Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, zu zeigen, wie die klassische Konditionierung durch die Verwendung von Trace Eyeblink, eine Form des assoziativen Lernens, dazu beitragen kann, Hippocampus-Dysfunktion in einem Rattenmodell für fetale Alkoholspektrumstörungen zu erkennen. Neugeborene Rattenbabys werden mit einer hohen Dosis Alkohol, einer Konzentration von 11,9 Volumenprozent Alkohol, in einer Binge-like-Weise herausgefordert. Während des Äquivalents eines dritten Trimesters beim Menschen in Bezug auf das Gehirnwachstum.

Dieses Muster der Alkoholexposition und -dosis sind Schlüsselfaktoren bei der Entstehung von Gehirndefiziten über die Lebensspanne, die Fälle von FASD beim Menschen nachahmen. Eine wichtige Hirnregion, die durch frühe Alkoholexposition beeinträchtigt wird, ist der Hippocampus. Nachdem die Ratten als Erwachsene erwachsen sind, werden sie mit Hilfe der klassischen Konditionierung des Spurenlidschlags auf Hippocampus-Dysfunktion untersucht.

Dabei handelt es sich um eine Form des assoziativen Lernens höherer Ordnung, die auf der Integrität des Hippocampus beruht. In den postnatalen Tagen vier bis neun werden die Jungtiere jeden Morgen gewogen und ihr Gewicht aufgezeichnet. Die Fütterungsmengen werden dann aus einer vorgedruckten Tabelle auf der Grundlage des Körpergewichts ermittelt.

Eine Alkohollösung mit einem Volumen von 11,9 Vol.-% wird den Rattenwelpen über zwei Fütterungen verabreicht, die zwei Stunden voneinander entfernt sind. Die tägliche Gesamtdosis an Alkohol beträgt 5,25 Gramm pro Kilogramm und Tag. Dieses Binge-Exposure-Paradigma liefert 0278 mil Alkohol pro Gramm Körpergewicht pro Fütterung in Milchlösung.

Extrahieren Sie die alkoholhaltige Milch mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze. Drücken Sie dann die überschüssige Lösung heraus, um genau die benötigte Menge zu erhalten. Tauchen Sie die Spitze des PE-10-Rohres in frisches Maisöl.

Dies erleichtert das Einführen. Messen Sie die Länge des PE-10-Schlauchs vom Maul des Welpen bis zum Magen. Stellen Sie bei Bedarf den PE-50-Stopper so ein, dass er als visuelle Anleitung für den Haltepunkt dient.

Führen Sie den PE-10-Schlauch vorsichtig in das Maul des Welpen ein. In der Regel stößt du auf einen gewissen Widerstand, wenn die Spitze auf den Hals trifft. Manövrieren Sie den Schlauch, bis sich die Spitze in den Eingang der Speiseröhre biegt.

Versuchen Sie, die Tube nicht nach hinten rutschen zu lassen, da sie mit dem Öl rutschig sein kann. Fahren Sie in der Speiseröhre nach unten und wenn die Spitze den gastroösophagealen Schließmuskel passiert, gelangt sie in den Magen. Stoppen Sie an dieser Stelle, stabilisieren Sie die Pumpe und geben Sie die Lösung ab.

Dies sollte in einem langsamen Tempo erfolgen. Entfernen Sie vorsichtig den PE-10-Schlauch und untersuchen Sie den Welpen auf Rückspülung von Lösung, Blut oder körperlichen Verletzungen. Ersetzen Sie den Welpen durch seine Wurfgeschwister, wenn es ihm gut geht.

Im schriftlichen Protokoll und in der Materialliste finden Sie die spezifischen Instrumente, die bei der Augenlidoperation verwendet werden. Sterilisieren Sie das Operationsfeld mit einem zugelassenen Desinfektionsmittel und autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien im Voraus. Nachdem Sie bei der Ratte eine angemessene Anästhesie mit Isofluran eingeleitet haben, rasieren Sie ihren Kopf mit einem Fellschneider und legen Sie eine ausreichende Menge Haut für die Inzisionsstelle und das linke Augenlid frei.

