Name: Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Erfahren Sie eine mikrochirurgische Technik zur Injektion von Tumorzellen in die Blinddarmwand von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung zirkulierender Tumorzellen und liefert ein reproduzierbares Modell für die Erforschung von metastasiertem Darmkrebs.

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Diese Arbeit wurde von der deutschen Forschungsstiftung (WE 3548 / 4-1) und der Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) unterstützt.

Die hier vorgestellten Tierversuche wurden unabhängig von einem institutionellen und einem staatlichen Tierpflege- und -nutzungsausschuss unabhängig überprüft und zugelassen und wurden nach den Richtlinien der Föderation der Laboratoriums-Tierwissenschaften (FELASA) durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden ergriffen, um Leiden einschließlich Anästhesie und Analgesie oder, wenn nötig, vorzeitige Sterbehilfe zu minimieren. 1. Vorbereitung von Zellen und Organoiden HINWEIS: Verwenden Sie für jede Injektion ein Volumen von 20 μl mit 100.000 Zellen. Verwenden Sie die Basismembranmatrix (BMM), um Leckagen zu vermeiden und eine standardisierte Injektion zu gewährleisten. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, führen Sie in regelmäßigen Abständen Zelllinien-Authentifizierungsassays ( zB über STR-Profilierung) durch. <ol><li> Vorbereitung von primären Zellsuspensionen aus frischem Gewebe HINWEIS: Immer unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sofortige Übertragung der frischReseziertes Gewebe vom Operationssaal zum Labor auf Eis ist erforderlich, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Das Wohlbefinden und die optimale Behandlung des Patienten müssen immer die erste Priorität sein. Daher müssen Gewebeproben für die Forschung in einer Weise erhalten werden, die die nachfolgende pathologische Aufarbeitung und Inszenierung des resezierten Tumors nicht beeinträchtigt. In den meisten Fällen ist es daher sinnvoll, die Untersuchungsmuster von einem ausgebildeten Pathologen zu erhalten, um eine Nicht-Interferenz mit der pathologischen Diagnose zu gewährleisten. <ol><li> Unmittelbar nach steriler Entfernung aus dem resezierten Exemplar (idealerweise ~ 1 cm 3 ) die Gewebeprobe in ein 50 ml Röhrchen geben, das mit 20-30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorgefüllt ist. Die Röhre auf Eis aufbewahren und sofort ins Labor bringen. </li><li> Setzen Sie das Gewebe in eine Petrischale und waschen Sie es zweimal mit viel PBS, um das übrige Blut zu entfernen. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (~ 2-4 mm) mit einem scaLpel ( zB mit einem # 20 oder # 36 Klinge). </li><li> Benutzen Sie den Dissoziator gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Tumorgewebe weiter zu einer einzelligen Suspension zu dissoziieren. Alternativ verwenden Sie andere Protokolle der enzymatischen Tumorverdauung. </li><li> Zählen Sie die Zellen der resultierenden Einzelzell-Suspension ( z. B. in einem Coulter-Counter oder einem Hämocytometer). </li><li> Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen. </li><li> Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Zelllinien zur Injektion <ol><li> Wachsen Sie alle kolorektalen Krebszelllinien unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) und bereiten sie am Tag der Operation vor. </li><li> Ernte die Zellen nach Standardzellkulturprotokollen, zähle die Zellen ( z. B. in einem Coulter Counter oder einem Hämocytometer) und berechne die ReqBenötigte Menge für alle Injektionen abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Tiere </li><li> Bereiten Sie 3-5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen. </li><li> Zentrifuge (5 min bei 1.500 g) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen. </li><li> Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren. </li></ol></li><li> Organoidvorbereitung HINWEIS: Alle 3D-Organoidkulturen werden unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) angebaut. Detaillierte Protokolle für die Organoidkultur wurden bereits veröffentlicht. 