Name: Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Kultur adulter Zebrafisch-Retina-Explantate für Live-Cell-Imaging mit Multiphotonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der interkinetischen Kernmigration während der Netzhautregeneration.

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Wir schätzen die Unterstützung durch William Archer und der Notre Dame Integrated Imaging Facility. Besonderer Dank für ihre kontinuierliche Unterstützung und ihre Pflege und Haltung der Zebrabärbling den Freimann Life Sciences Techniker gerichtet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute of NIH DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) und dem Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, University of Notre Dame, Notre Dame, IN unterstützt.

Hinweis: Zebrabärblinge wurden angehoben und in der Notre Dame Zebrabärbling Anlage im Freimann Life Sciences-Center erhalten. Die Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und sind in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Forschung Vision von der Association for Research in Vision and Ophthalmology genehmigt. 1. Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 70% Ethanol, um die Gewebekultur Haube zu sterilisieren und alle Geräte / Reagenzien, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden. </li><li> 2 mL 2-Phenoxyethanol auf 1 L des Systems Wasser (1: 500 2-Phenoxyethanol). </li><li> Bereiten 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Verwenden einer 10 ml-Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter die Lösung in eine sterilisierte Gewebekulturhaube zu sterilisieren. HINWEIS: NaHCO 3 verwendet effizient die Zell- und Gewebeklebstoff auf der Deckfläche zu verteilen von fluorodishes (sieheSchritt 3.2). </li><li> Bereiten 1,0 M CaCl 2 und 1,0 M MgCl 2. Sterilisieren mit einer 10 ml-Spritze und 0,2 &amp; mgr; m Porengröße Spritzenfilter in einem sterilisierten Gewebekulturhaube. </li><li> Hank&#39;s ausgewogene Salzlösung (HBSS), fügen Sie sterile CaCl 2 und sterile MgCl 2 bis 1x HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+, ohne Phenolrot bei einer Endkonzentration von 1 mM jeder vorzubereiten. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung. </li><li> Um Kulturmedium herzustellen, mischen 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) ohne Phenolrot, 25% HBSS enthaltend CaCl 2 und MgCl 2 (siehe Abschnitt 1.4), 25% Pferdeserum (HS), 10 Einheiten / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Vermeiden Medium, das Phenol-Rot, wie es autofluoresces, wodurch Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinflussen. 23 </li><li> Bereiten Sie 10 ml 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x MEM ohne Phenolrot. Melt Agarose / 1x MEM mit einem microwave. Bereiten kleine Volumina von Agarose (zB 10 ml) als sich wiederholende Nacherwärmung wird lonenkonzentrationen aufgrund von Flüssigkeitsverdampfung verändern. </li><li> Vor der Kultivierung sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im Autoklaven. </li></ol> 2. Licht-Schaden Paradigm <ol><li> Dark-Anpassung <ol><li> Legen Sie 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling (oder einer anderen transgenen Zebrafisch von Interesse) mit einem 6 - 14 Monate alt , in einer Umgebung frei von Licht für 14 d. Für weitere Detail Bezug nehmend auf 2, 6, 24, 25. </li></ol></li><li> Positionieren Sie den Tank mit 2 - 3 dunkeladaptierten transgenen Zebrafisch in System Wasser zwischen zwei Leuchtstofflampen , die Licht von 2.800 Lux emittieren 2, 6, 24, 25. </li&gt; <li> Expose Zebrabärblingen konstant intensives Licht für 35 h. Während der Belichtung, sicherzustellen, daß die Wassertemperatur zwischen 31 aufrechterhalten wird - 33 ° C. </li></ol> 3. Vorbereitung für Anzucht (Am Tag der Retinal Isolation) <ol><li> Mit 70% Ethanol, sterilisieren die Gewebekultur Haube und die Komponenten / Werkzeuge, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden (zB Flaschen mit MEM und HBSS, Pipetten, sterile Pipettenspitzen, usw.). </li><li> Herstellung von fluorodishes <ol><li> Mantel ein fluorodish für jede Netzhaut mit Zell- und Gewebekleber (siehe Tabelle der Materialien). </li><li> Verdünne die Zell- und Gewebekleber in 0,1 mM NaHCO 3 zu einer Endkonzentration von 70 ug / ml, werden 50 &amp; mgr; l zu jedem fluorodish und verteilt die Lösung in der Mitte der fluorodish mit einer 200 &amp; mgr; l - Pipettenspitze (etwa 1-1,2 cm Durchmesser ). </li><li> Inkubieren der beschichteten fluorodishes mit 1 - 3 h bei RT; (Alternativ O / N bei 4 ° C inkubieren). </li><li> Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie 3x mit 500 ul 1x MEM für jede Wäsche. Um zu vermeiden, um die beschichteten fluorodishes vor dem Austrocknen, halten sie in MEM bis retinalen Explantate montiert sind. </li></ol></li><li> Bereiten Kulturmedium, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Das Kulturmedium kann für bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 