Die Haut wird sterilisiert, indem drei abwechselnde Peelings mit 70% Isopropylalkohol und Povidon-Jod durchgeführt werden. Befolgen Sie das Standardverfahren, um die Ratte mit den Ohrstangen an der stereotaktischen Vorrichtung zu befestigen. Fahren Sie mit der Operation fort, wenn die Ratte die richtige Anästhesieebene zeigt.

Verwenden Sie die Skalpellklinge, um einen vorderen hinteren Schnitt an der Mittellinie zu machen. Dieser Schnitt sollte genügend Bereich vor den Augen und etwas hinter der Lambda-Sutorallinie freilegen. Verwenden Sie die Skalpellklinge, um das Periost auf dem Schädel vorsichtig abzukratzen, um keine übermäßigen Blutungen zu verursachen.

Wischen Sie überschüssiges Bindegewebe und Blut mit einem Wattestäbchen ab und spülen Sie den Bereich zwischen den Kratzern mit steriler Kochsalzlösung ab. Bohren Sie ein Loch, das direkt hinter der Kronennaht beginnt, an einem Parietalknochen. Entfernen Sie Blut und Knochenreste mit einem Wattestäbchen.

Verwenden Sie eine Splitterzange, um eine Schraube 0 80 zu greifen. Befestige die Schraube mit einem Juwelierschraubendreher am Loch und ziehe die Schraube gerade so fest an, ohne das kortikale Hirngewebe zu beschädigen, normalerweise drei bis vier volle Umdrehungen. Gehen Sie auf die gleiche Weise vor, um die restlichen Schrauben zu sichern.

Es sollten zwei Schrauben beidseitig hinter der Koronalnaht und eine am rechten Scheitelknochen vor der Lambda-Naht befestigt werden. Fassen Sie die obere Haut an der Schnittstelle des linken Auges mit der vier Zoll langen Verbandszange und richten Sie die drei Zoll lange Verbandszange auf den Augenwinkel. Nehmen Sie eine 26-Gauge-3/8-Zoll-Nadel und führen Sie sie durch den Augenwinkel ein.

Drehen Sie die Nadel so, dass die abgeschrägte Seite nach oben zeigt. Führen Sie die zweite Nadel in der Mitte des Augenlids ein. Fassen Sie mit einer feinen Pinzette einen 3T-Draht und führen Sie ihn in eine der Nadeln ein.

Sie müssen es nicht ganz einführen. Gehen Sie für das zweite 3T-Kabel genauso vor. Fassen Sie beide Nadeln mit einer Hand, während Sie mit der anderen Hand die Kopfbühne greifen.

Ziehen Sie die Nadeln in einer kontinuierlichen Bewegung vom Augenlid weg, während Sie den Kopftisch in die gleiche Richtung führen. Während Sie den EMG-Kopftisch mit einer Hand halten, wickeln Sie mit der anderen Hand die drei Zoll große Abrichtzange um eine oder beide Schrauben auf der rechten Seite. Stecken Sie diesen Draht so weg, dass er nicht aus den Schrauben herausragt.

Der EMG-Kopftisch sollte zentriert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Verwenden Sie die vier Zoll lange Verbandszange, um eine kleine Tasche zu schaffen, indem Sie die Haut, d.h. die oberflächliche Faszie vom Schläfenmuskel, trennen. Wenn die Tasche fertig ist, schneide mit der Irisschere mehr Bindegewebe ab und arbeite dich in Richtung des linken Augenwinkels vor.

Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen oder Blutgefäße zu durchtrennen. Nehmen Sie eine bipolare Elektrode und formen Sie die Drahtleitung so, dass sie entlang der Krümmung des Schläfenmuskels angelegt werden kann. Die beiden Zinken befinden sich hinter dem linken Auge und das untere Ende der bipolaren Elektrode befindet sich gerade auf dem Schädel.

