Name: Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von Trichinella Larvae in Muskelproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Erfahren Sie das Magnetrührer-Verfahren zum Nachweis von Trichinella-Larven in Muskelproben. Diese Goldstandard-Methode ermöglicht eine zuverlässige Diagnose von Trichinellose in Fleischprodukten.

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Wir danken Sabine Reckinger für exzellente technische Hilfe und Unterstützung.

1. Vorbereitungen <ol><li> Beispielsammlung Hinweis: Der Magnetrührer Verfahren kann für einzelne oder gepoolte Muskelproben verwendet werden. <ol><li> Die Proben aus den entsprechenden Prädilektionsstellen und in einer angemessenen Menge 9. Beachten Sie die länderspezifischen Anforderungen oder den Empfehlungen der IKT, der OIE oder ISO. <ol><li> Für die Europäische Union, zum Beispiel, nehmen Sie eine 1 g Probe aus einem Zwerchfellpfeiler am Übergang zum sehnigen Teil von Hausschweinen. Stellen Sie sicher, dass alle Muskelproben frei von Fett und Bindegewebe sind. </li></ol></li><li> Wenn die Zunge getestet wird, entfernen Sie die Oberflächenschicht vor dem Test. </li><li> Achten Sie darauf , ob die Proben eingefroren werden, da die meisten Trichinenlarven nicht beständig einfrieren und abrollen nach dem Tod, sind weniger resistent gegen die Verdauung und neigen dazu , an den Behälterwänden zu haften, zu einer verringerten Empfindlichkeit des Assays führt. Hinweis: Wenn gefroren, verdoppeln die Stichprobengröße bei lOsten und die Sedimentation Zeit zu erhöhen (siehe unten). </li></ol></li><li> Vorbereitung der Verdauungsflüssigkeit <ol><li> In 25% HCl (16 ± 0,5 ml) auf 2 l Leitungswasser vorgewärmt bei 46 bis 48 ° C in einen 3 L Becherglas. Eine zu niedrige Temperatur führt zu einer unvollständigen Verdauung; zu hohe Temperatur deaktiviert die enzymatischen Eigenschaften von Pepsin. </li><li> Legen Sie einen Rührstab in den Becher, und rühren Sie die Lösung auf eine vorgewärmte Platte (46-48 ° C). </li><li> Werden 10 ± 0,2 g Pepsin (1: 10.000 NF, 1: 12.500, BP, 2.000 FIP) mit der sauren Lösung. Hinweis: Die Qualität des Pepsin ist von größter Bedeutung, und die Enzymaktivität muss vom Hersteller zertifiziert werden. Für Labor Gründen der Sicherheit und der Pepsin Aktivität zu erhalten, wobei die Reihenfolge Verdauungsflüssigkeit Komponenten der Zugabe muss eingehalten werden. </li></ol></li><li> Muskel - Probenvorbereitung <ol><li> Hacken Sie bis zu 100 g Muskelproben in einem Mixer oder Schleifer. Zur Erleichterung der blending, 2 ml für 2 Wasser zu den Proben und mischen bei max Geschwindigkeit vorgewärmt - 3 s. </li><li> Vor der zweiten Mischung, öffnen Sie den Mixer geben und übertragen jede Muskelprobe an der Spitze des Mischschüssel Kantenrand auf den Boden und wiederholen Sie Blending. Weiter mit Ausbrüchen von 2 Mischen - 3 s, bis keine sichtbaren Fleischstücke bleiben. Hinweis: Eine zu geringe Vermischung in unvollständiger Verdauung führen, während zu viel Verschnitt 6 die Trichinella Larven in den Proben vorhandenen beschädigen. </li></ol></li></ol> 2. Verfahren <ol><li> Muscle Probenaufschluss <ol><li> Übertragung 1 L des Verdauungsflüssigkeit in einen Zylinder. Übertragen Sie das Hackfleisch in den Becher und zu verbreiten, in der Verdauungsflüssigkeit mit einem Löffel oder Gabel. Spülen Sie den Mixer Deckel, Messer und Mixer Schüssel mit 500 ml des vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in den 3-Liter-Becher. Hinweis: Unvollständige Spülen in dem Verlust von sens führen kannitivity. </li><li> Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und halten eine konstante Temperatur von 44-46 ° C und Monitor mit einem Thermometer. </li><li> Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten einen tiefen Wirbel ohne Spritzen zu schaffen, bis die Fleischpartikel verschwinden. Je nach der Art des Fleisches getestet (zB Fleisch von Wildtieren), erhöhen die Verdauungszeit bis maximal 60 min. </li></ol></li><li> Filtration und Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Um die Menge der unverdauten Gewebe bestimmen, stellen Sie die Waage auf Null, wiegen das Sieb vor dem Gebrauch, und beachten Sie dessen Gewicht. Das Sieb sollte sauber und frei von irgendwelchen Gewebepartikel sein, die