Name: Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Analyse immunologischer Synapsen zwischen menschlichen T-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen mittels Imaging-Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Bewertung zahlreicher Zellbilder für die Immunforschung.

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Die Arbeit wurde Nein vom deutschen Forschungsrat (DFG) mit Zuschüssen finanziert SFB-938-M und SA 393/3-4.

1. Vorbereitung des Pan-Leukozyten
<ol><li>Ziehen Sie 1 mL peripherem Blut von einem gesunden Spender (oder Patienten) in einer heparinisierten Spritze. Achten Sie darauf, die Zustimmung der zuständigen Ethikkommission für die Blutspende haben.</li>
	<li>Mix 1 mL der menschlichen peripheren Blut mit 30 mL ACK Lyse Puffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3und 0, 1 mM EDTA, pH 7,0) in einem 50 mL-Tube und 8 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Füllen Sie die Rohre mit PBS und Zentrifuge bei 300 X g für 6 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in 30 mL ACK Lyse Puffer.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3, bis der Überstand klar ist. Schließlich waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, Zentrifuge bei 300 X g für 6 min. bei Raumtemperatur und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 60 min.</li>
</ol>2. Laden der Raji Zellen mit SEB
<ol><li>Bereiten Sie zwei 15 mL Falcon Röhren mit 1,5 x 106 Raji Zellen pro Röhre. Spin-down der Zellen (300 X g für 6 min bei Raumtemperatur) und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in passives Medium (ca. 50 – 100 µL), fügen Sie 1,9 µL (1,9 µG) SEB, Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. Add 5 mL Kulturmedium, spin-down der Zellen (300 X g für 6 min bei Raumtemperatur) und das Pellet in Kulturmedium (RPMI Aufschwemmen 1640 + 10 % FCS) bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/mL.</li>
</ol>(3) Induktion von immun Synapsen und Färbeprotokoll
<ol><li>Die Vorbereitung der SEB geladen Raji Zellen in ein FACS-Rohr und 500 µL der Vorbereitung des unbelasteten Raji Zellen in einer anderen FACS Rohr 500 µL Pipette. Jedes Rohr und Spin-down der Zellen (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) 650 µL der Pan-Leukozyten hinzufügen. Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 150 µL Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS). Inkubation bei 37 ° C (in der Regel für 45 min).</li>
	<li>Sanft Wirbel der Zellen (10 s bei 1.000 u/min) und 1,5 mL Paraformaldehyd (1,5 %) während der Wirbel um die Zellen zu beheben. Stoppen Sie die Fixierung durch Zugabe von 1 mL PBS + 1 % BSA. Pellet-Zellen (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur und Wiederfreisetzung Zelle Pellet in 1 mL PBS + 1 % BSA nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.</li>
	<li>Pellet (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin für 15 min bei Raumtemperatur die Zellen permeabilize (96-Well-Platte, U-Form).</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin mit Zentrifugation (300 X g für 10 min bei Raumtemperatur) und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin enthalten Fluorophor radioaktiv markierten Antikörper oder Verbindungen (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1: 150) und DAPI (1:3 000)).</li>
	<li>Inkubieren Sie den Zellen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min. Waschen die Zellen 3 Mal durch Zugabe von 1 mL PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Re-Zellen in 60 µL PBS für bildgebende Durchflusszytometrie aufzuwirbeln.</li>
</ol>4. mit einem Durchflusszytometer Bildaufnahme
Hinweis: Das folgende Bild Erwerb Verfahren und Datenanalyse basieren auf imaging Durchflusszytometrie mit einer Software wie Imagestream (IS100), INSPIRE und Ideen. Jedoch kann auch andere fließen Cytometers und Analyse-Software verwendet werden.
