Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Forschern die Erfassung, Trennung und Analyse nativer Protein-Komplexe zu ermöglichen, die aus Gewebelysaten mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese gewonnen wurden. Diese Methode kann Forschern, die Proteine untersuchen, helfen, da sie in der Lage ist, ansonsten labile Proteinwechselwirkungen unter nahezu nativen Bedingungen zu stabilisieren und somit deren Identifizierung und anschließende Analyse zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie gängige biologische Methoden verwendet, wodurch sie breit anwendbar ist und an die individuellen Forschungsziele angepasst werden kann.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die blaue native Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie im Textprotokoll beschrieben vor. Schließen Sie die Elektroden an die Stromversorgung an und führen Sie die Elektrophorese der Proteine im Gel bei 150 Volt durch, bis sich das Farbband etwa zwei Zentimeter in die Trennschicht hineinbewegt hat. An diesem Punkt stoppen Sie das Verfahren und trennen die Stromversorgung.

Nach dem Zerlegen der Elektrophoreseapparatur die Glasplatten der Gelenkassette trennen. Die Stapelschicht entfernen und entsorgen. Das Gel vorsichtig direkt unterhalb der unteren Kante der Farbstofffront schneiden, wobei darauf geachtet werden sollte, dass dieser Schnitt so glatt und gerade wie möglich verläuft.

Entfernen Sie anschließend das ungenutzte Gelstück. Schneiden Sie alle ungenutzten Bereiche an den Rändern des Gelstreifens ab. Legen Sie den Streifen vorsichtig in 10 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in einem kleinen Behältnis und mischen Sie ihn sanft durch Schwenken für 30 Minuten, um eine Gleichgewichtseinstellung zu erreichen.

Nach der Gleichgewichtseinstellung verwerfen und das PBS durch weitere 10 Milliliter ersetzen. Pipettieren Sie 500 Mikroliter einer 25-Millimolar-Lösung von DSP, gelöst in Dimethylsulfoxid, in das PBS und mischen Sie wie zuvor 30 Minuten lang weiter. Nach 30 Minuten gießen Sie die DSP-Lösung ab.

Mit 10 Milliliter 0,375 molarer HSCL, pH 8,8, die 2 % Natriumlaurylsulfat enthalten, zur Quenchung des nicht umgesetzten DSP. Fortsetzung der Inkubation für 15 Minuten. Während der Gelstreifen quencht, SDS-PAGE-Gellösungen gemäß Standardverfahren vorbereiten.

Fügen Sie keine Polymerisationsreagenzien hinzu. Nach der Abkühlung bringen Sie den Blue-Native-Gel-Strang wieder auf Raumtemperatur und gießen den Strang in eine neue Gelkassette. Heben Sie hierzu das Gel vorsichtig an und legen Sie es auf eine saubere Abstandshalterplatte für die Gelkassette.

Richten Sie den Streifen so aus, dass er gegenüber der vorherigen Orientierung umgekehrt ist und die Unterseite der Farbfront am nächsten zur Oberkante der neuen Kassette liegt. Platzieren Sie den Streifen so, dass seine obere Kante bündig mit der Position liegt, an der die obere Kante der Abdeckplatte sein wird. Stellen Sie sicher, dass die Farbfront parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte verläuft.

Drücken Sie eine Seite des ausgeschnittenen Streifens gegen eine der Abstandshalterwände, sodass auf der anderen Seite Platz bleibt, um das Gel einzufüllen, und um einen Proteinstandard oder eine Proteinladder aufzutragen. Falls die untere Kante des Gelsestreifens unregelmäßige oder gezackte Stellen aufweist, schneiden Sie diese vorsichtig ab. Sobald der Gelsestreifen korrekt positioniert ist, legen Sie die Abdeckplatte über die Abstandshalterplatte.

Üben Sie sanften Druck aus, um eingeschlossene Luftblasen herauszudrücken. Bauen Sie die Gelelektrophoreseapparatur gemäß den Anweisungen des Herstellers weiter zusammen. Der Gelistreifen kann sich manchmal verschieben, wenn die obere Platte platziert wird.