die Trichinenlarven Erreichen des Sedimentationstrichter behindern könnten. Überprüfen Sie, ob die Trennung Trichter vertikal nivelliert. </li><li> Nach der Verdauung, gießen Sie vorsichtig die Verdauungsflüssigkeit durch ein 180 um Sieb in einen Trichter Trennung Glas. Die Breite des Trennglastrichter sollte nicht be größer als 55% der Länge gute Larve Sedimentation zu ermöglichen. Achten Sie darauf, um ein Überlaufen zu vermeiden. </li><li> Um zu vermeiden, Verlust der Empfindlichkeit, gründlich den Glasbecher und das Sieb mit etwa 200 ml Leitungswasser aus einer Spritzflasche und übertragen das Spülwasser in die Sedimentation Glastrichter. Achten Sie sorgfältig die Ränder des 3-Liter-Becher spülen. Heben Sie das Sieb und spülen Sie gründlich die Fläche unter dem Sieb. </li></ol></li><li> Bestimmung von unverdauten Gewebemenge Anmerkung: Aufgrund von Fehlern in der Ausführung des Verfahrens kann Muskelgewebe verbleiben auf dem Sieb als auch Faszie und Bindegewebe, die unverdaulich sind. Die Menge der unverdauten Gewebe wird während der ersten 10 min Sedimentationsschritt (siehe 2.5) bestimmt. Auf diese Weise können etwa 30 Minuten für das Sieb, um zu trocknen, als Restwasser das ermittelte Gewicht des unverdauten Gewebe beeinflussen können. <ol><li> Legen Sie ein Papiertuch auf einer Skala und wiegen das Sieb mit den undigested Gewebe. </li><li> Ziehen Sie das Sieb Gewicht vor der Filtration aus dem Sieb Gewicht mit unverdauten Gewebe. Der Verdauungsvorgang wird als zufriedenstellend angesehen , wenn nicht mehr als 5% des Gewichts der Probe auf dem Sieb bleibt (dh 5 g / 100 g Ausgangsmaterial). </li><li> Wenn die Menge an unverdauten Gewebe 5% übersteigt, wiederholen Sie den Test mit frischen Muskelproben. Wenn das verbleibende Gewebe überwiegend aus unverdauten Muskelgewebe besteht und frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen die unverdaute Reste wieder und zusätzlich zu den Originalproben untersuchen. </li></ol></li><li> Sedimentation des Verdauungsflüssigkeit <ol><li> Halten des gefilterten Verdauungsflüssigkeit in dem Scheidetrichter während 30 min. Wenn in Ruhe gelassen, wird die Trichinenlarven am Boden des Trichters zu begleichen. </li><li> Wenn gefrorene Proben verwendet werden, auf maximal 60 min die Sedimentationszeit erhöhen. </li><li> Sobald Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Hahnmindestens 40 ml der Verdauungsflüssigkeit schnell ablaufen in einen Messzylinder (80 ml, wenn Muskelproben zuvor gefroren gewesen war) des Trenntrichter zu lassen. </li><li> Zunächst wird die Hälfte der Flüssigkeit in den Zylinder lassen und dann vollständig öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung 10 ml der Verdauungsflüssigkeit passieren zu lassen. Schließlich öffnen Sie den Hahn in die entgegengesetzte Richtung für weitere 10 mL. Dieses Verfahren stellt sicher , dass Trichinella - Larven werden in den Hahn nicht eingeschlossen. Hinweis: Eine ausreichende Geschwindigkeit benötigt wird, um Larven zu vermeiden, in dem Scheidetrichter verbleibende, abnehmende Empfindlichkeit. </li></ol></li><li> Sedimentation der Verdauungsflüssigkeit in dem Zylinder <ol><li> Lassen Sie das Sediment in dem Zylinder für 10 min Larven zu ermöglichen, zu sedimentieren. Entfernen Sie 30 ml Überstand mit einer Pipette Absaugen des 10 ml Sediment ohne zu stören. </li><li> Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu reduzieren, 30 ml Leitungswasser auf dem Sediment und lassen für weitere 10 mWiederholen Sie in., Bis die Flüssigkeit klar ist. </li><li> Überstand entfernen und übertragen die 10 ml Sediment zu einem gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken gewaschen. Spülen Sie den Zylinder mit 10 ml Leitungswasser und dann das Wasser auf die Probe hinzufügen. Hinweis: Da große Mengen von Verunreinigungen in der Probe , die die Identifizierung der Trichinenlarven verhindern kann (Abbildung 1), sollten weitere Waschschritte durchgeführt werden, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Mikroskopische Untersuchung <ol><li> Verwenden Sie einen Trichinoskop oder ein Stereo-Mikroskop mit einer Unterstufe Durchlichtquelle mit einstellbarer Intensität bei einer 15 bis 20-facher Vergrößerung, die Proben unmittelbar nach den Waschschritten zu