18 , 19 , 20 Ähnlich wie bei herkömmlichen Zelllinien empfehlen wir ein Volumen von 20 μl BMM mit 100.000 Zellen pro Injektion. Die Organoide werden am Tag der Operation wie folgt vorbereitet: <ol><li> Bereiten Sie das folgende Medium vor (im Folgenden:Als DMEM / F12 +++): Fortgeschrittenes Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> 15 ml Röhrchen mit 1 mL DMEM / F12 +++ vorfüllen. </li><li> Die Organoide sorgfältig von der Oberfläche der Kulturplatte abspülen und den Inhalt von 3 bis 5 Vertiefungen in ein 15-ml-Röhrchen überführen. </li><li> Die Organoide vorsichtig in kleinere Stücke zerlegen, indem sie mit einer ausgedehnten Glaspipette auf- und abziehen. </li><li> Füge 5 ml DMEM / F12 +++ zum Röhrchen hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 xg für 5 min. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, das Pellet in 600 μl enzymatischen Dissoziationspuffer resuspendieren und die Suspension auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte überführen. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 1-5 min und dann sorgfältig pipettieren die Suspension auf und ab, um die Organoide aufzulösen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Verdauung über Mikroskop; Es ist komplett, wenn alle Zellcluster dissoziiert sindD zu einzelnen Zellen. </li><li> Nach erfolgreicher Verdauung werden 1,4 ml DMEM / F12 +++ zugegeben, um die Verdauung zu stoppen. Dann alle Vertiefungen von verdauten Organoiden in ein 50-ml-Röhrchen überführen. </li><li> Zähle die Zellen und berechne die benötigte Menge für alle Injektionen. </li><li> Bereiten Sie 3 - 5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen </li><li> Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen. </li><li> Resuspended die Zellen in BMM auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml und halten sie auf Eis. </li></ol></li></ol> 2. Orthotopisches Mausmodell <ol><li> Vorbereitung der Empfänger Tiere für die Chirurgie HINWEIS: Verwenden Sie 6-8 Wochen alte NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) Mäuse als Empfänger. 21 NSG gehören zu den am meisten immunsupprimierten Mäusen, ohne reife B-, T- und NK-Zellen zusammen mit mehreren anderen ImmunenFects 21 Sie wachsen auch bei niedrigen Zellzahlen tödlich und sind anfällig für entfernte Metastasen. NSG-Mäuse sind hervorragende Züchter und können in konventionellen spezifischen pathogenfreien (SPF) Einheiten gehalten werden. <ol><li> Vor dem ersten Einschnitt injizieren Sie 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan. </li><li> Sevofluran bei 3-3,5 Vol .