4. Isolierung und Kultivierung von Retinal Explantate HINWEIS: Das Protokoll ist unten beschrieben zur Isolierung der dorsalen Netzhaut, die das Netzhautregion, die überwiegend durch die beschriebene Licht-damage Paradigma läsionierten wird. Daher kann eine Beschädigung induzierte Proliferation und das zugehörige Ereignis von interkinetic Atommigration auftreten, in der dorsalen Retina. Netzhautregionen zu erhalten entsprechend den spezifischen Anforderungen der Forscher / Forschungsfrage kann jedoch die Isolierungsverfahren eingestellt werden. <ol><li> Euthanize ein lichtgeschädigter transgenen Zebrafisch einta Zeit in 1: 500 2-Phenoxyethanol. </li><li> Entfernen von einem MEM fluorodish mit einer 1,000 &amp; mgr; l-Pipette, so dass nur ein dünner Film von Flüssigkeit verbleibt. </li><li> Übertragen Sie die Zebrabärbling auf ein trockenes Papiertuch, entfernen Sie das Auge mit einem gebogenen Paar Dumont Zange (Zange # 5, 45 ° Winkel) und übertragen sie auf den fluorodish. </li><li> Mit Hilfe eines Stereomikroskops, richten das Auge mit der Pupille auf dem Deckglas des fluorodish so , dass die Rückseite des Auges mit dem Sehnerv sichtbar ist (Abbildung 1D). </li><li> Mit einem Paar McPherson-Vannas Schere entfernen Sie den Sehnerv, Schneiden nahe an der Rückseite des Auges. Außerdem entfernen Bindegewebe die Außenseite des Auges auskleiden. </li><li> Halten Sie das Auge zwischen den nasalen und temporalen Seite mit einem Paar # 5 Zange , während ein Schnitt an der Optik Stiel zu machen , indem sie mit einem Scherenblatt durch die Lamina cribrosa Lochen und Schneiden entlang sowohl der nasalen und temporalen Seiten des Auges (siehe Abbildung 1E , segmentierte line). </li><li> Die Verwendung von zwei Paaren von # 5 Zange, eine für die dorsale Seite der Netzhaut hält und das andere Paar die ventral von der dorsalen Retina zu trennen, um das Gewebe zu ziehen. HINWEIS: Es ist ratsam, die dorsal Netzhaut zu orientieren, so daß die Linse und die Ganglienzellschicht der Deck Gesicht während der Sklera nach oben zeigt. </li><li> Entfernen Sie die Sklera von der dorsalen Retina mit einem Paar von # 5 Zange, während die Linse hält , die mit einem zweiten Paar von # 5 Zange (Abbildung 1 H, I) an der Netzhaut verbunden ist. </li><li> Um das Objektiv zu entfernen, verwenden McPherson-Vannas Schere und hinter der Linse schneiden , ohne die Netzhaut zu beschädigen (1I, J). Manchmal löst sich die Linse in Schritt 4.7. In diesem Fall entfernen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Pinzette durch die Netzhaut an einer Schnittkante mit einem zweiten Paar von # 5 Pinzette. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper, während die Linse zu entfernen, ohne die Netzhaut schädigen. Flatten die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht mit Blick auf das Deckglasder fluorodish (Figur 1L, M). </li><li> Surround die Netzhaut mit 10 &amp; mgr; l von 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und lassen Sie die Agarose erstarren. </li><li> Beobachten Sie, dass die flüssige Agarose nicht die Netzhaut abhebt als auch eine leichte Erhöhung der Fähigkeit beeinträchtigen könnten tief in das Gewebe zu fokussieren. Wenn Hebe beobachtet wird, verwenden Sie eine Pipette Agarose zu entfernen. Lassen Rest Agarose-Set, bevor Sie mehr hinzuzufügen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.12 mehrmals vor dem 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Zugabe des gesamten fluorodish zu decken. Nach Erstarren der Agarose, 1,5 mL Kulturmedium. </li><li> Pflegen Sie die Netzhaut Explantation Kultur in einem 5% CO 2 / Umgebungsluft bei 32 ° C eingestellt für ca. 12 h die Netzhaut zu ermöglichen , von dem Stress , der durch die Isolationsverfahren entstanden zu erholen. Stellen Sie die Temperatur auf 32 ° C Netzhäuten bei der gleichen Temperatur wie Licht behandelt Zebrabärbling zu halten (siehe Schritt 2.3). </li></ol> 5. Multiphotonen-Mikroskopie Tabelle der Materialien), ein 40X Apo Fernwasser - Tauchziel (NA 1.15), ein Galvanometer - Scanner und eine komplett ausgestattete optimiert Klimakammer, die einen Einsatz für vier 35-mm-Petrischalen enthält. Die Bilder wurden mit einem nichtdescannte Detektor (R-NDD) erworben. <ol><li> Vor der Bildgebung, ins Gleichgewicht der Umweltkammer , die eine 5% CO 2 / Luftatmosphäre zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass leere Petrischalen in die Halterung eingesetzt werden Austritt von Gas in den Raum zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie das Mikroskopiesystem. </li><li> Sobald die Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht wird, fügen Brechungsindex Flüssigkeit auf die 40X Apo Fernwasser-Tauchziel (NA 1.15). HINWEIS: Der Brechungsindex Flüssigkeit mit optischen Eigenschaften ähnlich wie Wasser verwendet wird während der Langzeitabbildungsverdampfung von Wasser zu vermeiden. </li><li> Platz Grippeorodishes mit Retina-Explantate in die Kammer. Mit