Es ist hilfreich, wenn der Streifen etwas über die Oberkante der oberen Platte hinausragt, damit er mit einem Spatel justiert werden kann, um eventuelle Verschiebungen zu korrigieren. Fügen Sie die Polymerisationsreagenzien zum Puffer für das Trenngel hinzu und gießen Sie diesen mit einer serologischen Pipette in die vorbereitete Gelfolie. Füllen Sie die Gelfolie bis auf etwa zwei Zentimeter unterhalb des ausgeschnittenen blauen Native-PAGE-Gelstreifens auf, um Platz für die Anreicherungsschicht zu lassen.

Dann 100 Mikroliter Butanol über der gegossenen Gelebene hinzufügen und 30 Minuten lang die Polymerisation der Trenngelebene ablaufen lassen, bevor das Butanol abgegossen wird. Anschließend die Polymerisationsreagenzien zur Stapelgelelektrolytlösung hinzufügen. Mit einer serologischen Pipette die Stapelgelebene so auftragen, dass der gesamte verbleibende freie Raum in der Gelenkassette ausgefüllt wird.

Neigen Sie die Gelenkassette beim Gießen der Sammelschicht, damit der Bereich unterhalb des Gels streifens gefüllt wird und keine Luftblasen eingeschlossen werden. Während der Puffer für die Sammelschicht den freien Raum unterhalb des Gels streifens füllt, bringen Sie die Gelenkassette nach und nach wieder in horizontale Lage. Füllen Sie den freien Raum neben dem ausgeschnittenen Gels treifen weiter mit dem Puffer für die Sammelschicht, bis er fast überläuft.

Anschießend lässt man die übereinandergelegte Schicht 30 Minuten lang polymerisieren. Nach der Polymerisation der übereinandergelegten Schicht wird die Gelfolienkassette aus der Gießvorrichtung entfernt, mit destilliertem Wasser gespült und die Elektrophoresevorrichtung gemäß den Herstelleranweisungen zusammengebaut. Die innere Kammer wird vollständig mit 1x SDS-PAGE-Laufpuffer gefüllt.

Danach die äußere Kammer bis zur vom Hersteller angegebenen Füllhöhe auffüllen. Den Raum neben dem ausgeschnittenen Gelestreifen mit einer Molekulargewichtsleiter oder dem geeigneten Proteinstandard beladen. Die Elektroden an die Stromversorgung anschließen und die Proben bei 120 Volt elektrophoretisch laufen lassen.

Wenn der Coomassie-Farbstoff aus dem Gel läuft, beenden Sie den Lauf und trennen Sie die Stromversorgung. Analysieren Sie das Gel mit Standardmethoden der Elektroblotting und der proteinbasierten Antikörperdetektion. Die Validierung der Multimer-PAGE wird hier mittels Immunoblotting gezeigt.

Der gefangene Kinesin-Komplex wird durch Diphyo-3-itol gespalten, was zeigt, dass die Aggregate mit hohem Molekulargewicht durch Vernetzung kleinerer Bestandteile entstehen. Dargestellt sind hier Ergebnisse, bei denen Gehirnlysat mit steigenden Konzentrationen von SDS oder Triton behandelt wurde, wodurch die Detektion monomeren Alpha-Synucleins zunahm, während die Detektion des löslichen Oligomers Tetramer abnahm. Hier werden repräsentative Ergebnisse der Multimer-PAGE gezeigt, die zur Erfassung löslicher Komplexe in Rattenhirnlysat verwendet wurde.

Proteine wurden mittels Immunoblot nachgewiesen. Das erwartete monomere Molekulargewicht jedes Proteins ist unterhalb der Spuren angegeben. Ebenso wird hier die Anreicherung von membrangebundenen Komplexen gezeigt.

Die Multimer-PAGE erfasst gelegentlich einen Komplex nicht, wie auf der Immunoblot-Analyse des respiratorischen Komplexes II von SDHA gezeigt. Eine Diskussion möglicher Erklärungen hierfür findet sich im textbasierten Protokoll. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa acht Stunden durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine In-Gel-Vernetzung nativer Protein-Komplexe durchführt, gefolgt von einer erneuten Gel-Einbettung und Trennung mittels sekundärer SDS-PAGE. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid äußerst gefährlich sein kann und persönliche Schutzausrüstung beim Gießen des Gels getragen werden sollte. Im Anschluss an dieses Verfahren können die getrennten, stabilisierten Komplexe aus dem Gel eluiert oder ausgeschnitten und auf verschiedene Weise analysiert werden, beispielsweise durch Immunodetektion oder Massenspektrometrie, je nach den Anforderungen des Forschenden.