Mischen Sie das Ortho Jet Pulver in flüssige Komponenten, um eine flüssige Konsistenz zu erhalten. Tragen Sie die Paste mit einem Mikrospatel rund um die Inzisionsstelle auf. Achten Sie darauf, keine Paste auf die Augen der Ratte zu tropfen und halten Sie sie in Grenzen.

Lassen Sie den Ortho Jet in einen halbtrockenen Zustand übergehen und verwenden Sie dann die Splitterzange, um überschüssiges Acryl auf dem EMG-Kopftisch zu entfernen. Und die Gewinde der bipolaren Elektrode. Schneiden Sie überschüssigen 3T-Draht ab und lassen Sie einige Zentimeter zur Arbeit.

Entfernen Sie vorsichtig die PTFE-Abschirmung von jedem 3T-Draht mit der Mikropräparierzange. Dadurch können sie Kontakt mit dem Musculus orbicularis oculi aufnehmen. Verwenden Sie die Mikro-Präparierzange, um an jedem Ende der 3T-Drähte Haken zu erstellen.

Schneiden Sie überschüssigen Draht ab und achten Sie darauf, dass er nicht so viel abschneidet, dass sich der restliche Draht wieder in das Augenlid zurückzieht. Die Verkabelung erfolgt im eigenen Haus. Zuerst wird der weiße bipolare Stecker angeschlossen, der die Abgabe des US-Schock-Stimulus ermöglicht.

Anschließend wird der orangefarbene EMG-Kopftischstecker angeschlossen. Es zeichnet die elektromyographische Aktivität auf, während die Ratte blinzelt. Beide Stecker führen zu einem runden Kommutator an der Oberseite des Arms, der die Signalkontinuität aufrechterhält, während sich die Ratte frei bewegt.

Der Stimulus-Isolator wird eingeschaltet und es werden abschließende Hardware-Überprüfungen durchgeführt. Dazu gehört die Anpassung der EMG-Basislinie an einen Pegel, der auf dem Computerbildschirm sichtbar ist. In der ersten Session wird die Schockintensität zunächst auf 4 Milliampere eingestellt und alle zwei Versuche in 4 Mil Ampere erhöht.

Dieses Phasen-in-Verfahren ermöglicht es einer Ratte, sich an den Schockreiz zu gewöhnen. Beim achten Versuch wird die Schockintensität während dieser Sitzung und aller folgenden Sitzungen bei 1,6 Milliampere gehalten. Ein separater Computer steuert ein vierkanaliges digitales Oszilloskop, mit dem wir eine Echtzeit-Signaldiagnose durchführen können.

Beachten Sie den Augenzwinkern, den die Ratte in Box eins ausgestoßen hat. Das Oszilloskop zeigt auch an, dass das Basis-EMG-Signal relativ sauber und rauscharm ist. Webcams ermöglichen es uns auch, jede Ratte zu überwachen.

Dies ist ein Screenshot aus der blink software Version 4.0, der eine Testepoche von 1400 Millisekunden zeigt. In den ersten 280 Millisekunden werden keine Stimuli präsentiert, um ein Maß für die EMG-Aktivität zu Studienbeginn zu erhalten. Die gelbe Linie zeigt den Schwellenwert an, in dem jede EMG-Reaktion, die 4 Volt über dem durchschnittlichen Ausgangswert vor der CS liegt, als Lidschlagreaktion in Frage kommt.

Der Tonbedingungsstimulus von 85 Dezibel wird zum Zeitpunkt von 280 Millisekunden abgegeben. Der Ton bleibt 380 Millisekunden lang eingeschaltet, was dem Zeitpunkt von 660 Millisekunden entspricht. Nach dem Ausschalten gibt es ein 500-Millisekunden-Intervall, in dem keine Reize präsentiert werden. Dies wird als Spurenperiode bezeichnet, in der die Ratte den Versatz des Tones CS mit dem Einsetzen des Schocks US auflösen muss, der noch bei der 1160-Millisekunden-Marke abgegeben werden muss.