Hellfeld Licht, positionieren Sie die Probe in den Lichtweg und bringen den Mittelbereich der dorsalen Retina in der Fokusebene. </li><li> Verwenden GFP epifluoreszenten Licht auf GFAP zu konzentrieren: nGFP -Positive Müller Glia Kerne (2A, C). HINWEIS: Wenn Explantate nicht montiert sind flach oder Agarose unter der Explantation angesammelt hat , wird es schwierig sein , auf die GFAP zu konzentrieren: nGFP -positiver Kerne oder sie werden schwach fluoreszieren. <ol><li> Überprüfen Sie, ob innerhalb der gleichen Netzhaut Explantation zu einem anderen Bereich bewegt, wird die Fokussierung Problem überwinden. bewegen Andernfalls zu einem anderen Netzhaut Explantation. </li></ol></li><li> In der Bildaufnahme-Software, öffnen Sie die &quot;A1 MP GUI &#39;, die&#39; TiPad &#39;, die&#39; A1 Compact GUI&quot; und der &quot;ND Erwerb &#39;Fenster. Für Multi Bildgebung, sicherzustellen, dass die &quot;IR NDD &#39;Option im&#39; A1 Compact GUI &#39;gewählt wird. </li><li> In der &quot;setting &#39;Feld wählen IR-DM für die 1 dichroitischen Spiegel st und wählen Sie das Bandpassfilter 525/50 GFP - Fluoreszenz zu erwerben. </li><li> Schalten Sie den IR-Laser im Fenster mit der Bezeichnung &quot;A1MP GUI&quot;. Es dauert ein paar Minuten dauern, bis der Laser bereit zu sein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 910 nm GFP-Fluoreszenz zu erregen und den Laser auszurichten, indem die &#39;Auto Ausrichtung &quot;Taste in der&quot; A1 MP GUI&#39; Fenster klicken. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Raum und Ausrüstung Lichter ausgeschaltet sind oder abgedeckt, bevor Sie den Auslöser in der &quot;A1 MP GUI &#39;Öffnen Überbelichtung des Photovervielfacherröhre zu vermeiden. Um den Lärmpegel, beherbergen das Mikroskop in abgedunkelter Umgebung zu reduzieren. </li><li> Erwerben Bilder von einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixel, bei einem Zoom von zwei und einer Pixel Verweilzeit von 4,8 &amp; mgr; s / Pixel. Etwa die Laserleistung Fenster durch Änderung der &quot;Erwerb Bereich&quot; in der &quot;A1MP GUI&quot; und die Verstärkung in der &#39;A1 Compact GUI&#39; eingerichtet. </li><li> Einrichten des Z-Stapel <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf das Ganglion Zellschicht der oberen Brennebene des Z-Stapel zu setzen in der &#39;Z&#39;-Subwindow innerhalb des &quot;ND Erwerb&#39; Fenster. Einige GFAP: nGFP -positiven Zellen werden typischerweise in der Ganglienzellschicht befindet, welche die basale Grenze der Netzhaut (2A, D) zu identifizieren hilft. </li><li> Bewegen , um die Fokusebene durch die Ebene der ONL (2A, B), die durch die Gegenwart von schwach markierten GFAP gekennzeichnet ist: nGFP -positiven Zellen , die rund sind und vergrößert relativ zu ihren Gegenstücken in der INL (2A, C) . </li><li> Setzen Sie diese Ebene wie die Unterseite des z-Stack. Sicherzustellen , dass der gesamte ONL wird abgebildet (2A, B). </li><li> Wenn Fokusebene Verschiebungen auftreten, die erfordern, während der Abbildungsperiode neu eingestellt wird, doppelklicken Sie auf die mittlere Position in der &#39;z&#39; Subwindow es als die &quot;Heimat&quot; Position zuzuweisen. Wechseln Sie in &quot;symmetrischen Modus definiert &#39;und klicken Sie auf &quot;relative&quot;. </li><li> Stellen Sie die z-Schrittweite zwischen 0,7 bis 1 um. </li></ol></li><li> Z-Intensität Korrektur: <ol><li> Wenden Sie z-Intensität Korrekturen für den Verlust der Pixelintensität zu kompensieren aufgrund der Lichtstreuung bei der Abbildung in den tiefen Schichten des Gewebes. </li><li> So stellen Sie die Korrektur nach oben, öffnen Sie die &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster. So stellen Sie die &#39;z-Stack-Bereich &quot;, wählen Sie&quot; Aus ND&#39;. </li><li> Klicken Sie auf den unteren Brennebene in der &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster (in diesem Fall entspricht der Ganglion-Zellschicht) und stellen Sie die Laserintensität (&quot; Erwerb Bereich &quot;in der&quot; A1MP GUI) und die Verstärkung (A1 Compact GUI ). </li><li> Klicken Sie auf den Pfeil neben den &#39;z-Werte &quot;in der&quot; z-Intensitätskorrektur&#39; Fenster, um die Einstellungen zu bestätigen, die später unter dem Posten &quot;Geräteeinstellungen&quot; in der &quot;z-Intensitätskorrektur&quot; Fenster für die gewählte Brennebene sind. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die Mitte einnd oberen Ebenen, die Erhöhung der Laserleistung und der Verstärkung. Weitere Fokusebenen können bei Bedarf hinzugefügt werden. Siehe Tabelle 1 für bestimmte Laser und Verstärkungseinstellungen für Experimente in den Figuren 2 bis 4. </li><li> Stellen Sie den &quot;Erwerb Bereich&quot; in der &quot;A1 MP GUI &#39;Fenster. Vermeiden einen Erfassungsbereich größer als 15 und einen Verstärkungsfaktor höher als 126 zu Beginn der Bildgebungs Auswahl zu umgehen Photobleaching und eine erhöhte Geräuschentwicklung. HINWEIS: Laser und Photomultiplier-Röhren unterscheiden zwischen Mikroskopiesysteme, Test Laser und Verstärkungseinstellungen optimale Abbildungsbedingungen für das Mikroskop, während Photobleichens Vermeidung einrichten zu erhalten. </li><li> Wählen Sie &quot;relative Intensitätskorrektur&quot; in der &quot;z-Intensitätskorrektur &#39;Fenster. </li></ol></li><li> In der &quot;Zeitreihen&quot; Subwindow im Fenster &quot;ND Erwerb&quot;, stellen Sie die Dauer bis 8 h und das Intervall auf &quot;ohne Verzögerung&quot;. Dann stellen Sie sicher, dass die &quot;Run z-Korrektur&quot; in t zu klickener &#39;z-Stapel &quot;Unterfenster im&quot; ND Erwerb &quot;Fenster, um die 3-D-Zeitreihen zu erwerben. </li><li> Pflegen retinalen Explantate bei einer Temperatur von 27 - 29 ° C während der gesamten Dauer der Bildaufnahme. </li><li> Während des gesamten Bildaufnahmeperiode, falls erforderlich, neu einzustellen, den Leistungspegel und Verstärkung, um die Bildqualität für die Post-Imaging-Analyse zu erhalten. Für Anpassungen führen Sie die Schritte 5.11.2 - 5.11.4. </li><li> Wenn die Fokusebene verschiebt, Pause oder den Lauf zu stoppen und Schritt 5.11 erneut durchführen. HINWEIS: Wenn &quot;relative z-Korrektur&quot; in 5.12.7 Schritt gewählt wurde und Schritt 5.11.4 war es nicht notwendig, durchgeführt sollte Macht und Gewinn Ebenen, es sei denn, umfangreiche Photobleichens aufgetreten neu zu justieren. </li></ol> 6. Analyse der Geschwindigkeit <ol><li> Extrahieren Sie die Zeit, eine &quot;Region of Interest&quot; auf der Bildeinstellung. Verwenden Sie die &quot;Zeitmessung&quot; Werkzeug und exportieren Sie die Zeitwerte in eine Tabelle. </li><li> Crop eine Region, die eine di enthältViding GFAP: nGFP -positiver Kern. </li><li> Wählen die beschnittene Bereich, so dass sie mindestens einen Kern enthält, der nicht INM erfährt, um einen Referenzpunkt zu setzen, um anschließend die Abstände zu messen, die die Trennkern in Bezug auf die basale INL migriert. HINWEIS: einen Kern zu wählen, die in der basalen INL bleibt, hilft es, ein 3-D-Rekonstruktion der Zeitreihe vorzubereiten. </li><li> Alternativ kann , wenn ein GFAP: nGFP -positiver Zelle in der ONL im gesamten Erfassungszeitraum beobachtet wird, eine vertikale Linie mit fester Länge aus dem ONL Kern zu den basalen INL Spanning verwenden , um einen Bezugspunkt zu identifizieren. </li><li> Mit der Funktion &#39;show Scheiben Ansicht&#39;, erzeugen orthogonalen Projektionen. Anschließend ändern Sie den Modus von &quot;Scheibe&quot; auf &quot;Maximum Intensity Projection &#39;. </li><li> Drehen Sie den &#39;xy&#39; Ansicht der orthogonalen maximalen Projektion. Je nach Ausrichtung, bei der die wandernde / Dividieren Kern ist am besten sichtbar ist, einelso ausschalten entweder die &#39;xz&#39;- oder die &quot;yz&#39;-Ansicht. </li><li> Klicken Sie auf das restliche Bild mit der rechten Maustaste und extrahieren Sie die &#39;xz&#39; oder &#39;yz&#39;-Bild-Serie mit dem &quot;Neues Dokument erstellen aus dieser Sicht&#39; Funktion. Falls erforderlich, wird das Bild gedreht. </li><li> Mit Hilfe der &quot;manuellen Messung&quot; Funktion, ziehen Sie eine horizontale Linie quer über das Bild auf der untersten Ebene des Kerns , die in den basalen INL bleibt und unterliegen nicht INM (= Bezugspunkt; 4A - E, Linie rot horizontal). </li><li> Messen Sie den Abstand zwischen der Bezugslinie und der basalen Punkt des migrierenden Nukleus für die Zeitreihen der &quot;Line - Messung&quot; Werkzeug in der Analyse - Software (siehe Abbildung 4A - E). </li><li> Sobald die Kernhülle bricht, messen Sie die basale Stellung des Somas, wenn es nach der Diffusion von GFP in der gesamten Zelle identifizierbar ist. </li><li> ein Tabellenkalkulations-Software verwenden, zeichnen den Abstand a nuCleus migriert gegen die Zeit vergangen (4F). <ol><li> Zur Bestimmung der apikal Wanderungsgeschwindigkeit (v a), Graph die Abstände für die Zeit vor der Kernhülle Zusammenbruch gereist auftritt (4G). </li><li> Wählen Sie die Datenreihe im Diagramm mit der rechten Maustaste klicken und legen Sie eine lineare Regressionskurve einschließlich der &#39;y = mx + c&#39; entsprechende Funktion. Die Steigung &#39;m&#39; in der Funktion steht für die Geschwindigkeit v a (4G). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.11.1 und 6.11.2 für die erste Phase der schnellen Migration basalen die basale Migrationsgeschwindigkeit, v b (4H) zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

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<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
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<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Studien , die Mechanismen zu untersuchen Leitungs Regeneration des geschädigten erwachsenen Zebrabärbling Retina überwiegend eingesetzten immunzytochemische Methoden 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Festlegung der Bedingungen, die mit Retina-Explantate Kultur und Live-Cell-Imaging auf Phänomene, ...

