Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern die Erfassung, Trennung und Analyse nativer Proteinkomplexe zu ermöglichen, die mit Hilfe der Polyacrylamid-Gelelektrophorese aus Gewebelysaten extrahiert werden. Diese Methode kann Forschern bei der Untersuchung von Proteinen helfen, da sie in der Lage ist, ansonsten labile Proteinassoziationen unter nahezu nativen Bedingungen zu stabilisieren und so deren Identifizierung und anschließende Analyse zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gängige biologische Methoden verwendet, so dass sie breit anwendbar ist und auf die Ziele des einzelnen Forschers zugeschnitten werden kann.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie sich auf die Elektrophorese des blauen nativen Polyacrylamid-Gels vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Verbinden Sie die Elektroden mit der Stromversorgung und elektrophoresieren Sie die Proteine im Gel bei 150 Volt, bis die Farbstoffbande etwa zwei Zentimeter in die auflösende Schicht vordringt. Stoppen Sie an dieser Stelle die Stromversorgung und trennen Sie sie.

Trennen Sie nach der Demontage des Elektrophoresegeräts die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht. Schneide das Gel vorsichtig knapp unterhalb der unteren Kante der Färbefront ab und achte darauf, dass dieser Schnitt so glatt und gerade wie möglich ist.

Entsorgen Sie dann das unbenutzte Stück Gel. Schneiden Sie alle unbenutzten Teile entlang der Ränder des Gelstreifens ab. Legen Sie den Streifen vorsichtig in 10 Milliliter Phosoprat gepufferte Kochsalzlösung in einen kleinen Behälter und mischen Sie ihn vorsichtig 30 Minuten lang, um ihn auszugleichen.

Nach der Äquilibrierung das PBS verwerfen und durch weitere 10 Milliliter ersetzen. Pipettieren Sie 500 Mikroliter 25 Millimolar DSP, gelöst in Dimethylsulfoxid, in das PBS und mischen Sie 30 Minuten lang wie zuvor weiter. Gießen Sie nach 30 Minuten die DSP-Lösung ab.

Bei 10 Millilitern 0,375 molaren HSCL, pH 8,8, enthält 2% Natriumdodecylsulfat, um das nicht umgesetzte DSP zu löschen. Setzen Sie die Notation 15 Minuten lang fort. Während der Gelstreifen abschreckt, bereiten Sie SDS-PAGE-Gellösungen nach Standardmethoden vor.

Fügen Sie die Polymerisationsreagenzien nicht hinzu. Nach dem Abschrecken wird der blaue native Gelstreifen wieder auf Raumtemperatur gebracht und in eine neue Gelkassette gegossen. Nehmen Sie dazu das Gel vorsichtig auf und legen Sie es auf eine saubere Gelkassetten-Abstandsplatte.

Richten Sie den Streifen so aus, dass er von seiner vorherigen Ausrichtung umgedreht wird und die Unterseite der Farbfront der Oberseite der neuen Kassette am nächsten ist. Platzieren Sie den Streifen so, dass seine Oberkante auf einer Höhe der Oberkante der Abdeckplatte liegt. Achte darauf, dass die Vorderseite des Farbstoffs parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte verläuft.

Schieben Sie eine Seite des herausgeschnittenen Streifens gegen eine der Abstandshalterwände, so dass auf der anderen Seite Platz für das Gel zum Gießen und zum Laden eines Proteinstandards oder einer Leiter bleibt. Wenn die Unterkante des Gelstreifens gezackte oder unebene Stellen enthält, schneiden Sie diese vorsichtig ab. Sobald der Gelstreifen richtig positioniert ist, legen Sie die Abdeckplatte über die Distanzplatte.

Üben Sie sanften Druck aus, um eingeschlossene Luftblasen herauszudrücken. Fahren Sie mit dem Zusammenbau des Gel-Pouring-Geräts gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Der Gelstreifen verschiebt sich manchmal, wenn die obere Platte platziert wird.

