Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses bildgebenden Systems ist es, mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie die Entwicklung pflanzlicher Organe über mehrere Tage hinweg mit subzellulärer Auflösung zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der pflanzlichen Morphogenese zu beantworten, wie z.B. wie Zellen mehrzelliger Organismen ihre Wachstums- und Proliferationsmuster während der Organogenese koordinieren? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach einzurichten ist und nicht auf die Spezialgeräte angewiesen ist, die häufig bei der Zeitrafferbildgebung verwendet werden, wie z. B. Profusion-Systeme.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir die Veröffentlichung von Littlejohn und Love in New Phytologist lasen, in der die Vorteile von Perfluordecalin für die Bildgebung im Blattgewebe beschrieben werden. Fertigen Sie zunächst mit einem Glasschneider drei Millimeter breite Glasstreifen aus einem ein Millimeter dicken Objektträger an. Befestigen Sie dann die Streifen mit Cyanacrylatkleber oder doppelseitigem Klebeband im Abstand von etwa 45 Millimetern über die Breite einer neuen Folie.

Stellen Sie eine zusätzliche Folie mit den gleichen Abmessungen her, die als Form dient. Stellen Sie nun eine Dichtung in gleicher Höhe aus gasdurchlässigem PDMS-Gummi her. Befeuchten Sie einen zweiten Objektträger mit etwas absolutem Ethanol und glätten Sie das PDMS auf dem Objektträger bis zur Höhe der Glasstreifen.

Befeuchten Sie anschließend eine Klinge mit absolutem Ethanol und schneiden Sie überschüssiges PDMS ab. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da mit Ethanol benetzte Werkzeuge nicht am PDMS haften bleiben. Reduzieren Sie dann das PDMS wieder auf die Höhe des Streifens.

Schneiden Sie dann einen Hohlraum in das PDMS, in dem sich der Sämling und die Agarplatte befinden. Um eine gleichbleibende Kavitätengröße zu erzeugen, verwenden wir einen maßgeschneiderten hausgemachten Cutter, der aus Perspecs gebaut wurde, aber stattdessen kann auch eine Rasierklinge verwendet werden. Schneiden Sie dann die Außenkante ab, um die Dichtung etwa zwei Millimeter dick zu machen.

Legen Sie nun auf eine Schiene ohne PDMS-Dichtung ein Deckglas auf beide Glasstreifen. Pipettieren Sie dann in den Raum unter dem Deckglas etwa einen Milliliter warmes verflüssigtes Agar, das so groß ist, dass es den Raum füllt. Der Agar kann experimentelle Verbindungen von Interesse enthalten.

Als nächstes gleichen Sie einen Teil der Schwimmweste an der Luft aus, indem Sie eine kleine Menge Schwimmweste in einem Rohr schütteln. Sobald der Agar ausgehärtet ist, laden Sie ca. 200 Mikroliter der Schwimmweste in die PDMS-Dichtung, füllen Sie sie jedoch nicht vollständig. Entfernen Sie das Deckglas von der Agarplatte und schneiden Sie es in eine Form, die in die Vertiefung der PDMS-Geldichtung passt.

Lassen Sie einen Abstand von zwei bis vier Millimetern zwischen dem Agar und der Dichtungswand. Füllen Sie dann die Kammer vollständig mit luftäquivalenter PFD. Um gravitropische Primärwurzeln abzubilden, wird eine Zellulosemembran als physikalische Barriere auf der Oberfläche der Agarplatte verwendet.

Die Agarplatte muss auch mit 0,8 % Agar statt mit 1,5 % Agar weicher sein. Schneide ein Stück der Membran ab, das ungefähr die gleichen Abmessungen wie der Agarblock hat. Dann mit 80% Ethanol sterilisieren und an der Luft trocknen lassen.

Nach dem Trocknen die Membran in flüssigem Wachstumsmedium einweichen und dann auf die Agaroberfläche übertragen. Setze zu Beginn vorsichtig bis zu drei Sämlinge auf den Agar. Ihre Positionierung ist entscheidend.