Im Gegensatz zu Menschen, Zebrabärbling (Danio rerio) zeigen eine robuste Regeneration Reaktion auf den Zelltod von retinalen Neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor - Nekrose - Faktor α, ein Signalmolekül , das aus sterbenden retinalen Neuronen freigesetzt wird , induziert Müller Glia in der Basalschicht Inner Nuclear Wohnsitz (INL) der Netzhaut 5 zu proliferieren und neuronaler Vorläuferzellen erzeugen , die vor Differenzierung in die neuronale Zelle zur Proliferation fortzusetzen Typen , die 2 starben, 3, 4. Während der Proliferationsphase der Regenerierungsreaktion, die Kerne von Müller Glia und deren abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen durchlaufen eine sich wiederholende Migrationsmuster in Phase mit dem Zellzyklus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 </sup<html> &gt; 7. Nuclei positioniert in der basalen INL replizieren ihre DNA vor zu den Äußeren Kernschicht Migration (ONL), wo sie sich teilen, bevor die entstehenden Kerne basal zum INL zurückzukehren. Dieser Prozess wurde erstmals während neuroepithelial Entwicklung mit histologischen Methoden beschrieben, während Live-Cell - Imaging Ansätze bestätigt später die Interpretation von Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Beide histochemische und Live-Cell - Imaging Ansätze verwendet wurden Mechanismen zur Bestimmung zugrunde liegenden INM und seine Funktion bei der Entwicklung von Neuroepithels einschließlich der Netzhaut 9, 11, 12, 13. Jedoch haben die Mechanismen INM im erwachsenen Retina Regenerieren nicht sehr detailliert untersucht wordenxref &quot;&gt; 6, 7. Live-Cell - Imaging wird eine unschätzbare Ansatz sein , unsere Kenntnisse über die Signalwege zu fördern , die INM im erwachsenen regenerierende Retina steuern. Bis vor kurzem wurde der Abbildung lebender Zellen von INM in der Retina beschränkt auf entweder live Genaktivität oder Hühnerembryonen oder postnatale Maus retinalen Explantate 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Während der Netzhaut Explantate von erwachsenen Tieren aus einer Vielzahl von Arten , einschließlich Maus, Ratte und Zebrabärbling haben für verschiedene zellbiologische Ansätze 17, 18, 19, 20, Live-Cell - Imaging Experimente mit retinalen Explantate ha genutzt wordenve beschränkt Zeiträume zu kurz und nicht kontinuierlich über mehrere Stunden 21 ausgeführt worden ist , 22. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch Retina Abbildung lebender Zellen Experimente Überwachung INM mit Multi-Photonen - Mikroskopie 6 durchzuführen. Live - Cell - Imaging-Ansätze sind vorteilhaft gegenüber immunhistochemischen Methoden , wenn die Mechanismen zu untersuchen INM Controlling, wie die Dynamik des INM, zum Beispiel Geschwindigkeiten betroffen sein könnten , anstatt die Lage der Mitose, die würde möglicherweise nicht mit Immunzytochemie nachgewiesen werden. In der Zukunft hat dieses Verfahren auch das Potential geändert werden zu studieren andere dynamische Vorgänge bei Netzhautregeneration, wie Phagozytose von Photorezeptoren durch Müller Glia oder das Verhalten von Mikroglia sterben.

