. Geben Sie drei Kilovolt für die Kapillarspannung, 40 Volt für die Probenahme des Konus, 100 Volt für den Quellenversatz, 100 Grad Celsius für die Quellentemperatur, 250 Grad Celsius für die Desolvatationstemperatur, 50 Liter pro Stunde für den Kegelgasfluss, 500 Liter pro Stunde für den Desolvenzgasfluss und drei Kilovolt für die Referenzkapillarspannung ein. Analysieren Sie eine zuvor vorbereitete 10-Nanomola-Fake-Sdot-Probe mit dem gerade beschriebenen LC-HDMSE-Assay, indem Sie 10 Mikroliter Probe in das Gerät injizieren.

Die einzelnen Sequenzen von sechs Phosphorylase-B-Peptidstandards, die in der Faux-Peptidmischung enthalten sind, sind hier zusammen mit ihren Retentionszeiten und ihren am häufigsten vorkommenden Vorläufern dargestellt, die im HDMSE-Experiment beobachtet wurden. Die HDMSE-Spektren, die für eines der gefälschten Peptide aufgenommen wurden, die im Infliximab-Verdau gespickt sind, sind hier dargestellt. Klicken Sie in der Datenerfassungssoftware auf Analysemethode erstellen und wählen Sie Methode generieren und erfassen und verarbeiten.

Geben Sie den Methodennamen und die Beschreibung ein, navigieren Sie zum Methodenordner und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie als Analysetyp die Option Quantifizieren, wählen Sie Quantify Assay Tof 2D Chromatographic und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie dann die aktuelle Systemkonfiguration aus und klicken Sie auf Weiter und fertig.

Klicken Sie in der neu erstellten Methode auf die Registerkarte Instrumente. Wählen Sie den binären Lösungsmittelmanager aus und bearbeiten Sie die Gradienteneinstellungen, um eine Peptidtrennung mit einer Flussrate von 0,2 Millilitern pro Minute zu erreichen. Verwenden Sie eine Gradientenverdünnung von einem auf 40 % Lösungsmittel B in 30 Minuten, gefolgt von einer zweiminütigen Säulenwäsche und einer 10-minütigen Äquilibrierung mit einer Gesamtlaufzeit von 45 Minuten.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Instrumente" den Probenmanager aus und stellen Sie die Probentemperatur auf 10 Grad Celsius und die Säulentemperatur auf 60 Grad Celsius ein. Wählen Sie nun das Vion IMS QTof-Gerät aus und wählen Sie im Einstellungsbereich die Empfindlichkeit für den Analysatormodus. Geben Sie dann drei Kilovolt für die Kapillarspannung, 100 Grad Celsius für die Quellentemperatur, 250 Grad Celsius für die Desolvatationstemperatur, 50 Liter pro Stunde für den Kegelgasfluss und 500 Liter pro Stunde für den Desolvatationsgasfluss ein.

Klicken Sie auf die Registerkarte Experiment, und wählen Sie als Experimenttyp die Funktionstabelle eine oder mehrere MS-, MSMS- oder MRM-Funktionen aus. Löschen Sie die Standard-Erfassungsfunktion, klicken Sie auf Hinzufügen plus MRM und bearbeiten Sie die Parameter des Aufbewahrungsfensters im Laufzeitbereich. Geben Sie im Funktionseditor Tof MRM das Master-Ladungsverhältnis des Peptidvorläufers ein, wählen Sie niedrig für die Vorläuferauflösung aus und geben Sie den Ladungszustand des Vorläufers ein.

Geben Sie dann das Hauptladungsverhältnis des Produkts ein: 16 Elektronenvolt für die Startkollisionsenergie, 0,1 Sekunden für die feste Abtastzeit und breit für die Spektrumsäule. Fügen Sie mit der Schaltfläche "Duplizieren" 10 weitere MRM-Übergänge hinzu und verwenden Sie unterschiedliche Kollisionsenergiewerte im Bereich von 18 bis 36 Elektronenvolt. Nachdem die drei besten Übergänge für jedes Peptid ermittelt worden waren, wurde ein Tof-MRM-Experiment durchgeführt, um die optimale Kollisionsenergie zu finden, um die für jedes Peptid erzeugten Signale zu maximieren.

Richten Sie als Nächstes eine HS-MRM-Methode ein, die nur ein Fragmention pro Peptid enthält. Ändern Sie die zuvor erstellte Tof-MRM-Methode, indem Sie die HS-MRM-Funktion anstelle der Tof-MRM-Funktion auswählen. Geben Sie im HS-MRM-Funktionseditor das Master-Charge-Verhältnis ein, wählen Sie Niedrig für die Vorläuferauflösung und geben Sie den Vorläufer-Charge-Status ein.