<ol><li>Öffnen Sie die Analyse-Software auf dem Computer angeschlossen, der bildgebenden Durchflusszytometer und initialisieren Fluidics des Menüs "Instrument" anklicken. Tragen Sie die Perlen auf den richtigen Anschluss, wenn Sie dazu aufgefordert werden.</li>
	<li>Laden Sie die Standardvorlage aus dem Menü "Datei" und klicken Sie auf Run/Setup. Wählen Sie Perlen aus dem Dropdown-Menü "Ansicht".</li>
	<li>Anpassen der Hellfeld Beleuchtung durch Anklicken Intensität eingestellt, wenn der angezeigte Wert unter 200 liegt.</li>
	<li>Führen Sie die Kalibrierung und testen Sie Routine in der Registerkarte "Assist" zu, indem Sie auf alle starten.</li>
	<li>Klicken Sie auf Flush/Lock/Load und wenden Sie die Proben in den linken Anschluss wenn dazu aufgefordert werden. Nach dem Laden der Zellen in das Durchflusszytometer, öffnen der Zelle Sichter und passen Sie die Werte wie folgt: Peak Intensität Obergrenze bei 1.022 für jeden Kanal, Peak Intensität Untergrenze bei 50 für Kanal 2 (DAPI) und Kanal 5 (CD3-Pe-TxR) Bereich Untergrenze bei 50 für Kanal 1 (Side Scatter) und die Obergrenze bei 1500.</li>
	<li>Ändern Sie die Erregung Laserleistung auf 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), und 647 nm (90 mW) in der Registerkarte "Setup".</li>
	<li>Wechseln Sie die Ansicht Dropdown-Menü zwischen Zellen und Perlen, die Zelle Sichter und Laser macht Anpassungen zu bewerten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen und Zellen Paare der Zelle-Ansicht befinden und Zelle Klumpen, Schutt und Bilder mit gesättigten Pixel in der Trümmer gefunden werden, durch eine Änderung der Zelle Klassifikatoren und/oder die Erregung Laserleistungen.</li>
	<li>Definieren der Probenname und der Menge an Bildern zu erwerben (15.000 – 25.000 für Proben) und 500 für Entschädigung Steuerelemente in die Registerkarte "Setup" klicken Sie auf Run/Setup um die Übernahme zu starten.</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Übertragen Sie die raw-Bilddateien (.rif) auf der Daten-Analyse-Computer, und öffnen Sie die Analysesoftware.</li>
	<li>Eine Vergütungsmatrix nach den Anweisungen der Entschädigung Dropdownliste zu produzieren. Speichern Sie die Vergütungsmatrix als comp_Date.ctm.</li>
	<li>Öffnen einer Beispieldatei raw-Bild (.rif) und der comp_Date.ctm im Fenster, das angezeigt wird, die kompensierte Bilddateien (.cif) und die Standard-Daten-Analyse-Datei (haben.DAF) zu produzieren.</li>
	<li>Kompensierten Image-Datei zu öffnen. Konvertieren Sie die Bilder in Farbmodus und passen Sie die Lookup-Tabellen um optimale sichtbaren Farben in der Symbolleiste Bild Galerie Eigenschaften zu erhalten. Erhalten Sie ein RGB-fusionierte Bild Composite auf der Registerkarte der Galerie Bildeigenschaften Symbolleiste.</li>
	<li>
Öffnen Sie die Maske-Manager aus der Dropdown-Liste Analyse. Erstellen Sie Masken, die T-Zellen und immun Synapse, wie folgt zu bestimmen:
	<ol>
<li>Wählen Sie die T-Zell-Maske: "(Fill (Threshold_Ch05, 60)." Wählen Sie die Tal-Maske: "Valley(Ch02,3)." Wählen Sie die T-Zell-Synapse-Maske: "T-Zell-Maske und Tal (M02, Ch02, 3)."</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Öffnen Sie den Feature-Manager aus der Dropdown-Liste Analyse. Berechnen Sie die folgenden Funktionen:
	<ol>
<li>Wählen Sie für den gesamten CD3 Ausdruck in T-Zellen "Intensity_T-cells_Ch5." Wählen Sie für den Gesamtbetrag der F-Aktin in den T-Zellen "Intensity_T-cells_Ch6." Wählen Sie für CD3 Ausdruck in der immun Synapse "Intensity_T-Cell synapse_Ch5." Für den Betrag von F-Aktin in der immun Synapse wählen Sie "Intensity_T-Cell synapse_Ch6."</li>
