Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von

Das übergeordnete Ziel dieser diagnostischen Methode besteht darin, Fleisch oder Fleischprodukte zu identifizieren, die mit dem lebensmittelbedingten zoontischen Parasiten Trichinella befallen sind. Diese Methode ist der Goldstandard für den direkten Nachweis von Trichinella-Larven in Fleisch. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie einfach durchzuführen ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da keine internen Kontrollen verwendet werden können und während des gesamten Tests ein strenges Qualitätsmanagement angewendet werden muss. Nora Thaben, eine Technikerin aus meinem Labor, wird die Durchführung des Verfahrens demonstrieren. Hallo! Um eine Muskelprobe für die Verdauung vorzubereiten, geben Sie 100 Gramm der Probe in einen Mixer oder Zerkleinerer.

Und geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Wasser hinzu, um das Vermischen zu erleichtern. Vermischen Sie zwei bis drei Sekunden lang auf höchster Stufe. Öffnen Sie vor dem zweiten Vermischungsvorgang den Mixer und bringen Sie jede Muskelprobe, die sich am oberen Rand des Mixbehälters befindet, nach unten.

Wiederholen Sie das Vermischen und fahren Sie mit kurzen Impulsen von zwei bis drei Sekunden fort, bis keine sichtbaren Fleischstücke mehr vorhanden sind. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens die Verdauungsflüssigkeit in einem Dreiliter-Becher gemäß der schriftlichen Protokollanleitung vor. Überführen Sie einen Liter der vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in einen Kolben.

Überführen Sie das gemahlene Fleisch in das Becherglas und verteilen Sie es mithilfe eines Löffels oder einer Gabel in der Verdauungsflüssigkeit. Spülen Sie den Mixbecher, den Deckel, die Klingen und die Gabel gründlich mit der restlichen Verdauungsflüssigkeit aus.

Stellen Sie das Becherglas auf ein Heizgerät, um eine konstante Temperatur von 44 bis 46 Grad Celsius einzuhalten, während Sie die Temperatur mit einem Thermometer überwachen. Danach decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit 30 Minuten lang, um einen tiefen Wirbel zu erzeugen, ohne dass Spritzer entstehen, bis die Fleischpartikel verschwunden sind.

Nach der Verdauung der Muskelprobe muss die Verdauungsflüssigkeit filtriert und die Menge an unverdautem Gewebe bestimmt werden. Stellen Sie die Waage auf null, wiegen Sie ein sauberes 180-Mikrometer-Sieb ab und notieren Sie dessen Gewicht. Prüfen Sie, ob der Trenntrichter senkrecht ausgerichtet ist.

Um eine gute Sedimentation der Larven zu ermöglichen, sollte die Breite des Trennglas-Trichters nicht größer als 55 % seiner Länge sein. Gießen Sie die Verdauungsflüssigkeit vorsichtig durch das Sieb in den Trennglas-Trichter, wobei ein Überlaufen vermieden werden sollte. Um einen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden, spülen Sie den Glasbecher und das Sieb gründlich mit etwa 200 Milliliter Leitungswasser aus.

Und überführen Sie das Spülwasser in den Trenntrichter aus Glas. Heben Sie das Sieb an und spülen Sie den Bereich unter dem Sieb gründlich mit einer Sprühflasche ab. Das Spülwasser sollte ebenfalls in einem Trenntrichter aus Glas gesammelt werden.

Lassen Sie das Sieb während des gesamten Sedimentationsverfahrens im Trenntrichter zum Trocknen. Um die Sedimentation zu beginnen, stellen Sie die filtrierte Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten in einen Trenntrichter, damit sich die Trichinella-Larven am Boden des Trichters absetzen können. Sobald die Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie den Hahn des Trenntrichters vollständig, um mindestens 20 Milliliter der Verdauungsflüssigkeit schnell in einen Messzylinder ablaufen zu lassen.

Danach den Hahn vollständig in entgegengesetzter Richtung öffnen, um 10 Milliliter Digestionsflüssigkeit durchlaufen zu lassen. Schließlich den Hahn erneut in entgegengesetzter Richtung öffnen, damit weitere 10 Milliliter in den Messzylinder laufen. Die 40 Milliliter Digestionsflüssigkeit 10 Minuten im Zylinder stehen lassen, damit sich die Larven absetzen können.

Fahren Sie fort, um die Menge an undigestedem Gewebe zu bestimmen. Heben Sie das Sieb aus dem Sedimentationstrichter und trocknen Sie es mit einem Papiertuch ab. Subtrahieren Sie das Gewicht des Siebs vor der Filtration vom Gewicht des Siebs mit undigestedem Gewebe.