<table><tbody><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>World precision instruments</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5, 45&deg; Winkel</td><td>World precision instruments</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Schere</td><td>World precision instruments</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordishes</td><td>World precision</td><td>instruments FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>ähnlicher Typ des Dissektions-Stereomikroskops funktioniert</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank Klasse Typ A2</td><td>Labconco</td><td></td><td>äquivalenter Typ funktioniert</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Inkubator</td><td>Thermowissenschaftlicher</td><td>HEPA-Klasse 100</td><td>gleichwertiger Typ funktioniert</td></tr><tr><td>Sylvania Leuchtstofflampen OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m Porengröße Acrodisc Spritzenfilter</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spritze</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Luer-Lok Spritze</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Ca2+/Mg2+, ohne Phenolrot, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM ohne Phenolrot, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolut</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Phenoxyethanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak Zell- und Gewebeklebstoff</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Brechungsindex Flüssigkeit&nbsp;</td><td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 Multiphotonenmikroskop ausgestattet mit einem MaiTai Infrarotlaser</td><td>Nikon-äquivalentes</td><td></td><td>System funktioniert</td></tr><tr><td>40X Apo Langstrecken-Wasserimmersionsobjektiv (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klimakammer mit Einsatz für 35-mm-Petrischalen</td><td>Okolab-äquivalentes</td><td></td><td>System funktioniert NIS-Analysesoftware</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kultur von adult transgener zebrafische retinal explantate für das live-cell-imaging von multiphotonen-mikroskopie

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Ein endogenes Regenerationsprogramm wird von Müller Glia im erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) Retina folgende neuronaler Schädigung und Tod eingeleitet. Die Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus und neuronale Vorläuferzellen erzeugen, die den folgenden Runden von Zellteilungen durchlaufen und in die verlorene neuronalen Zelltypen differenzieren. Sowohl Müller Glia und neuronaler Vorläuferzellkernen replizieren ihre DNA und durchlaufen die Mitose in bestimmten Orten der Netzhaut, also wandern sie zwischen dem basalen Inner Kernschicht (INL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) verbunden sind, in einem Verfahren , wie Interkinetic beschrieben Nuclear Migration (INM). INM hat überwiegend in der Entwicklung von Netzhaut untersucht worden. Um die Dynamik von INM im erwachsenen Regenerieren Zebrabärbling Retina im Detail, Live-Cell-Imaging von fluoreszenzmarkierten Müller Glia / neuronale Vorläuferzellen zu untersuchen ist nicht erforderlich. Hier stellen wir die Bedingungen zu isolieren und Kultur dorsalen Retinaevon Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling , die für 35 h konstant starkem Licht ausgesetzt waren. Wir zeigen auch , dass diese Netzhautkulturen sind tragfähige Lebendzell - Imaging - Experimente durchführen, kontinuierlich z-Stapel - Bildern über die Dicke der retinalen Explantation für bis zu 8 h unter Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie zu überwachen das Zugverhalten von GFAP Erwerb: nGFP -positiven Zellen . Darüber hinaus beschreiben wir die Details post-Bildanalyse auszuführen, um die Geschwindigkeit der apikalen und basalen INM zu bestimmen. Zusammengefasst haben wir Bedingungen, die Dynamik von INM in einem Erwachsenen-Modell der neuronalen Regeneration zu untersuchen. Das wird unser Verständnis dieser entscheidenden zellulären Prozess voranbringen und es uns ermöglichen, die Mechanismen zu bestimmen, die INM steuern.

Die Isolierung der Netzhaut nach dem Verfahren in der schematischen Darstellung in Figur 1 skizziert ermöglicht die Kultivierung eines abgeflachten dorsal Retina von lichtgeschädigter adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling über einen Zeitraum von mindestens 24 h in einer 5% CO 2 / Luft - Umgebung. Diese flachen montierten retinalen Explantate können Bildbrennebenen bei tiefen Gewebespiegel verwendet werden. Ein Beispiel ist Müller Glia ...