-% zur Vollnarkose verwenden. Ein Verlust des Zehenkolbenreflexes zeigt genügend Anästhesie an. </li><li> Bedecken Sie die Augen der anästhesierten Mäuse mit ophthalmischer Salbe, um die Austrocknung der Hornhaut zu vermeiden. </li><li> Beschränke die Mäuse in einer Rückenlage auf einem kleinen Tisch. </li><li> Rasieren Sie den Bauch mit einem elektrischen Rasierer (Enthaarungscreme kann alternativ verwendet werden) und desinfizieren mit mindestens 3 mal Clorhexidin / Jod und 70% Alkohol alternativ. </li><li> Decken Sie das chirurgische Feld mit sterilen Vorhängen ab. HINWEIS: Die Verwendung von perioperativen Antibiotika ist optional und unterliegt institutionellen Richtlinien. </li></ol></li><li> Mittellinie Laparotomie und Exposition des Zökums <ol><li> Verwenden Sie eine Schere (Skalpelle können alternativ verwendet werden), um eine kleine Mittellinie (3 - 5 mm) der Haut auf dem Unterbauch zu machen. Die Bauchwandmuskulatur mit Pinzette aufnehmen und mit einer Schere sorgfältig einarbeiten und damit die Bauchhöhle öffnen. </li><li> Das Zökum mit atraumatischer Pinzette identifizieren und sorgfältig ausbauen. Positionieren Sie die blinde Endbeutel des Zökums auf dem Bauch, der kranial zeigt. </li><li> Sobald es aussen ist, halten Sie den Cecum feucht mit warmen Kochsalzlösung Tupfer zu allen Zeiten. </li></ol></li><li> Orthotopische Injektion, Verschluss des Bauches und postoperative Erholung <ol><li> Für die intracecale Injektion verwenden Sie eine Standard 1 ml Spritze mit einer 30 G Kanüle. Montieren Sie diese Spritze auf eine Mikroinjektionspumpe, die wiederum auf einem Mikromanipulator montiert ist. </li><li> Füllen Sie die Spitze des Zökels sorgfältig mit atraumatischer Pinzette und glätten Sie sie sanft, indem Sie sie nach hinten streichenD mit einem zweiten Satz von Pinzette angefeuchtet mit warmer Kochsalzlösung. </li><li> Positionieren Sie die Kanüle direkt über dem Zökum. </li><li> Führen Sie die folgenden Schritte unter visueller Kontrolle mit einem binokularen chirurgischen Mikroskop durch. </li><li> Vorsichtig das Zökchen mit zwei atraumatischen Pinzetten an beiden Enden des außen liegenden Teils des Zökels ergreifen, leicht ausdehnen und dann langsam über die Kanüle ziehen, die parallel und direkt oben positioniert ist. Es ist entscheidend, die gesamte Darmwand nicht zu perforieren (also die Zellen in das Lumen einzuspritzen) und die Serosa nicht über den Anfangspunkt der Penetration hinaus zu perforieren, da dies zu einer Leckage und einer peritonealen Verbreitung führen würde. <ol><li> Bewegen Sie den Darm in Richtung der Kanüle, nicht die Kanüle zum Darm. Halten und strecken den Darm zwischen zwei Pinzetten. Die Hände des Chirurgen müssen auf einer Oberfläche ruhen, um das Zittern zu reduzieren. </li></ol></li><li> Injizieren Sie die Zellen zwischen der Serosa (als sehr dünne, lichtdurchlässige Futter über thE intramurale Blutgefäße) und die Muscularis. Die Kanüle muss also visuell oberhalb der Blutgefäße und unterhalb der dünnen lichtdurchlässigen Membran platziert werden. </li><li> Verwenden Sie einen Fußschalter, um die Injektion zu starten, um Tremor zu reduzieren, während sich die Kanüle in der Darmwand befindet. </li><li> Sobald die Kanüle in Position ist, starten Sie die Injektion. Verwenden Sie eine Dauer von 20 s, was zu 1 μL / s Einstellung am Steuergerät der Pumpe führt. HINWEIS: Die Injektion in oder in der Nähe eines beschädigten Blutgefäßes führt zu einer direkten intravaskulären Verbreitung und einer entfernten Metastase und sollte daher vermieden werden. </li><li> Nach Beendigung der Injektion die Kanüle vorsichtig entfernen, indem man sie nach hinten zieht. </li><li> Setzen Sie einen trockenen Tupfer unter den Zökum und gründlich spülen Sie den Zökum mit destilliertem Wasser, um Leckzellen zu lysieren und damit künstliche peritoneale Verbreitung zu verhindern. </li></ol></li><li> Verschluss des Bauches und postoperative Erholung <ol><li> Nach rInsert, sanft das Zökum in die Bauchhöhle zurückgeben. </li><li> Schließen Sie die Bauchwand mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten. </li><li> Schließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundclips. </li><li> Legen Sie die Maus auf eine Heizkarte auf 38 ° C, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat. </li><li> Beobachten Sie den postoperativen Zustand der Mäuse für die folgenden 48 h. Im Falle von Not, mit 0,05 mg / kg Buprenorphin alle 12 h behandeln. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal täglich auf Anzeichen von Not durch Tumorwachstum. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblutproben HINWEIS: Erhalten Sie Blut durch transkutane Herzpunktion auf anästhesierte Mäuse, gefolgt von Euthanasie. Idealerweise werden 1000 μl Blut in eine mit 100 μl eines Antikoagulans (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Heparin) vorgefüllte Spritze gezogen. Verwenden Sie eine Anti-Human-EpCAM (Epithelzell-AdhäsionMolekül) Antikörper zur Identifizierung der CTCs. Dies funktioniert sehr gut, wenn menschliche epitheliale Zelllinien im Mausmodell verwendet werden. Für andere Geräte können unterschiedliche Antikörper erforderlich sein. <ol><li> CTC Anreicherung: <ol><li> 15 ml Röhrchen mit 5 mL Dichtegradientenmedium vorfüllen und das Blut vorsichtig in das 15 mL Röhrchen überführen. </li><li> Zentrifuge (30 min bei 300 xg ohne Bremse) und vorsichtig den oberen Überstand entfernen. </li><li> Gießen Sie den Rest in eine neue 15-ml-Röhre und zentrifugieren Sie (15 min, 300 xg mit Bremse). </li><li> Gewinnen Sie die Zwischenphase, die die mononuklearen Zellen enthält (verwerfen den Rest) und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Das Pellet wird in 200 &amp; mgr; l PBS / 1% EDTA resuspendiert und mit 4 &amp; mgr; l EpCAM-Antikörper versetzt. Inkubieren Sie 20 min auf Eis im Dunkeln. </li></ol></li><li> Screening und Kommissionierung <ol><li> Den folgenden Puffer vorbereiten (im Folgenden als Pufferpuffer bezeichnet): PBS + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA. </li><li> Verwenden Sie einen PAP-Stift, um einen ~ 1 cm-Kreis in einer 6 cm sterilen Petrischale zu ziehen (verhindert das Dispergieren der Flüssigkeit in der Schale) und pipettieren Sie 700 μl Pufferpuffer in diesen Kreis. </li><li> Füge 50 μl Zellsuspension dem 700 μl Picking Puffer innerhalb des Kreises hinzu. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen mit dem Mikroskop. Die Probe in verschiedene Gerichte aufteilen, wenn sie zu dicht ist. </li><li> Warten Sie, bis sich die Zellen absetzen (~ 5 min). </li><li> Schieben Sie den Tropfen der Zellsuspension auf gefärbte (= EpCAM-positive) Zellen. </li><li> Sobald eine Zelle gefunden ist, wählen Sie die Zelle mit dem Mikromanipulator und legen Sie sie in 50 μl Puffer in Abhängigkeit von der beabsichtigten nachgeschalteten Analyse ( zB RNA Extraktionspuffer oder Kultivierungsmedium). </li><li> Abhängig von den beabsichtigten Downstream-Analysen, isolieren EpCAM-negative Zellen und / oder Medium als Negativkontrollen. </li><li> Gehen Sie mit nachgeschalteten Analysen ( zB Zellkultur, PCR) vor. </li></ol></li></ol>

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<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Trotz ihrer präklinisch bewährten Aktivität bei subkutanen Mausmodellen scheitert die große Mehrheit der neuartigen Verbindungen in klinischen Studien und erreicht niemals die Klinik. 11 Diese offensichtliche Insuffizienz von subkutanen Mausmodellen zur genauen Simulation der Biologie und Wachstumsmuster von Tumoren hat zur Entwicklung von orthotopischen Mausmodellen geführt, die auf der Injektion von Tumorzellen direkt in das ursprüngliche Organ basieren. Orthotopisc...

Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten Ursachen für Krebs Tod in den westlichen Ländern. 1 Während der Primärtumor oft reseziert werden kann, verschlechtert das Auftreten von entfernten Metastasen die Prognose drastisch und führt oft zum Tod. 2 , 3 Das biologische Korrelat der Metastase ist zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die sich vom Tumor lösen, im Kreislauf überleben, an das Epithel im Zielorgan anschließen, in das Organ eindringen und schließlich zu neuen Läsionen übergehen. 4 Obwohl CTCs bekanntermaßen von prognostischer Relevanz sind, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 wird ihre Biologie nur teilweise durch ihre extreme Seltenheit im CRC verstanden. 10 Mausmodelle sind ein leistungsfähiges tOol, um verschiedene Aspekte der Krebsbiologie zu studieren. Klassische, subkutane Tumormodelle werden durch subkutane Injektion von Tumorzellen in Empfängermäuse produziert, die entweder immunkompetent sein können (wenn syngene murine Tumorzellen verwendet werden) oder immundefizient sind. Subkutane Tumormodelle sind preiswert und produzieren schnell Daten; Ihr Endpunkt-Tumorwachstum kann leicht und nicht-invasiv gemessen werden. Allerdings scheitern 88% der neuen Verbindungen, die Antitumor-Aktivität in solchen Modellen gezeigt haben, in klinischen Studien. 11 Dies ist zum Teil auf interspezifische Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen zurückzuführen; Allerdings ist ein großer Teil dieses Versagens auf den niedrigen prädiktiven Wert von subkutanen Mausmodellen zurückzuführen. Orthotopische Mausmodelle, bei denen die Tumorzellen in das Herkunftsorgan injiziert und damit in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung wachsen, werden daher zunehmend in der Krebsforschung eingesetzt. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Orthotopische Modelle simulieren nicht nur lokale Tumorwachstumsbedingungen; Als Ergebnis der anatomisch korrekten Ort des Tumorwachstums erlauben orthotopische Mausmodelle auch eine realistische Simulation der Metastasierung und werden daher zur Untersuchung der CTC-Biologie 8 , 15 , 16 oder ihrer Reaktion auf verschiedene Behandlungen im CRC verwendet. 13 , 17 Ein wesentlicher Nachteil von orthotopischen Mausmodellen ist ihre technische Komplexität. Je nach dem Organ, in dem die Zellen injiziert werden sollen, ist die Lernkurve, bis der Experimentator in der Lage ist, reproduzierbare Tumore zu induzieren, ziemlich lang. Dies gilt insbesondere für Darmkrebsmodelle, da die Tumorzellen in die Darmwand injiziert werden müssen, was oft zu Perforationen, Tumorzellleckagen oder endoluminalen Tumorzellverlusten führt. Dies einRtikel soll das Verfahren der Zellpräparation aus primären Gewebeproben, 2D-Zelllinien und 3D-Organoidkultur und deren Injektion in den Cecum von Mäusen beschreiben. Die hier beschriebene Technik führt zu hochgradig einheitlichen Tumoren und in Abhängigkeit von der Tumorbiologie der für die Injektion verwendeten Zelllinie eine reproduzierbare Bildung von entfernten Metastasen und CTCs in den Empfängermäusen. 15

<table><tbody><tr><td>Zellkulturmedien und -komponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ Medium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express enzymatischer Dissoziationspuffer</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran-Matrix (BMM, phenolrotfrei)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%, phenol-rot)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>6-/48-Well-Platten mit Deckel</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturkolben 75 cm&sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche 150 cm&sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Zählobjektträger (für TC20 Zählmaschine)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (Glas, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td> dünn <td>gezogen mit einem Bunsenbrenner</td></tr><tr><td>schonender MACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>für die Präparation von Primärtumorgewebe</td></tr><tr><td>Dissoziationskit für humane Tumore</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>für die Präparation</td></tr> <tr><td>von PrimärtumorgewebeFalcon 70 & Mikro; m Cell</td><td>Strainer Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>für die Präparation von Primärtumorgewebe</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company<</td><td>strong>Katalognummer</strong</td><td>><>Kommentare</td></tr><tr><td>Chirurgische Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevofluran</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co.