Es hilft, den Streifen ein wenig über den Rand der oberen Platte hängen zu lassen, damit er mit einem Spatel angepasst werden kann, um eventuelle Verschiebungen zu korrigieren. Geben Sie Polymerisationsreagenzien zu dem auflösenden Gelpuffer und gießen Sie sie mit einer serologischen Pipette in die vorbereitete Gelkassette. Füllen Sie die Gelkassette bis zu etwa zwei Zentimetern unter den ausgeschnittenen blauen nativen PAGE-Gelstreifen, um Platz für die Stapelschicht zu lassen.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Butanol über das gegossene Gel und lassen Sie 30 Minuten für die Polymerisation der auflösenden Schicht warten, bevor Sie das Butanol abgießen. Geben Sie anschließend die Polymerisationsreagenzien in die Stapelgellösung. Gießen Sie die Stapelschicht mit einer serologischen Pipette ein, um den verbleibenden leeren Raum in der Gelkassette zu füllen.

Kippen Sie die Gelkassette, während die Stapelschicht gegossen wird, so dass sie den Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt und keine Luftblasen eingeschlossen werden. Während der Stapelgelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt, bringen Sie die Gelkassette nach und nach wieder auf einen ebenen Boden. Füllen Sie den leeren Raum neben dem herausgeschnittenen Gelstreifen weiter mit dem Stapelgelpuffer, bis er fast überläuft.

Lassen Sie dann die Stapelschicht 30 Minuten lang polymerisieren. Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, nehmen Sie die Gelkassette aus der Ausgießvorrichtung, spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab und montieren Sie die Elektrophoresevorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie die Innenkammer vollständig mit 1x SDS-PAGE Laufpuffer.

Füllen Sie dann die äußere Kammer bis zu dem vom Hersteller angegebenen Füllstand. Beladen Sie den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einer Molekulargewichtsleiter oder dem entsprechenden Proteinstandard. Schließen Sie die Elektroden an das Netzteil an und elektrophoresieren Sie die Proben bei 120 Volt.

Wenn der Coomassie-Farbstoff vom Gel abläuft, stoppen Sie den Lauf und trennen Sie die Stromversorgung. Analysieren Sie das Gel mit Standardmethoden des Elektroblottings und des Antikörper-basierten Proteinnachweises. Die Validierung von Multimer-PAGE wird hier mittels Immunoblot gezeigt.

Der eingefangene Kinesin-Komplex wird durch Diphyo-3-itol gespalten, was zeigt, dass die hochmolekularen Aggregate durch Vernetzung kleinerer Substituenten gebildet werden. Die hier dargestellten Hirnlysate, die mit steigenden Konzentrationen von SDS oder Triton behandelt wurden, erhöhten den Nachweis von monomerem Alpha-Synuclein, während sie den Nachweis des löslichen Oligomer-Tetromers verringerten. Hier werden repräsentative Ergebnisse von Multimer-PAGE gezeigt, die zur Erfassung löslicher Komplexe im Gehirnlysat von Ratten verwendet werden.

Die Proteine wurden mittels Immunoblot nachgewiesen. Das erwartete monomere Gewicht jedes Proteins ist unter den Spuren dargestellt. In ähnlicher Weise wird hier die Erfassung von membrangebundenen Komplexen gezeigt.

Multimer-PAGE gelingt es gelegentlich nicht, einen Komplex zu erfassen, wie auf dem SDHA-Atmungskomplex zwei Blots zu sehen ist. Eine Diskussion möglicher Erklärungen dafür findet sich im Textprotokoll. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine In-Gel-Vernetzung von nativen Proteinkomplexen durchführen, gefolgt von einem erneuten Gelguss und einer Trennung durch sekundäre SDS-PAGE. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid äußerst gefährlich sein kann und beim Gießen des Gels persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollte. Nach diesem Verfahren können die getrennten stabilisierten Komplexe aus dem Gel eluiert oder geschnitten und mit vielen Mitteln analysiert werden, einschließlich Immundetektion oder Massenspektrometrie, je nach den Bedürfnissen des Forschers.