Geben Sie dann den CCS-Wert des Vorgängers ein und wählen Sie niedrig für die CCS-Auflösung des Vorläufers. Geben Sie für das Produktion das Hauptladungsverhältnis ein, wählen Sie die optimale Kollisionsenergie, wählen Sie eine Scanzeit von 0,4 Sekunden und wählen Sie eine Breitspektrumseinstellung, um alle seine Isotope einzubeziehen. Der abschließende HS-MRM-Assay behält nur den besten Übergang für jedes Peptid bei und wird für die Analyse aller dotierten Proben verwendet.

Klicken Sie in der Analysemethode, die für die HS-MRM-Datenerfassungsmethode erstellt wurde, auf die Registerkarte Zweck und wählen Sie Komponenten verwalten. Wählen Sie im Dropdownmenü unter Experimenttyp die Option HS MSMS/HS MRM aus. Klicken Sie auf Erstellen und geben Sie den Namen der Komponente, die erwartete Aufbewahrungszeit, das Extraktionszeitfenster und das Vorläufer-Master-Charge-Verhältnis ein.

Wählen Sie den XIC-Extraktionsmodus aus und geben Sie den erwarteten CCS-Wert ein. Geben Sie für das Fragmention den Ladungszustand und das Master-Ladungsverhältnis ein. Geben Sie dann alle Peptidkomponenten ein, die vom HS-MRM-Assay überwacht werden.

Klicken Sie auf der Registerkarte "Zweck" derselben HS-MRM-Erfassungsmethode auf die Standardmengen und geben Sie 0,1, eins, 10 und 100 Nanomolar für alle gefälschten Peptidkomponenten ein. Nachdem Sie den ersten Wert eingegeben haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie die Option Auffüllen, um die gleiche Konzentration für alle Komponenten einzugeben. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für alle vier Konzentrationen der Kalibrierkurve.

Wechseln Sie nun zur Registerkarte Verarbeitung und klicken Sie auf Extraktionseinstellungen. Eingabe von 10 PPM für Massentoleranz. Klicken Sie dann auf CCS-Driftzeittoleranz und geben Sie 5% für CCS-Toleranz ein.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Verarbeitung" die Einstellungen für die Spitzenverarbeitung aus. Wählen Sie im Abschnitt "Glätten" den Mittelwert als Glättungsalgorithmus, eins als halbe Breite und eins als Iterationen aus. Stellen Sie im Abschnitt "Integrieren" sicher, dass die Optionen für die automatische Peakbreite und die automatische Erkennung aktiviert sind.

Wählen Sie als Nächstes die Einstellungen für den Zielbildschirm auf der Registerkarte "Verarbeitung" aus und wählen Sie im RT-Fenster die Option "Am nächsten zu RT". Geben Sie dann 0,2 Minuten für die Toleranz der Verweilzeit ein. Wählen Sie die Quantifizierungseinstellungen aus und wählen Sie im Menü "Kalibrieren" die Option "Linear" für den Typ "Kalibrierungskurvenanpassung", "Eins über x zum Quadrat" für den Gewichtstyp, "Konzentration" für den Komponentenwerttyp, "Millimol pro Liter" für die Komponentenwerteinheiten und "Keine" für die Berechnung der Kalibrierpunkte durch Mittelwertbildung.

Wählen Sie im Menü "Quantifizieren" den Bereich als Antwortwert aus. Beispiele für HS-MRM-Chromatogramme, die für die Faux-Peptide über alle Konzentrationen hinweg erstellt wurden, werden hier vorgestellt. Die Kalibrierungskurven, die für jedes Peptid nach der Integration von HS-MRM-Peaks erhalten wurden, sind hier dargestellt.

Die relative Standardabweichung der Peakfläche, die auf der Grundlage von vier Replikatinjektionen berechnet wurde, wird hier zusammengefasst. Da der MRM-Assay mit hoher Selektivität sowohl die Trennung von Ionenmobilitätsvorläufern als auch einen gezielten hochauflösenden massenspektrometrischen Nachweis umfasst, hat er ein großes Potenzial, ein schneller Hochdurchsatz-Überwachungsassay für mehrere Wirtszellproteine in Chargen von Biopharmazeutika zu werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen MRM-Assay mit hoher Selektivität auf einem Vion IMS QTof-Gerät einrichten.