untersuchen. </li><li> Nachdem die Probe in die gerasterten Petrischale gegossen, untersuchen Sie die Schale / Becken systematisch Raster durch Gitter. Wenn keine verdächtigen Strukturen gefunden werden, bewegen sich sanft die Flüssigkeit in der gerasterten Petrischale oder Larvenzählbecken in einer kreisförmigen Art und Weise jede Trichinella la zu ermöglichenrvae, die möglicherweise übersehen wurden, in der Mitte der Petrischale zu akkumulieren. Wiederholen Sie die Prüfung. </li><li> Wenn ein Verdächtiger Struktur gefunden wird, erhöhen Vergrößerung auf 40 - 100X. Entfernen Trichinenlarven aus der Schale / Becken mit einer Pipette und sammeln sich in einem Rohr mit 90% Ethanol. </li><li> Nachdem das komplette Gericht untersucht worden ist, wiederholen Sie den Vorgang, aus dem leichtem Schütteln der Schale / Becken beginnen. Wiederholen Sie das Verfahren mindestens dreimal oder bis keine Larven gefunden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Larven. Korrelieren auf die Menge an Muskelgewebe getestet und Gegenwart als Larven pro Gramm (LPG). </li><li> Wenn zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit sind die Larvenzahl zuverlässig zu bestimmen, kehren die Flüssigkeit die Larven in den Messzylinder enthält, Spülen mit Leitungswasser aus einer Spritzflasche, und lassen Larven auf den Boden absetzen. </li><li> Nach 10 min Sedimentationszeit, reduzieren den Überstand zu einem definierten Volumen (zB10 ml). Um das genaue Volumen, den Überstand in ein neues Zylinder mit einer Pipette bestimmen. </li><li> Suspend Larven homogen in der Flüssigkeit durch kräftiges Schütteln. Während der Schüttelbewegung, fügen Sie 12 Tropfen von 20 &amp; mgr; l Larvensuspension auf eine Petrischale. </li><li> Untersuchen Sie jeden Tropfen unter dem Mikroskop. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven in 240 &amp; mgr; l und löschen Sie den höchsten und den niedrigsten zählen. Extrapolieren die Anzahl der Larven auf das Gesamtvolumen (zB 10 ml) des Überstandes. Hinweis: Die Qualität des Stereomikroskop ist von größter Bedeutung für die Identifikation von Trichinella - Larven. </li><li> Wenn Larven werden in ein Röhrchen mit einer Pipette gesammelt, sorgfältig zu prüfen, dass die Larven nicht an der Pipettenwand kleben haben, sind aber auf das Rohr übertragen. Hinweis: Positive Trichinella Erkenntnisse aus gepoolten Proben aus dem Pool zurückgeführt auf die Karkasse Herkunfts werden müssen. Hier sollte die Poolgröße schrittweise verringert werden, bis die positive Karkasse Iden istzierten. Die Stichprobengröße kann auch während dieses Prozesses erhöht werden Empfindlichkeit zu erhöhen. Bei der Untersuchung einer Sammelprobe ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis wird eine weitere 20-g-Probe von jedem Schwein entnommen. Die 20 g-Proben von fünf Schweinen werden gepoolt und untersucht die beschriebene Methode verwendet. Auf diese Weise Proben aus 20 Gruppen von fünf Schweinen untersucht. Wenn Trichinella in einer Sammelprobe von fünf Schweinen festgestellt wird, 20 g Proben werden von den einzelnen Schweine in der Gruppe gesammelt und jeweils getrennt untersucht , bis die positive Karkasse Ursprungs erkannt wird. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Obwohl die Magnetrührverfahren leicht durchgeführt werden, nicht unbedingt an den technischen Details Einhaltung führt zu einer unzureichenden Empfindlichkeit und damit die Gesundheit der Verbraucher gefährden. Die kritischen Kontrollpunkte wurden im Text oben hervorgehoben. Darüber hinaus ist die Verwendung von geeigneter Ausrüstung entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis des Tests. Alle Schiffe sollten mit Silizium an der Oberfläche das Anhaften von Larven zu reduzieren beschichteten aus Glas und Pipettenspitzen werden. Die Empfindlichkeit des Verdauungsmethode hängt von der Larvendichte in den Muskeln und das Ausmaß der Muskel getesteten Probe. Für einen Larvendichte von 3 bis 5 lpg von Muskelgewebe, wurde eine Empfindlichkeit von 100% angegeben, aber unter 1 lpg sank die Empfindlichkeit auf 40% 13. In Abhängigkeit von den getesteten Wirtstierarten kann die Empfindlichkeit des Tests durch die Erhöhung der Menge der Probe verbessert werden verwendet. Das infection Belastung in Tierwelt