Der Schock US hält 100 Millisekunden an. Natürlich löst der Schock US eine defensive Blinzelreaktion aus, die als unkonditionierte Reaktion oder UR bekannt ist und in einem Zeitfenster von 140 Millisekunden gemessen wird. Eine Trainingseinheit besteht aus 100 Versuchen.

Es gibt 90 Studien, in denen CS und US gepaart werden, und bei jedem zehnten Versuch wird nur der CS geliefert. Es gibt 10 CS-Versuche pro Sitzung. Diese Versuche ermöglichen es uns, zu untersuchen, ob wir von der CS US-Assoziation gelernt haben oder nicht.

In Form von Condition Responses oder CRs wird ausgedrückt, wenn der Schock US nicht vorhanden ist. Das Intervall zwischen den Versuchen wird auf 30 Sekunden gemittelt, so dass der Start der einzelnen Versuche nicht vorhersehbar ist. In jedem Versuch kann eine Ratte jederzeit blinzeln und ihr EMG wird von der Software aufgezeichnet.

Jedes diskrete Wimpernzucken, das die Schwellenwertlinie überschreitet, wird als Reaktion in einer von vier Kategorien betrachtet, je nachdem, wann es auftritt und wie lange die Testversion ist. Wenn die Ratte während der ersten 80 Millisekunden nach dem Einsetzen des CS-Tons blinkt, wird die Reaktion als Schreckreaktion oder SR betrachtet. Dies ist eine nicht-assoziative Reaktion, die auf die sensomotorische Leistung hinweist, aber nicht auf das Lernen der CS US-Assoziation an sich. Wenn es nach der SR-Periode, aber vor der Abgabe des Schocks US blinkt, dann hat es eine konditionierte Reaktion ausgesendet.

Wie bereits erwähnt, ist die CR das primäre Maß für assoziatives Lernen. Es wird nicht erwartet, dass sich die CR in den frühen Phasen des Trainings entwickelt, aber wenn das Training über viele Versuche und Sitzungen fortschreitet, werden diese Arten von Reaktionen häufiger, haben eine höhere Amplitude und können zeitlich besser abgestimmt sein. Wir unterteilen CRs in zwei Typen, Gesamt-CRs und adaptive CRs.

Die Gesamt-CRs spiegeln die allgemeine Lernfähigkeit wider, während die adaptiven Crs die Fähigkeit des Tieres widerspiegeln, sein Blinzeln gut zu timen. Unmittelbar vor dem Einsetzen des Schocks beträgt die adaptive CR-Periode 200 Millisekunden vor dem Einsetzen des Schocks in den USA, um sich abzustützen. Bei Säugetieren mit einem intakten Hippocampus spiegelt die Expression adaptiver CRs ein hohes Maß an Beteiligung des Hippocampus an der richtigen Timierung des Blinzelns in Bezug auf die Abgabe der beiden Reize wider.

Es liegt in der Natur der Sache, dass die klassische Konditionierung des Spurenbllinzelns viel schwieriger zu erwerben ist als die klassische Konditionierung des Augenblinzels, bei der sich der Ton CS und der Schock US in der Zeit überlappen. Während die Expression von CRs von Patient zu Patient variieren kann und durch Herausforderungen für diskrete Gehirnschaltkreise stark beeinträchtigt werden kann, wird erwartet, dass der UR während jeder gepaarten CS-US-Studie emittiert wird. Als solches spiegelt dieses Maß die sensomotorische Leistung wider und ist wie Schreckreaktionen kein Hinweis auf das Lernen der CS US-Assoziation an sich.

In der folgenden Serie von Videoclips sehen Sie die Einrichtung der Software und den Start des Augenblinzeltrainings. Die blink-Software wird aktiviert und die beiden zugehörigen Dateien werden rekrutiert. Eine Ratten-Datei mit Probandendaten und die Trace-Eyeblink-Konditionierungsdatei.