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Das allgemeine Ziel dieses Isolationsverfahrens besteht darin, die Live-Cell-Bildgebung von proliferierenden Zellen zu ermöglichen, die eine interkinetische Kernmigration in retinalen Explantkulturen von geschädigten Zebrafischen durchlaufen. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Regeneration der Netzhaut beantworten, beispielsweise welche Mechanismen die interkinetische Kernmigration antreiben oder ob Müller-Gliazellen in einer renalen Vorläuferzelle eine ähnlich regulierte interkinetische Kernmigration aufweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das dynamische Verhalten der proliferierenden Zellen während der interkinetischen Kernmigration im Regenerationsprozess verfolgt werden kann, wodurch die Untersuchung zellspezifischer Mechanismen in einzelnen Phasen des Zellzyklus ermöglicht wird.Obwohl diese Methode Einblicke in die interkinetische Kerbwanderung ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Bereiche der Netzhautforschung anwenden, beispielsweise zur Untersuchung des Verhaltens von Mikroglia oder der Phagozytose sterbender Neuronen durch Müller-Gliazellen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Zebrafisch auf ein trockenes Papiertuch übertragen. Entfernen Sie dann mit einer gebogenen Pinzette eines der Augen und übertragen es auf eine FluoroDish.Unter einem Stereomikroskop das Auge so ausrichten, dass die Pupille der Deckglasplatte der FluoroSchale zugewandt ist und der Sehnerv an der Rückseite des Auges sichtbar ist. Anschließend den Sehnerv so nah wie möglich an der Hinterseite des Auges entfernen. Zusätzlich das Bindegewebe außerhalb des Auges entfernen.Halten Sie das Auge mit einer Pinzette an der nasalen und temporalen Seite fest, während Sie einen Schnitt am Sehnervenstiel vornehmen, indem Sie mit einer Schere durch die Lamina cribrosa stechen und entlang der nasalen und temporalen Seite des Auges schneiden. Ziehen Sie danach die dorsale und ventrale Seite der Retina auseinander. Entfernen Sie die Sklera von der dorsalen Retina mit einer Pinzette, während Sie die Linse, die mit der Retina verbunden ist, mit einer zweiten Pinzette festhalten.Entfernen Sie danach die Linse und das Glask&ouml;rper, ohne die Netzhaut zu besch&auml;digen. Anschlie&szlig;end gl&auml;ttet man die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht nach oben, sodass sie der Deckglasplatte der FluoroDish zugewandt ist. Danach umgibt man die Netzhaut mit 10 Mikrolitern 1&nbsp;%iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt.Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht durch die flüssige Agarose angehoben wird, da selbst eine geringfügige Hebung die Fokussierbarkeit durch das Gewebe beeinträchtigen könnte. Falls ein Anheben beobachtet wird, entfernen Sie die Agarose mit einer Pipette. Es ist entscheidend, dass die Agarose das Gewebe nicht von der Deckglasunterlage anhebt, da dies die Möglichkeit verringert, qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bevor Sie 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt hinzufügen, um die gesamte FluoroDish abzudecken. Sobald die Agarose erstarrt ist, geben Sie 1,5 Milliliter Kulturmedium zum Gewebe hinzu. Öffnen Sie in der Bildakquisitionssoftware die Fenster A1 MP GUI TI pad, A1 compact GUI und ND-Akquisition.Wählen Sie für die Multiphotonen-Bildgebung die Option IRNDD im A1 compact-GUI-Fenster. Wählen Sie anschließend im Einstellungsfeld IRDM für den ersten Dichroischen Spiegel und vergewissern Sie sich, dass der Bandpassfilter auf 525 bis 50 eingestellt ist, um die GFP-Fluoreszenz zu erfassen. Schalten Sie danach den IR-Laser im A1 MP-GUI-Fenster ein.Es dauert einige Minuten, bis der Laser bereit ist. Danach die Wellenlänge auf 910 Nanometer einstellen, um die GFP-Fluoreszenz anzuregen, und den Laser durch Klicken auf die Automatischer-Ausrichtung-Schaltfläche justieren. Nachdem die Netzhautkultur auf dem Mehrphotonenmikroskop-Objekttisch platziert wurde, sicherstellen, dass das Raumlicht und die Gerätebeleuchtung ausgeschaltet sind, bevor der Verschluss geöffnet wird, um eine Überbelichtung der Fotomultiplierröhre zu vermeiden.Um die Rauschpegel zu reduzieren, platzieren Sie das Mikroskop in einer abgedunkelten Umgebung. Nehmen Sie Bilder eines Bildfeldes von 300 mal 300 Pixeln mit einem Zoomfaktor von zwei auf, die im Scan-Bereichsfenster festgelegt werden, sowie eine Pixel-Verweilzeit von 4,8 Mikrosekunden pro Pixel, die im A1 Compact-GUI-Fenster gewählt wird. Stellen Sie die Laserleistung grob ein, indem Sie den Aufnahmebereich im A1 MP-GUI-Fenster und die Verstärkung im A1 Compact-GUI-Fenster anpassen.Fokussieren Sie sich nun auf die Ganglienzellschicht und legen Sie die obere Fokusebene des z-Stapels im z-Unterfenster innerhalb des ND-Aufnahmefensters fest. Bewegen Sie die Fokusebene durch die Ebene der äußeren nuclearen Schicht, die sich durch das Vorhandensein schwach gefärbter GFAP- und GFP-positiver Zellen auszeichnet, die im Vergleich zu ihren Gegenstücken in der inneren nuclearen Schicht rund und vergrößert sind. Legen Sie diese Ebene als untere Grenze des z-Stapels fest.Als Nächstes legen Sie die z-Schrittgröße zwischen 0,7 und einem Mikrometer fest. Um die z-Intensitätskorrektur einzurichten, öffnen Sie das Fenster für die z-Intensitätskorrektur und wählen ND aus, um den z-Stapel-Bereich festzulegen. Klicken Sie dann im Fenster für die z-Intensitätskorrektur auf die untere Fokusebene und stellen Sie die Laserintensität und den Verstärkungsfaktor ein.Klicken Sie anschließend auf den Pfeil neben den z-Werten im Fenster zur z-Intensitätskorrektur, um die Einstellungen zu bestätigen, die danach im Fenster zur z-Intensitätskorrektur unter Geräteeinstellungen für die gewählte Fokusebene angezeigt werden. Wiederholen Sie den Vorgang für die mittlere und obere Ebene, wobei Sie die Laserleistung und die Verstärkung erhöhen. Legen Sie den