		<li>Um die T-Zell-Fläche zu berechnen, wählen Sie "Area_T-Zellen." Um die T-Zell-immun Synapse-Fläche zu berechnen, wählen Sie "Area_T-Zelle Synapse."</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die F-Aktin und CD3 Bereicherung in der immun Synapse mithilfe der Gleichung in der Feature-Manager: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg">
</li>
	<li>
Gelten die folgende gating Strategie mithilfe Histogramme und Dot Grundstücke aus dem Analyse-Bereich (für weitere Details, siehe Referenzen 17 und 19):
	<ol>
<li>Entsorgen Sie Out-of-Focus Zellen durch Plotten "Gradient RMS_M2_Ch2" in einem Histogramm; setzen Sie den Schwellenwert um 15 Uhr.</li>
		<li>Der SSC versus CD3 Intensität in einem Dot Plot Plot. Legen Sie ein Tor auf CD3-positiven Ereignisse.</li>
		<li>Plot der "Seitenverhältnis" M02 (DAPI Fleck) im Vergleich zu dem Gebiet der M02 (Dapi Fleck). Tor auf T-Zell-Unterhemden und Zelle Paare entsprechend. Korrigieren Sie für echte Zelle Paare mit dem Bereich der Synapse Maske, wie zuvor beschrieben17,19.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Höhe der F-Aktin in Unterhemden T-Zellen und T-Zellen der T-Zelle/APC Paare und die Prozent der F-Aktin in der immun Synapse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
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<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
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<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
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<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellten Workflow ermöglicht die Quantifizierung der immun Synapsen zwischen menschlichen T-Zellen (ex Vivo) und APCs. Vor allem dienten die Erythrozyten lysiert Pan-Leukozyten als T-Zell-Quellen, T-Zell-Reinigungsschritte entbehrlich machen. Die B-Zell-Lymphom-Zell-Linie diente Raji als Surrogat APCs. Dies birgt erhebliche Vorteile, da es Vergleiche zwischen Blutspender von der T-Zell-Seite der immun Synapse ermöglicht. Darüber hinaus sind autologe DCs kaum direkt von peripheren Menschenblut. Die Produktio...

T-Zellen sind wichtige Regulatoren des adaptiven Immunsystems und Aktivierung durch Antigene Peptide, die im Zusammenhang mit der großen Histocompatibility komplexe (MHC) dargestellt werden. Vollständige T-Zell-Aktivierung erfordert zwei Signale, die Kompetenz-Signal über die Antigen-spezifische T-Zell-Rezeptor (TCR) / CD3-komplex und das costimulatory Signal über Zubehör-Rezeptoren. Beide Signale entstehen durch die direkte Interaktion der T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). Reife APCs bieten das Kompetenz-Signal für die T-Zell-Aktivierung durch MHC-Peptid-komplexe, und sie drücken costimulatory Liganden (z. B., CD80 und CD86) um das Fortschreiten der T-Zell-Aktivierung-1zu gewährleisten. Eine wichtige Aufgabe der Costimulation ist die Umstellung von Aktin Cytoskelett2,3,4. Die kortikalen F-Aktin ist relativ statisch im ruhenden T-Zellen. T-Zell-Stimulation durch Antigen-Lager APCs führt zu eine tiefgreifende Neuordnung des Aktin-Zytoskeletts. Aktin Dynamik (d. h., schnell Aktin Polymerisation/Depolymerisation Kreise) ermöglichen die T-Zellen, Kräfte zu schaffen, die verwendet werden, um Proteine oder Organellen, zum Beispiel zu transportieren. Darüber hinaus ist das Aktin-Zytoskelett wichtig für die Entwicklung einer spezielle Kontaktzone zwischen T-Zellen und APCs, immun Synapse genannt. Aufgrund der Bedeutung des Aktin-Zytoskeletts zur immun Synapse ist es entscheidend für die Entwicklung von Methoden zur Quantifizierung von Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett T Zellen5,6,7,8 geworden. , 9.