ist in der Regel gering, daher größere Proben Größen 14 verwendet. Prädilektionsstellen variieren auch bei den Wirtstieren. Dabei wird die geringere Verdaulichkeit von einigen Muskelgewebe wie die Zunge berücksichtigt werden muss, die auch in größeren Probe führen kann Größen 15. Ferner ist es wichtig, daß der Magnetrührer Verfahren internen Kontrollen nicht enthalten zu verstehen. Daher ist Qualitätsmanagement von der Probenahme bis hin zur Dokumentation wesentlich genaue und präzise Ergebnisse zu erhalten. Die Qualität der Laborleistung zu Trichinenlarven in Muskelproben erkennen sollte durch regelmäßige Teilnahme jedes Analyst in Eignungsprüfungen überwacht werden. Weitere Einschränkungen des Verfahrens sind, dass die endgültige Identifizierung Stufe der Muskellarven unter dem Mikroskop sehr subjektiv ist und heavily abhängig von der Kenntnis der Larvenmorphologie von der Prüfungs Analyst. Eine interessante Alternative Methode, dieses Problem zu umgehen, ist die Magnetrührverfahren / auf Filtertrennung gefolgt von Larven Erfassung durch einen Latex-Agglutinationstest. Doch nach EU - Gesetzgebung wird diese Methode nur dann als gleichwertig betrachtet für die Prüfung von Fleisch von Hausschweinen , aber nicht für Tiere , die 4 ein höheres Risiko einer Infektion wie Wildschweine sind. Die Identifizierung des Larven Antigen mit monoklonalen Antikörpern , macht den Test Ziel, bestreitet aber das Labor die Möglichkeit , 16 , um die Anzahl der Larven pro Gramm Fleisch zu bestimmen. Weitere Variationen des Magnetrührverfahren umfassen die mechanisch unterstützt Verdauung von Sammelproben-Methode / Sedimentation Technik, die mechanisch unterstützte Sammelprobe digestion Verfahren / auf Filterisolationstechnik und die automatische Verdauungsverfahren für Sammelproben von bis zu 35 g Technik. Diese Verfahren basieren alle auf der künstlichen Verdauung des Fleisches und die Visualisierung und Zählen von Trichinella Larven, unterscheiden sich aber in der Ausrüstung für die Filtration und Sedimentation Schritte verwendet. Die isolierte Larven können weiter auf Artenebene durch einen molekularen Test (zB Multiplex - PCR) 17 identifiziert werden. Nach der EU - Gesetzgebung, alle positiven Proben müssen an das nationale Referenzlabor oder auf EURLP für die Trichinenart Bestimmung weitergeleitet werden.

Nematoden der Gattung Trichinella in gestreifter Muskeln von carnivore und omnivore Säugetiere, Vögel und Reptilien weltweit nachgewiesen werden. Diese Zoonose-Nematoden können Menschen erreichen, wenn roh oder halb rohes Fleisch und Fleischprodukte aus Schwein, Pferd und Wildtiere aufgenommen werden. Diese Zoonose kann eine ernsthafte Erkrankung des Menschen durch pathognomonische Anzeichen und Symptome, zum Beispiel Durchfall, Fieber, periorbitales Ödem und Myalgie und mögliche Komplikationen wie Myokarditis, thromboembolischen Erkrankungen und Enzephalitis 1 gekennzeichnet sein. Trichinella spiralis ist die am weitesten verbreitete Erreger der Trichinella - Infektion bei Wild- und Haustieren und bewirkt , dass die meisten der Infektionen beim Menschen weltweit. In Europa, Nord- und Westafrika und Westasien, ist Trichinella britovi eine weitere Quelle von Infektionen beim Menschen. Zusätzlich sind zehn anderen Taxa weniger häufig als verursachendes berichtet<html> Agenten der Krankheit beim Menschen und sind in verschiedenen Regionen der Welt, in der Regel bei Wildtieren 2 gefunden. Neben Wildtiere wie Wildschweine, Bären, Walrosse und Dachse, stellt Schweinefleisch die wichtigste Quelle für eine Infektion beim Menschen weltweit. Der beste Weg , Trichinellose zu verhindern , ist durch den Verzehr von rohen Fleischprodukten zu verzichten und kein Fleisch zu kochen, vor allem Wildfleisch zu sicheren Temperaturen (&gt; 65 ° C für 1 min, das heißt , um die Fleischfarbe in den Kern des zu braun aus rosa ändern Fleischprodukt) 3. Die Europäische Union und USDA haben Einfrieren und Garzeiten und Temperaturen für Schweinefleisch - Produkte angegeben , die verwendet werden können , um T. spiralis Larven in Fleisch 4, 5 töten. Darüber hinaus Empfehlungen für die Inaktivierung von Trichinen in Fleisch und Fleischwaren wurden von der Internationalen Kommission für Trichinellose veröffentlicht&quot;xref&quot;&gt; 