Die Keimblätter und das Hypokotyl müssen über den Agarrand hängen und in der PFD schwimmen. Zwischen den Sämlingen muss Platz sein, damit das Wachstum möglich ist. Sämlinge können gekräuselt werden, wenn sie zu groß sind, um in die Kammer zu passen.

Verschließen Sie dann die Kammer mit einem Deckglas mit einer Dicke, die dem gewählten Ziel entspricht. Drücken Sie vorsichtig an der Kante entlang, so dass der Kontakt mit den Glasstreifen hergestellt wird. Drücke das Deckglas mit einem anderen Objektträger vorsichtig nach unten, sodass es gleichmäßig auf den beiden Glasstreifen aufliegt.

Befestigen Sie dann das Deckglas mit mikroporigem chirurgischem Klebeband, das der Länge nach in zwei Hälften geschnitten ist. Lassen Sie die Probe nun etwa eine halbe Stunde ruhen, bevor Sie sie aufnehmen. Um die Arabidopsis thaliana-Sämlinge für die Kammern vorzubereiten, sterilisieren Sie die Samen zuerst mit 70%igem Ethanol.

Und dann pflanzen Sie sie auf ein ergänztes Medium. Stratifizieren Sie die gepflanzten Samen für zwei oder vier Tage bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann die gepflanzten Samen auf 22 Grad Celsius und lassen Sie sie vertikal ausgerichtet unter einem 16-stündigen täglichen Lichtzyklus wachsen.

Um die Seitenwurzeln abzubilden, züchten Sie die Pflanzen sieben bis 10 Tage lang und bringen Sie sie dann in Bildgebungskammern. Seitenwurzeln, die in bildgebenden Kammern physiologisch schnell wachsen, wurden alle halbe Stunde dokumentiert. Zum Vergleich wurden auch Seitenwurzeln auf Standard-Petriplatten im gleichen Medium gezüchtet.

Die Wachstumsrate der einzelnen Wurzeln variierte in beiden Setups stark, aber die Bandbreite war unter beiden Bedingungen ähnlich. Insgesamt nahm die Wachstumsrate mit der Länge zu. Die Wachstumsrate von Pflanzen in Bildgebungskammern oder auf Platten war in den ersten 27 Stunden des Wachstums nicht zu unterscheiden.

Beide Gruppen starteten mit der gleichen durchschnittlichen Seitenwurzellänge. Seitenwurzeln, die einen Plasmamembranmarker und einen Mikrotubuli-Marker koexprimieren, wurden im Abstand von einer Stunde in den Bildgebungskammern abgebildet. Die Wurzeln waren sehr stabil in ihrer Position, was eine mehrstündige konfokale Bildgebung ermöglichte.

Visuelle Indikatoren für die Proliferation wurden während des gesamten Experiments beobachtet. In den meristematischen Zellen konnten Präprophase-Banden, mitotische Spindeln und Phragmoplasten identifiziert werden. Über drei Tage hinweg unterschied sich das laterale Wurzelwachstum in den Bildgebungskammern in den ersten 48 Stunden nicht signifikant von denen der Petriplatten, aber nach 72 Stunden sank die mittlere Wachstumsrate.

Ein erheblicher Teil der Wurzeln in den Kammern wuchs jedoch immer noch über 72 Stunden mit vergleichbaren Raten wie Wurzeln auf Platten. Einmal gemeistert, können zwei Folien in 15 Minuten erstellt werden, wenn alles reibungslos verläuft. Es ist möglich, dieses bildgebende System zu verwenden, um die Wirkung pharmakologischer Behandlungen zu untersuchen, obwohl andere, komplexere Methoden wie Perfusionssysteme für Auswaschexperimente erforderlich sind.

Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik ein billiges und einfaches Mittel, um zelluläre Ereignisse zu verfolgen, die der pflanzlichen Morphogenese zugrunde liegen, insbesondere um die Rolle der Zellränder zu erforschen, der räumlichen Anforderungen, die die Organogenese in den Seitenwurzeln von Arabidopsis thaliana teilen.