Durch Aktin-Zytoskeletts Hilfe werden Oberflächen Rezeptoren und Signalproteine in supramolekularen Aktivierung Clustern (SMACs) innerhalb der immun Synapse getrennt. Die Stabilität der immun Synapse ist durch die Bindung von Rezeptoren zu F-Actin-Bündel gewährleistet, die die Elastizität des Aktin-Zytoskeletts zu erhöhen. Immun Synapse Bildung hat sich gezeigt, für die Generation der adaptiven Immunantwort kritisch zu sein. Die nachteiligen Auswirkungen einer fehlerhaften immun Synapse-Formation in-vivo wurden zuerst bei Patienten aus Wiskott Aldrich Syndrom (WAS), eine Krankheit, bei welcher Aktin-Polymerisation realisiert und begleitend sind immun Synapse Bildung gestört10 . WAR, dass Patienten leiden können Ekzeme, schweren rezidivierenden Infekten, Autoimmunerkrankungen und Melanome. Trotz dieser Feststellung ist derzeit nicht bekannt, ob immun Synapse Bildung unterscheidet sich in den T-Zellen von gesunden Probanden und Patienten immun Mängel oder Autoimmunerkrankungen leiden.
Höchstauflösung Mikroskopie, Fluoreszenz-Mikroskopie, konfokale einschließlich und TIRF wurden verwendet, um die Architektur der immun Synapse11,12,13,14aufzudecken. Die hohe Auflösung dieser Systeme und die Möglichkeit der Durchführung live Cell Imaging ermöglicht die Sammlung von exakten, räumlich-zeitliche Informationen über dem Aktin-Zytoskelett und Oberfläche oder intrazelluläre Proteine in der immun Synapse. Viele Ergebnisse basieren jedoch auf der Analyse von nur ein paar Dutzend T-Zellen. Darüber hinaus müssen die T-Zellen für diese Art von Fluoreszenzmikroskopie gereinigt werden. Für viele Fragestellungen ist jedoch die Verwendung von ungereinigten Zellen anstatt die höchstmögliche Auflösung von größter Bedeutung. Dies ist relevant, wenn T-Zellen von Patienten analysiert werden, da die Menge des gespendeten Blutes begrenzt ist und möglicherweise die Notwendigkeit, viele Proben parallel zu verarbeiten.
Wir haben mikroskopische Methoden, mit denen die Analyse des Aktin-Zytoskeletts in der immun Synapse im menschlichen System15,16,17. Diese Methoden basieren auf imaging Durchflusszytometrie, auch genannt In Flow-Mikroskopie-18. Als Hybrid zwischen multispektralen Flow-Zytometrie und Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie imaging hat seine Stärken in der Analyse morphologischen Parametern und Protein-Lokalisierung in heterogenen Zellpopulationen wie Pan-Leukozyten aus der peripheren Blut. Wir haben eine Methode, die ermöglicht, F-Aktin in T-Zelle/APC Konjugate von menschlichen T-Zellen aus Vollblut Proben, ohne Zeit- und kostenintensive Reinigung Schritte17quantifizieren eingeführt. Die hier vorgestellten Technik umfasst den gesamten Workflow, davor die Blutprobe auf die Quantifizierung der F-Aktin in der immun Synapse.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Roth</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS Waschsaponin</td><td></td><td>PBS 1% BSA 0,15 Saponin</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Speed Bead</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>Minishaker MS1</td><td>IKA funktioniert</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>Enterotoxin SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Phalloidin-AF647</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>Bildgebendes Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Amnis</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

qualitative und quantitative analyse der immun synapse im menschlichen system mit hilfe von imaging durchflusszytometrie

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Die immun Synapse ist der Bereich der Kommunikation zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). T-Zellen zu polarisieren Oberfläche Rezeptoren und Proteine in Richtung der immun Synapse zu sichern eine stabile Bindung und Austausch zu signalisieren. Klassischen konfokale, TIRF oder Super-Auflösung Mikroskopie verwendet wurden, um die immun Synapse zu studieren. Da diese Methoden manuelle Bilderfassung und zeitraubende Quantifizierung benötigen, ist die Darstellung der seltenen Ereignisse herausfordernd. Hier beschreiben wir einen Workflow, der die morphologische Analyse von Zehntausenden von Zellen ermöglicht. Als APCs sind immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen bei Pan-Leukozyten Vorbereitungen und Staphylococcus Aureus Enterotoxin B SEB geladen Raji Zellen induziert. Bildaufnahme erfolgt mit bildgebenden Durchflusszytometrie, auch genannt In Flow-Mikroskopie, die Eigenschaften von einem Durchflusszytometer und ein Fluoreszenzmikroskop kombiniert. Eine komplette gating Strategie für T-Zell/APC Paare zu identifizieren und zu analysieren die immun Synapsen steht zur Verfügung. Da dieser Workflow ermöglicht die Analyse der immunen Synapsen bei ungereinigten Pan-Leukozyten Vorbereitungen und somit erfordert nur eine kleine Menge Blut (d.h., 1 mL), um Proben von Patienten angewendet werden. Wichtig ist, können parallel mehrere Proben vorbereitet, gemessen, und analysiert werden.