6. In Europa, zusätzlich zu der Einführung von kontrollierten Bedingungen in kommerziellen Schweineherden in denen das Risiko von Trichinen - Infektion vernachlässigbar ist, ist die Prävention von Menschen Trichinellose auf der Basis der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren 4. Für die Ernährungssicherheit, die Verdauung Assays sind die einzigen zuverlässigen Verfahren für den direkten Nachweis von Trichinella - Larven im Fleisch 3, 7. Wenn es auch mehrere Varianten des Verdauungstest sind, ist der Magnetrührer Verfahren der international akzeptierten Referenzverfahren 3, 4, 7. Dieser Test basiert auf dem Nachweis von Trichinen Larven in quergestreifter Muskeln. Nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte, Trichinella Larven werden durch Mikroskopie identifiziert. Je nach Handelsverpflichtungen und der nationalen Gesetzgebung, gibt es eine Vielzahl von kleinen Variationen in dem allgemeinen Protokoll des Magnetrührverfahren. Hier werden technische Details basierend auf den Anforderungen der EU 4, ISO - Spezifikationen 8, ICT - Richtlinien 6 und die Erfahrung der Europäischen Union Referenzlabor für Parasites (EURLP) und dem deutschen Referenzlabor für Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Messer, Schere, Pinzette</td><td></td><td></td><td>Schneiden von Proben und Entfernen von unverdaulichem Gewebe</td></tr><tr><td>Mixer</td><td></td><td></td><td>Mit scharfem Hackmesser</td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td></td><td></td><td>Mit thermostatisch geregelter Heizplatte</td></tr><tr><td>Rührstab</td><td></td><td></td><td>Teflonbeschichteter, ca. 5 cm langer</td></tr><tr><td>konischer Glastrenntrichter</td><td></td><td></td><td>Fassungsvermögen von mindestens 2 L, vorzugsweise mit Teflon-Sicherheitsstopfen ausgestattet. Die Breite sollte nicht größer als 55% der Länge sein, um eine gute Sedimentation der Larve zu ermöglichen.</td></tr><tr><td>Ständer, Ringe und Klemmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieb</td><td></td><td></td><td>Maschenweite 180 Mikrometer, Außendurchmesser 11 cm, mit Edelstahlgewebe</td></tr><tr><td>Trichter</td><td></td><td></td><td>Innendurchmesser nicht weniger als 12&nbsp; cm, zur Unterstützung der Siebe</td></tr><tr><td>Glasbecher</td><td></td><td></td><td>Fassungsvermögen 3 L</td></tr><tr><td>Glasmesszylinder</td><td></td><td></td><td>Fassungsvermögen 50 bis 100 mL oder Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td>Mit einer Durchlichtquelle mit einstellbarer Intensität unter dem Untertisch oder einem Trichinoskop mit horizontalem Tisch</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td>9 cm Durchmesser, auf der Unterseite in 10 & x markiert; 10 mm quadratische Untersuchungsflächen mit einem spitzen Instrument oder einem Larvenzählbecken für das Tricinoskop</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td>Alternativ ein Deckel zum Abdecken der Becher</td></tr><tr><td>25%ige Salzsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td></td><td></td><td>Stärke: 1:10.000 NF (US National Formulary) entsprechend 1:12.500 BP (British Pharmacopoeia) und 2.000 FIP (F&eacute; d&eacute; ration internationale de pharmacie) oder stabilisiertes flüssiges Pepsin mit mindestens 660 Einheiten des Europäischen Arzneibuchs/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>70-90 % Ethylalkohol</td></tr><tr><td>Leitungswasser</td><td></td><td></td><td>Erhitzt auf 46-48 μg; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Waage</td><td></td><td></td><td>Genauigkeit auf mindestens 0,1 g</td></tr><tr><td>Metalltablett</td><td></td><td></td><td>Fassungsvermögen 10 bis 15 L, um den restlichen Verdauungssaft aufzufangen</td></tr><tr><td>Pipetten und Pipettenhalter</td><td></td><td></td><td>Verschiedene Größen (1, 10 und 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Auf 0,5 & Grad genau; C, Temperaturbereich mindestens von 20 & Grad; C bis 70&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Siphon</td><td></td><td></td><td>Für Leitungswasser</td></tr></tbody></table>

magnetrührers verfahren zum nachweis von<em&gt; trichinella</em&gt; larvae in muskelproben