Das Programm wird bis zum Beginn der Schulung festgelegt. Wenn das Training beginnt, beachten Sie, dass rechts unten auf dem Bildschirm ein Timer angezeigt wird, der den Countdown bis zur nächsten Prüfung anzeigt. Hier ist eine Live-Videoaufzeichnung der ersten Sitzung, Versuch 15, in der ein UR emittiert wird, sich aber noch keine CRs entwickelt haben.

Hier ist eine Wiederholung mit einem Drittel der Geschwindigkeit. In der folgenden Serie von Clips sehen Sie Screenshots von derselben nicht intubierten Kontrollratte, während sie sechs Trainingseinheiten durchläuft. Er emittiert schließlich sowohl Gesamt-CRs als auch adaptive CRs.

Hier ist ein Live-Videoclip von Sitzung sechs, Versuch 96, in dem zwei Augenblinzeln ausgegeben werden, einer ein adaptiver CR und der andere ein UR. Hier ist eine Wiederholung mit einem Drittel der Geschwindigkeit. In diesem letzten Clip sehen Sie ein Live-Video einer alkoholintubierten Ratte bei ihrem letzten Versuch der sechsten Sitzung, einem reinen CS-Versuch, selbst nach 600 Versuchen des Trainings gibt sie keine adaptive CR zuverlässig ab. Nachdem die Daten gesammelt wurden, werden sie unter Verwendung eines integrierten Fehleralgorithmus zur Erkennung von Ausreißern auf fehlerhafte Versuche untersucht, die aus hohen Rauschartefakten und ungewöhnlichen EMG-Aktivitäten vor der CS-Baseline bestehen.

Gute Studien, die aufbewahrt werden, werden weiter auf SRs, URs, Gesamt-CRs und adaptive CRs in Bezug auf den Prozentsatz der Reaktionen, die Amplitude, die Latenz und andere kritische Messungen analysiert. Mittlere adaptive CRs über sechs Trainingssitzungen werden in diesem ersten Ergebnissatz gezeigt. Sowohl die Prozent- als auch die Amplitudenmessung waren zwischen der alkoholintubierten Gruppe und den beiden Kontrollgruppen von der zweiten bis zur sechsten Sitzung statistisch signifikant.

Dies deutet darauf hin, dass die Häufigkeit und die Stärke adaptiver CRs bei Ratten, die während der frühen Entwicklung Alkohol ausgesetzt waren, beeinträchtigt waren. In dieser zweiten Gruppe von Ergebnissen werden mittlere unbedingte Antworten gezeigt. Sowohl die Häufigkeits- als auch die Amplitudenmaße unterschieden sich statistisch nicht zwischen den Gruppen.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine frühe Alkoholexposition die Fähigkeit der Ratten, auf den unkonditionierten Reiz zu blinzeln, nicht beeinträchtigte, sondern dass die Beeinträchtigung, die sie zeigten, auf ein Versagen bei der richtigen Assoziation von CS und US während des Erwerbs zurückzuführen war. In diesem Experiment untersuchten wir die Verhaltensbeziehung des Gehirns, indem wir bestimmten, ob die entwicklungsbedingte Alkoholexposition, die in einer binge-like Art und Weise verabreicht wird, den Hippocampus beeinflusst, was sich in Defiziten und Spuren der klassischen Konditionierung widerspiegelt. In der Tat ist die klassische Konditionierung mit dem Augenblinzeln ein nützliches Instrument, um die neurologischen Verhaltensfolgen zu beurteilen, die mit Alkoholexposition während der Gehirnentwicklung verbunden sind.

Es ist insofern sehr vielseitig, als durch die Veränderung der Reizparameter oder der assoziativen Lernanforderungen auch die funktionelle Integrität verschiedener Gehirnsysteme außerhalb des Hippocampus beurteilt werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Feinheiten haben, die mit der Verabreichung von Alkohol an neugeborene Rattenwelpen, der Implantation von Elektroden und der Durchführung des Augenblinzeltests verbunden sind. Wir danken Ihnen, dass Sie sich dieses Video angesehen haben.