Ein wesentliches Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist die Quantifizierung der Proteinanreicherung (z. B., F-Aktin) in der immun Synapse zwischen surrogate APCs (Raji Zellen) und T-Zellen im ungereinigten Pan-Leukozyten niedrig-Volumen (1 mL) menschlichen Blutproben entnommen. Der Screenshot in Abbildung 1 gibt einen Überblick über die kritischen gating Strategie dieser Methode. Es zeigt die Bildergalerie auf der linken Seite und die Analyse-Bereich auf der ...

Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow für die qualitative und quantitative Analyse von immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Die Methode basiert auf bildgebende Durchflusszytometrie, ermöglicht die Erfassung und Auswertung von mehreren tausend Zelle Bildern innerhalb relativ kurzer Zeit.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im humanen immunologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. wie die Kommunikation zwischen Leukozyten auf molekularer und zellulärer Ebene stattfindet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ungereinigte menschliche T-Zellen ex vivo in relativ kurzer Zeit analysiert werden können. Diesem Verfahren wird Henning Kirchgessner, ein Techniker aus unserem Labor, demonstrieren.Beginnen Sie mit dem Mischen eines Milliliters frisch entnommenen menschlichen peripheren Blutes mit 30 Milliliterack-Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Konustube. Nach acht Minuten bei Raumtemperatur das Rohr mit PBS für eine Zentrifugationswäsche füllen und das Pellet in zwei Milliliterkulturmedium für eine 60-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufhängen. Am Ende der Inkubation fünfmal 10 zum fünften Staphylococcus aureus Enterotoxin B oder SEB-belasteten oder entladenen Raji-Zellen in 500 Mikroliter Kulturmedium in einzelne FACS-Röhren geben, gefolgt von 650 Mikrolitern Pan-Leukozyten.Drehen Sie die Kokulturen herunter und setzen Sie die Pellets in 150 Mikroliter frischem Kulturmedium für eine 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aus. Dann wirbeln die Zellen vorsichtig für 10 Sekunden bei 100 Rpm, während 1,5 Milliliter 1,5% Paraformaldehyd hinzugefügt werden. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Fixierung mit einem Milliliter PBS mit 1%BSA ergänzt und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter PBS plus BSA und 0,1% Saponin wieder auf, und fügen Sie die Zellproben zu zwei einzelnen Bohrungen einer 96-Well-U-Bodenplatte hinzu. Zentrifugieren Sie nach 15 Minuten bei Raumtemperatur die Platte und setzen Sie die Pellets in 50 Mikroliter PBS plus BSA und Saponin wieder auf, die die fluorophorkonjugierten Antikörper oder Verbindungen enthalten, die für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur von Interesse sind. Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in 150 Mikroliter PBS plus BSA und Saponin waschen und die Pellets in 60 Mikroliter PBS wieder aufsetzen.Um die Zellen durch Durchflusszytometrie abzubilden, öffnen Sie die Analysesoftware, überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, und klicken Sie im Menü Instrument auf Start. Klicken Sie als Nächstes auf Laden, und laden Sie die Beispiele in den Port, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Ändern Sie unter der Registerkarte Beleuchtung die Anregungslaserleistung auf die entsprechenden Nanometerlängen.Passen Sie dann die Tore für die Kanäle vier und 11 an, und passen Sie den Bereich für Kanal 1 an. Um die Gating- und Laserleistungseinstellungen auszuwerten, wechseln Sie das Menü Ansicht auf das jeweilige Tor und passen Sie die Tore und Laserkräfte an, bis die Zellen und Zellpaare sichtbar sind. Definieren Sie dann auf der Registerkarte Dateierfassung den Beispielnamen und die Anzahl der zu erfassenden Bilder und das entsprechende Gate für die CD3-Färbung, und klicken Sie auf Acquire, um mit der Erfassung zu beginnen.Um die erfassten Zellbilder zu analysieren, öffnen Sie die entsprechende Analysesoftware. Erstellen