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellose ist eine schwächende Krankheit beim Menschen und wird durch den Verzehr von rohen oder ungekochten Fleisch von infizierten Tieren mit der Nematodenlarven der Gattung Trichinella verursacht. Die wichtigsten Quellen von Infektionen beim Menschen weltweit sind Wildfleisch und Schweinefleisch oder Schweinefleischprodukte. In vielen Ländern ist die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis basierend auf der Identifizierung von infizierten Tieren mittels der künstlichen Verdauung von Muskelproben von anfälligen Tierkadavern. Es gibt mehrere Methoden, die auf die Verdauung von Fleisch, aber der Magnetrührer Methode wird als Goldstandard. Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von Trichinen Larven durch Mikroskopie nach der enzymatischen Verdauung von Muskelproben und anschließender Filtration und Sedimentation Schritte. Obwohl dieses Verfahren nicht spezielle und teure Ausrüstung erfordert, können interne Kontrollen nicht verwendet werden. Daher sollten strengen Qualitätsmanagement Applie werdenwährend des gesamten Tests d. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es detaillierte Anweisungen zum Umgang und kritischen Kontrollpunkte des Verfahrens der Analysten zur Verfügung zu stellen, auf der Grundlage der Erfahrungen der Europäischen Union Referenzlabor für Parasiten und das nationale Referenzlabor in Deutschland für Trichinella.

<html> Nach dem Verdau kann die Form des infektiösen Larven Muskel variieren, erschwert Identifizierung. Typische Formen sind eng gewickelten Larven, leicht aufgerollt Larven oder C-förmigen oder vollständig abgewickelte Larven (2B - 2C). Die Anzahl der Larven pro Gramm gefunden kann beträchtlich variieren und von einer Larve zu einigen hundert Larven reichen kann. Die Morphologie der infektiösen Muskel Larve wird in 2A gezeigt. Trichinella Larven sind 0,7 bis 1,5 mm lang und etwa 0,3 mm in der Breite. Die Speiseröhre ist schmal und hat eine leicht abgerundete Ende. Die Nagelhaut ist glatt. In der vorderen Hälfte des Körperhohlraums, der stichosome, die eine Struktur eines langen schlanken Röhre durch eine Reihe von 45 bis 55 große Zellen (stichocytes) umgeben gebildet beobachtet werden. Das Rektum ist auch abgerundet ohne Vorsprünge oder Anhängsel 10, 11. t &quot;&gt; Andere Strukturen, neben Trichinenlarven kann nach Muskel Verdauung gefunden werden Einige Beispiele sind in den 3A gezeigt -.. 3F Wilde Tiere werden oft mit anderen Parasiten oder den Muskelproben zur Verfügung infizierte zum Testen während der Ausweidung Prozess durch belebtes verunreinigt oder unbelebter Strukturen / Organismen. die Länge der Larven, das Aussehen der vorderen und hinteren Enden und das Auftreten der stichosome Hilfe zwischen verschiedenen Nematodengattungen 12 zu unterscheiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die mikroskopische Untersuchung von Trichinenlarven Nach (A) Unzureichende und (B) ausreichend Spülschritte. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">um eine größere ve</a>rsion dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologie der Infektiöse Trichinenlarven Anzeigen der Rektum, Stichosome und Speiseröhren der Larve (A). Mögliche Formen der Muskel Larven nach der Verdauung zeigt (B) eng gewickelten und leicht aufgerollt Larven bewegen und (C) abgespult Larven. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiele für Zufallsbefunde nach der Verdauung von Muskel - Proben mit dem Magnetrührverfahren. (A) borstenartigen HaarenErde Wurm in Wildschwein gefunden; (B) Alaria alata von Wildschweinen; (C) Muskelfaser von Wildschweinen; (D) Metastrongylus sp. von Wildschweinen; Toxocara sp: (E) aus Pflanzenfasern in Wildschwein (F) gefunden. Larve von Wildschwein. Maßstabsbalken zeigen an 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Verhinderung von menschlichen Trichinellosis in vielen Ländern der Welt wird durch Verfahren des Verdaus auf der Laboruntersuchung von Muskelproben von empfänglichen Tieren basiert, von denen der Magnetrührer Verfahren der Goldstandard gilt.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Das übergeordnete Ziel dieser diagnostischen Methode besteht darin, Fleisch oder Fleischprodukte zu identifizieren, die mit dem lebensmittelbedingten zoontischen Parasiten Trichinella befallen sind. Diese Methode ist der Goldstandard für den direkten Nachweis von Trichinella-Larven in Fleisch. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie einfach durchzuführen ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da keine internen Kontrollen verwendet werden können und während des gesamten Tests ein strenges Qualitätsmanagement angewendet werden muss. Nora Thaben, eine Technikerin aus meinem Labor, wird die Durchführung des Verfahrens demonstrieren. Hallo! Um eine Muskelprobe für die Verdauung vorzubereiten, geben Sie 100 Gramm der Probe in einen Mixer oder Zerkleinerer.Und geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Wasser hinzu, um das Vermischen zu erleichtern. Vermischen Sie zwei bis drei Sekunden lang auf höchster Stufe. Öffnen Sie vor dem zweiten Vermischungsvorgang den Mixer und bringen Sie jede Muskelprobe, die sich am oberen Rand des Mixbehälters befindet, nach unten.Wiederholen Sie das Vermischen und fahren Sie mit kurzen Impulsen von zwei bis drei Sekunden fort, bis keine sichtbaren Fleischstücke mehr vorhanden sind. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens die Verdauungsflüssigkeit in einem Dreiliter-Becher gemäß der schriftlichen Protokollanleitung vor. Überführen Sie einen Liter der vorgewärmten Verdauungsflüssigkeit in einen Kolben.Überführen Sie das gemahlene Fleisch in das Becherglas und verteilen Sie es mithilfe eines Löffels oder einer Gabel in der Verdauungsflüssigkeit. Spülen Sie den Mixbecher, den Deckel, die Klingen und die Gabel gründlich mit der restlichen Verdauungsflüssigkeit aus.Stellen Sie das Becherglas auf ein Heizgerät, um eine konstante Temperatur von 44 bis 46 Grad Celsius einzuhalten, während Sie die Temperatur mit einem Thermometer überwachen. Danach decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Rühren Sie die Verdauungsflüssigkeit 30 Minuten lang, um einen tiefen Wirbel zu erzeugen, ohne dass Spritzer entstehen, bis die Fleischpartikel verschwunden sind.Nach der Verdauung der Muskelprobe muss die Verdauungsflüssigkeit filtriert und die Menge an unverdautem Gewebe bestimmt werden. Stellen Sie die Waage auf null, wiegen Sie ein sauberes 180-Mikrometer-Sieb ab und notieren Sie dessen Gewicht. Prüfen Sie, ob der Trenntrichter senkrecht ausgerichtet ist.Um eine gute Sedimentation der Larven zu ermöglichen, sollte die Breite des Trennglas-Trichters nicht größer als 55 % seiner Länge sein. Gießen Sie die Verdauungsflüssigkeit vorsichtig durch das Sieb in den Trennglas-Trichter, wobei ein Überlaufen vermieden werden sollte. Um einen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden, spülen Sie den Glasbecher und das Sieb gründlich mit etwa 200 Milliliter Leitungswasser aus.Und überführen Sie das Spülwasser in den Trenntrichter aus Glas. Heben Sie das Sieb an und spülen Sie den Bereich unter dem Sieb gründlich mit einer Sprühflasche ab. Das Spülwasser sollte ebenfalls in einem Trenntrichter aus Glas gesammelt werden.Lassen Sie das Sieb während des gesamten Sedimentationsverfahrens im Trenntrichter zum Trocknen. Um die Sedimentation zu beginnen, stellen Sie die filtrierte Verdauungsflüssigkeit für 30 Minuten in einen Trenntrichter, damit sich die Trichinella-Larven am Boden des Trichters absetzen können. Sobald die Sedimentation abgeschlossen ist, öffnen Sie den Hahn des Trenntrichters vollständig, um mindestens 20 Milliliter der Verdauungsflüssigkeit schnell in einen Messzylinder ablaufen zu lassen.Danach den Hahn vollständig in entgegengesetzter Richtung öffnen, um 10 Milliliter Digestionsflüssigkeit durchlaufen zu lassen. Schließlich den Hahn erneut in entgegengesetzter Richtung öffnen, damit weitere 10 Milliliter in den Messzylinder laufen. Die 40 Milliliter Digestionsflüssigkeit 10 Minuten im Zylinder stehen lassen, damit sich die Larven absetzen können.Fahren Sie fort, um die Menge an undigestedem Gewebe zu bestimmen. Heben Sie das Sieb aus dem Sedimentationstrichter und trocknen Sie es mit einem Papiertuch ab. Subtrahieren Sie das Gewicht des Siebs vor der Filtration vom Gewicht des Siebs mit undigestedem Gewebe.Der Verdauungsprozess gilt als zufriedenstellend, wenn nicht mehr als 5 % des Ausgangsgewichts der Probe auf dem Sieb verbleiben. Falls die Menge an unverdautem Gewebe 5 % überschreitet, wiederholen Sie den Verdau unter Verwendung frischer