Aufnahmebereich im A1 MP-GUI-Fenster fest und vermeiden Sie, zu Beginn der Aufnahme einen Bereich größer als 15 und eine Verstärkung höher als 126 zu wählen, um Photobleaching und erhöhte Rauschpegel zu vermeiden.Wählen Sie anschließend die relative Intensitätskorrektur im Fenster „z intensity correction“. Legen Sie im Untermenü „time series“ des ND-Aufnahme-Fensters die Dauer auf 8 Stunden und das Intervall auf „no delay“ fest. Klicken Sie dann im Untermenü „z stack“ des ND-Aufnahme-Fensters auf „run z correction“, um eine 3D-Zeitreihe aufzuzeichnen.Beschneiden Sie in diesem Verfahren einen Bereich, der einen teilenden, GFAP- und GFP-positive Zellkern enthält. Wählen Sie einen beschittenen Bereich, der mindestens einen Zellkern umfasst, der keine INM durchläuft, um einen Referenzpunkt festzulegen, relativ zu dem anschließend die Distanz gemessen werden kann, die der teilende Zellkern im Verhältnis zur basalen INL zurückgelegt hat. Es ist hilfreich, eine 3D-Rekonstruktion anzufertigen.Erzeugen Sie mithilfe der Funktion „Schnitte anzeigen“ orthogonale Projektionen. Ändern Sie anschließend den Modus von „Schnitt“ auf „Projektion mit maximaler Intensität“. Deaktivieren Sie dann die XY-Ansicht der orthogonalen Maximalprojektion.Je nach Ausrichtung, unter der der wandernde und teilende Kern am besten sichtbar ist, schalten Sie gegebenenfalls entweder die XZ- oder die YZ-Ansicht aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das verbleibende Bild und extrahieren Sie die XZ- oder YZ-Bildserie mithilfe der Funktion „Neues Dokument aus dieser Ansicht erstellen“. Drehen Sie das Bild gegebenenfalls.Verwenden Sie die manuelle Messfunktion, um eine horizontale Linie auf der unteren Ebene des Kerns zu zeichnen, der in der basalen INL verbleibt und keine INM durchläuft. Messen Sie mithilfe des Linienmesswerkzeugs in der Analyse-Software den Abstand zwischen der Referenzlinie und dem basalen Punkt des wandernden Kerns für die Zeitreihe. Gezeigt ist hier die maximale YZ-Projektion einer Z-Stack-Bildreihe von Netzhaut-Explanten zu verschiedenen Zeitpunkten der mittels Multiphotonenmikroskopie aufgezeichneten Zeitrafferaufnahme.Mithilfe des Linienwerkzeugs unter der manuellen Messfunktion wurde eine horizontale Linie auf der Höhe der mit einem Stern gekennzeichneten Referenzzelle platziert. Eine vertikale Messlinie wurde ausgehend von der horizontalen Linie bis zur basalen Position des wandernden GFAP- und GFP-positiven Kerns positioniert. Abstand, den die in der vorherigen Abbildung gemessene Zelle F0 apikal gewandert ist, und die daraus hervorgehenden Tochterzellen D1 und D2 basal in der Mehrphotonen-Zeitrafferaufnahme gewandert sind.Die rote Linie zeigt die Messungen an, für die die apikale Migrationsgeschwindigkeit berechnet wurde, während die schwarze und graue Linie die Messungen anzeigen, die zur Berechnung der basalen Migrationsgeschwindigkeiten für D1 bzw. D2 verwendet wurden. Die Distanz wurde gegen die Zeit selbst für die apikale Migration vor dem Zerfall der Kernhülle und für die Phase der schnellen basalen Migration der Tochterzelle D1 aufgetragen. Wenn der Vorgang beherrscht ist, kann die Isolierung der Netzhäute von drei Fischen in 60 bis 90 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Diese Zeit schließt die Vorbereitungsschritte nicht ein.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, so schnell wie möglich zu arbeiten, um die Lebensfähigkeit des Netzhaut-Explantats sicherzustellen. Außerdem ist es entscheidend, die Netzhäute so flach wie möglich zu montieren, um die Bildgebung in tieferen Gewebeschichten zu ermöglichen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafisch-Netzhäute isoliert und montiert, Live-Cell-Imaging durchführt, um die interkinetische Kernmigration zu verfolgen, und Migrationsgeschwindigkeiten bestimmt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Das Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung primärer retinaler Ganglienzellen aus Zebrafischembryonen. Embryonen im Frühstadium werden dissektioniert, um die Augen zu isolieren, die anschließend mechanisch in eine Suspension aus retinalen Ganglienzellen dissoziiert werden. Diese Zellsuspension wird auf Deckgläsern kultiviert, die mit Klebeproteinen beschichtet sind, um die Axonentwicklung zu erleichtern.

Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Quelle: Lahne, M., et.al. Kultur von adulten transgenen Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten für die Bildgebung lebender Zellen mittels Multiphotonenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Live-Zell-Bildgebung der Kernmigration von Müller-Gliazellen in Agarose-eingebetteten Zebrafisch-Netzhautexplantaten nach lichtinduzierter Photorezeptorschädigung. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), der von geschädigten Photorezeptoren freigesetzt wird, aktiviert Müller-Gliazellen und löst die...

Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Erfahren Sie die Kultur adulter Zebrafisch-Retina-Explantate für Live-Cell-Imaging mit Multiphotonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der interkinetischen Kernmigration während der Netzhautregeneration.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

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