Sie gemäß den Anweisungen in der Dropdown-Liste Kompensation eine Kompensationsmatrix und speichern Sie die Matrix als Comp Date ctm. Öffnen Sie als Nächstes eine Beispiel-Rohbilddatei, und wenden Sie die Comp-Datums-CTm im Fenster an, um das kompensierte Bild und die Standarddatenanalysedateien zu generieren.Konvertieren Sie nach dem Öffnen der kompensierten Bilddateien die Bilder in den Farbmodus. Passen Sie die Nachsuchtabellen an, um optimale sichtbare Farben in der Symbolleiste Bildgalerieeigenschaften zu erhalten. Öffnen Sie den Masken-Manager im Menü Analyse, und definieren Sie die T-Zellen, indem Sie eine 60%-Schwellenwertmaske für Kanal 5 auswählen und die Maske füllen, um die T-Zellenmaske zu erstellen.Wählen Sie als Nächstes die Talmaske für Kanal zwei mit einer Breite von drei Pixeln aus, um die Valley-Maske zu erstellen, und kombinieren Sie die T-Zellen- und Talmasken, um die Synapsemaske der T-Zelle zu erstellen. Um den gesamten CD3-Ausdruck in T-Zellen zu berechnen, öffnen Sie den Feature-Manager, und erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zelle, Kanal 5. Um die Gesamtmenge an F-Actin in den T-Zellen zu berechnen, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zellen, Kanal sechs.Um die CD3-Menge in Immunsynapsen zu bewerten, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zell-Synapse, Kanal fünf. Um die Menge an F-Actin in der Immunsynapse zu bestimmen, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zell-Synapse, Kanal sechs. Um schließlich die Anreicherung von F-Actin und CD3 zu definieren, berechnen Sie die Verhältnisse von F-Actin oder CD3 in der Immunsynapse bzw. die Gesamtexpression des ausgewählten Proteins.In diesen Graphen wird ein Überblick über die kritische Gating-Strategie zur Quantifizierung der Proteinanreicherung in der Immunsynapse zwischen den Ersatzantigen-präsentierenden Zellen oder APCs und den T-Zellen in ungereinigten Pan-Leukozyten aus einer geringen Volumen-Humanblutprobe gezeigt. Hier werden repräsentative Bilder von T-Zell-APC-Konjugaten mit niedrigem CD3- und F-Actin-Gehalt in ihren Immunsynapsen in Abwesenheit von SEB gezeigt, während diese T-Zell-APC-Konjugate eine starke CD3- und F-Actin-Anreicherung in Gegenwart von SEB aufweisen. In Ermangelung von Superantigen zeigten 15% der T-Zellen eine Anreicherung von CD3 und F-Aktin an der Immunsynapse, während eine 29%ige Anreicherung in Gegenwart von Superantigen beobachtet wird.In Der Tat, in Abwesenheit von Superantigen, weniger als 20% der gesamten F-Actin in den Zellen an der Immunsynapse ansammelt, mit über 30% an der Synapse in Gegenwart von Superantigen beobachtet. Bemerkenswert ist, dass sich CD3 auch ohne Superantigen an der Immunsynapse ansammelt, obwohl diese Akkumulation auch durch die Zugabe von Superantigen signifikant erhöht wird, was die Eignung dieser Methode zur Quantifizierung der Proteinakkumulation an der T-Zell-APC-Immunsynapse demonstriert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis sieben Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle relevanten Kontrollen einzubeziehen, einschließlich Proben ohne Superantigen, da Proteinanreicherung auch auftritt, wenn APCs ohne SEB verwendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Superauflösungsmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die feine Struktur der Immunsynapse zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der zellulären Kommunikation, um die Immunsynapse beim Menschen für Grundlagenforschung, klinische Studien und translationale Wissenschaft zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die T-Zell-APC-Verbindungszone und die Immunsynapse in menschlichen T-Zellen ex vivo analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Primärmaterialien gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen oder das Arbeiten unter Biosicherheitsstufe zwei Bedingungen immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

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