Muskelproben. Falls frische Proben nicht verfügbar sind, verdauen Sie das verbleibende Material erneut.Nachdem die Verdauungsflüssigkeit 10 Minuten im Zylinder stand, entnehmen Sie 30 Milliliter Überstand durch Absaugen mit einer Pipette, ohne das 10-Milliliter-Sediment zu stören. Um die Menge an Gewebefasern in der Probe zu verringern, geben Sie 30 Milliliter Leitungswasser zum Sediment hinzu und lassen es weitere 10 Minuten stehen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt, bis die Flüssigkeit klar ist.Sobald die Flüssigkeit klar ist, entfernen Sie den Überstand und überführen die 10 Milliliter gewaschene Sedimentprobe in eine einteilige Petrischale. Spülen Sie den Zylinder mit 10 Milliliter Leitungswasser aus und geben Sie das Wasser zum gewaschenen Sediment hinzu. Unmittelbar nach den Waschschritten untersuchen Sie die Proben mit einem Trichinoskop oder einem Stereomikroskop unter Verwendung einer durchgehenden Lichtquelle mit einstellbarer Intensität unterhalb des Objekttisches.Untersuchen Sie die Petrischale systematisch, rasternach, bei einer Vergr&ouml;&szlig;erung von 15 bis 20x. Falls keine verd&auml;chtigen Strukturen gefunden werden, bewegen Sie die Fl&uuml;ssigkeit in der Schale vorsichtig kreisf&ouml;rmig, um eventuell &uuml;bersehene Trichinella-Larven in der Mitte der Schale anzureichern. Wiederholen Sie die Untersuchung.Wenn eine verdächtige Struktur gefunden wird, erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40 bis 100x. Entfernen Sie Trichinella-Larven mit einer Pipette aus der Schale und sammeln Sie sie in einem Behältnis. Nach der vollständigen Untersuchung der gesamten Schale wiederholen Sie den mikroskopischen Untersuchungsvorgang, beginnend mit dem vorsichtigen Schütteln der Schale.Wiederholen Sie den Vorgang mindestens dreimal oder bis keine Larven mehr gefunden werden. Bestimmen Sie die Anzahl der Larven pro Gramm Muskelgewebe.Wenn sich zu viele Larven in der Verdauungsflüssigkeit befinden, um die Anzahl der Larven zuverlässig bestimmen zu können, geben Sie die Flüssigkeit mit den Larven in den Messzylinder zurück. Spülen Sie die Schale mit Leitungswasser aus einer Sprühflasche aus und lassen Sie die Larven auf den Boden absinken. Nach einer Sedimentationszeit von 10 Minuten wird die Verdauungsflüssigkeit auf ein definiertes Volumen reduziert, indem die Larven vom Boden des Messzylinders in Ein-Milliliter-Schritten in einen neuen Zylinder übertragen werden.Suspendieren Sie die Larven durch kräftiges Schütteln homogen in den 10 Millilitern. Während des Schüttelns geben Sie mithilfe der Pipette 12 Tropfen à 20 Mikroliter Larvensuspension auf eine Petrischale. Untersuchen Sie jeden 20-Mikroliter-Tropfen mikroskopisch und berechnen Sie die Gesamtanzahl der Larven, wie im Textprotokoll beschrieben.Bevor die mikroskopische Untersuchung von Trichinella-Larven erfolgt, ist es wichtig, jede Probe ausreichend zu waschen, um Ablagerungen zu entfernen, die die Identifizierung der Larven behindern könnten. Trichinella-Larven sind 0,7 bis 1,5 Millimeter lang und ungefähr 0,3 Millimeter breit. Die Speiseröhre ist schmal und hat ein leicht abgerundetes Ende.Das Stichosom ist eine Struktur in der vorderen Körperhälfte, die aus einem langen, schlanken Tubus besteht, der von einer Reihe von 45 bis 55 großen Zellen umgeben ist. Das Rektum ist ebenfalls rund, ohne Vorsprünge oder Anhänge. Nach der Verdauung kann die Form der infektiösen Muskel-Larven variieren, was die Identifizierung erschwert.Typische Formen umfassen eng aufgerollte und locker aufgerollte bewegliche Larven, C-förmige oder vollständig entrollte Larven. Neben Trichinella-Larven können nach der Muskeldurchtrümmerung auch andere Strukturen gefunden werden. Beispiele für zufällige Befunde beim Wildschwein sind ein borstenartiges Haar eines Regenwurms, der Trematode Alaria alata, eine Muskel­faser, ein Nematode aus der Gattung Metastrongylus, Pflanzenfaser sowie Larven des Spulwurms Toxocara.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Trichinella-Larven in Fleisch mittels der Magnetrührmethode nachgewiesen werden können, unter Berücksichtigung der wichtigsten kritischen Kontrollpunkte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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