Der Verdauungsprozess gilt als zufriedenstellend, wenn nicht mehr als 5 % des Ausgangsgewichts der Probe auf dem Sieb verbleiben. Falls die Menge an unverdautem Gewebe 5 % überschreitet, wiederholen Sie den Verdau unter Verwendung frischer Muskelproben. Falls frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen Sie das verbleibende Material erneut.

Nachdem die Verdauungsflüssigkeit 10 Minuten im Zylinder stand, entnehmen Sie 30 Milliliter Überstand durch Absaugen mit einer Pipette, ohne das 10-Milliliter-Sediment zu stören. Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu verringern, geben Sie 30 Milliliter Leitungswasser zum Sediment hinzu und lassen es weitere 10 Minuten stehen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt, bis die Flüssigkeit klar ist.

Sobald die Flüssigkeit klar ist, entfernen Sie den Überstand und überführen die 10 Milliliter gewaschene Sedimentprobe in eine einteilige Petrischale. Spülen Sie den Zylinder mit 10 Milliliter Leitungswasser aus und geben Sie das Wasser zum gewaschenen Sediment hinzu. Unmittelbar nach den Waschschritten untersuchen Sie die Proben mit einem Trichinoskop oder einem Stereomikroskop unter Verwendung einer durchgehenden Lichtquelle mit einstellbarer Intensität unterhalb des Objekttisches.

Untersuchen Sie die Petrischale systematisch, rasternach, bei einer Vergrößerung von 15 bis 20x. Falls keine verdächtigen Strukturen gefunden werden, bewegen Sie die Flüssigkeit in der Schale vorsichtig kreisförmig, um eventuell übersehene Trichinella-Larven in der Mitte der Schale anzureichern. Wiederholen Sie die Untersuchung.

Wenn eine verdächtige Struktur gefunden wird, erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40 bis 100x. Entfernen Sie Trichinella-Larven mit einer Pipette aus der Schale und sammeln Sie sie in einem Behältnis. Nach der vollständigen Untersuchung der gesamten Schale wiederholen Sie den mikroskopischen Untersuchungsvorgang, beginnend mit dem vorsichtigen Schütteln der Schale.

Wiederholen Sie den Vorgang mindestens dreimal oder bis keine Larven mehr gefunden werden. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven pro Gramm Muskelgewebe.

Wenn sich zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit befinden, um die Anzahl der Larven zuverlässig bestimmen zu können, geben Sie die Flüssigkeit mit den Larven in den Messzylinder zurück. Spülen Sie die Schale mit Leitungswasser aus einer Sprühflasche aus und lassen Sie die Larven auf den Boden absinken. Nach einer Sedimentationszeit von 10 Minuten wird die Verdauungsflüssigkeit auf ein definiertes Volumen reduziert, indem die Larven vom Boden des Messzylinders in Ein-Milliliter-Schritten in einen neuen Zylinder übertragen werden.

Suspendieren Sie die Larven durch kräftiges Schütteln homogen in den 10 Millilitern. Während des Schüttelns geben Sie mithilfe der Pipette 12 Tropfen à 20 Mikroliter Larvensuspension auf eine Petrischale. Untersuchen Sie jeden 20-Mikroliter-Tropfen mikroskopisch und berechnen Sie die Gesamtanzahl der Larven, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bevor die mikroskopische Untersuchung von Trichinella-Larven erfolgt, ist es wichtig, jede Probe ausreichend zu waschen, um Ablagerungen zu entfernen, die die Identifizierung der Larven behindern könnten. Trichinella-Larven sind 0,7 bis 1,5 Millimeter lang und ungefähr 0,3 Millimeter breit. Die Speiseröhre ist schmal und hat ein leicht abgerundetes Ende.

Das Stichosom ist eine Struktur in der vorderen Körperhälfte, die aus einem langen, schlanken Tubus besteht, der von einer Reihe von 45 bis 55 großen Zellen umgeben ist. Das Rektum ist ebenfalls rund, ohne Vorsprünge oder Anhänge. Nach der Verdauung kann die Form der infektiösen Muskel-Larven variieren, was die Identifizierung erschwert.

Typische Formen umfassen eng aufgerollte und locker aufgerollte bewegliche Larven, C-förmige oder vollständig entrollte Larven. Neben Trichinella-Larven können nach der Muskeldurchtrümmerung auch andere Strukturen gefunden werden. Beispiele für zufällige Befunde beim Wildschwein sind ein borstenartiges Haar eines Regenwurms, der Trematode Alaria alata, eine Muskel­faser, ein Nematode aus der Gattung Metastrongylus, Pflanzenfaser sowie Larven des Spulwurms Toxocara.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Trichinella-Larven in Fleisch mittels der Magnetrührmethode nachgewiesen werden können, unter Berücksichtigung der wichtigsten kritischen Kontrollpunkte.