</td> <td>KG-Medical</td><td></td></tr> <tr><td>oxygen</td><td>Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprenorphin <td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- Augensalbe</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze (ohne Totvolumen) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G Injektionsnadel</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Zellulosetupfer</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzette</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Nadelhalter</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgisch) Naht)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Research Anästhesiegerät mit O2-Spülung und einem Sevofluran-Verdampfer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro Pumpe mit Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope</td></tr><tr><td>Injektion Fußschalter für SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope</td></tr><tr><td>Injektion Dreiachsiger manueller Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope</td></tr><tr><td>Injektion Magnetständer für Mikromanipulatoren</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td>Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope Injektion</td></tr><tr><td>Stahlgrundplatte für M10 Magnetständer</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope</td></tr><tr><td>Injektion Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Haarrasierer</td><td>AESCULAP -</td> <td>Braun-Binokulares</td><td></td></tr> <tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>CTC isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradient mittel &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, &oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Zellkulturmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Aspirationspumpe verbunden mit dem Mikromanipulator</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>benötigt für die Herstellung von Mikrokapillaren für die Einzelzellaspiration</td></tr><tr><td>Prism Glaskapillaren</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>Picking-Puffer</td></tr><tr><td>Fetales Kälberserum (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>Picking-Puffer</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>Picking-Puffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>picking buffer</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Immunhistochemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigter anti-humaner CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM Immunhistochemie (vgl. Abb. 2C)</td></tr><tr><td>HRP Kaninchen Anti-Maus IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM Immunhistochemie (cf, Abb. 2C)</td></tr></tbody></table>

isolierung von zirkulierenden tumorzellen in einem orthotopischen mausmodell des darmkrebses

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben subkutane Mausmodelle schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Verbreitung von Tumorzellen nicht genau. Orthotopische Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in Hohlorganen wie dem Dickdarm. Um einheitliche Tumore zu erzeugen, die zuverlässig wachsen und metastasieren, sind standardisierte Techniken der Tumorzellpräparation und Injektion kritisch. Wir haben ein orthotopisches Mausmodell von Darmkrebs (CRC) entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und für Tumorbiologie-Studien sowie therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Tumorzellen aus Primärtumoren, 2-dimensionalen (2D) Zelllinien oder dreidimensionalen (3D) Organoiden werden in den Cecum injiziert und bilden je nach metastatischem Potential der injizierten Tumorzellen hochmetastatische Tumore. In Ergänzung,CTCs können regelmäßig gefunden werden. Wir beschreiben hier die Technik der Tumorzellpräparation sowohl aus 2D-Zelllinien als auch aus 3D-Organoiden sowie primärem Tumorgewebe, chirurgischen und Injektionstechniken sowie der Isolierung von CTCs aus den tumortragenden Mäusen und präsentieren Tipps zur Fehlersuche.

Die erfolgreiche und reproduzierbare Erzeugung von kolorektalen Tumoren in diesem Modell hängt entscheidend von der genauen Injektion der Zellen ohne Verschütten oder Lecken ab. Wenn dies erreicht wird, ist dieses Modell äußerst zuverlässig und führt selten zu einer künstlichen peritonealen Verbreitung. Die Wachstumskinetik der Tumore sowie deren Verbreitungsmuster hängen von der Biologie der verwendeten Organoide und Zellen ab. 15 Während HCT116-Zellen in diesem ...

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Das übergeordnete Ziel dieser mikrochirurgischen Technik besteht darin, Kolorektalkarzinomzellen in die Zäkumwand zu injizieren, um reproduzierbare und metastasierende Kolorektaltumoren bei Mäusen zu induzieren. Diese Methode kann zentrale Fragen aus dem Bereich der Biologie zirkulierender Tumorzellen beantworten; ihre wichtigsten Vorteile sind die hohe Reproduzierbarkeit und die Gleichmäßigkeit der Tumoren, wodurch eine zuverlässige Vorhersage des Tumorstadiums sowie der zirkulierenden Tumorzellen ermöglicht wird. Beginnen Sie damit, mithilfe atraumatischer Pinzetten vorsichtig das Zäkum einer sechs bis acht Wochen alten immundefizienten Maus zu exponieren.Platzieren Sie das blinde Ende des Zäkums auf dem Abdomen, sodass die Ausstülpung kranial gerichtet ist. Befestigen Sie für die intrazäkale Injektion eine standardmäßige Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Canüle ausgestattet ist und mit den Tumorzellen beladen ist, an einer Mikroinjektionspumpe, die auf einem Mikromanipulator montiert ist. Greifen Sie anschließend mit der atraumatischen Pinzette vorsichtig die Zäkumspitze und glätten Sie das Zäkum mit abwärts gerichteten Strichen unter Verwendung einer zweiten, mit warmer Kochsalzlösung angefeuchteten Pinzette.Bewegen Sie nun das Tier unter ein binokulares Operationsmikroskop und positionieren Sie die Kanüle direkt parallel und oberhalb des Zäkums. Verwenden Sie zwei atraumatische Pinzetten, um das Gewebe an beiden Enden des ausgestülpten Zäkumteils vorsichtig zu dehnen. Ziehen Sie das Zäkum langsam über die Kanüle, achten Sie dabei darauf, die Wand oder die Serosa nicht vollständig zu perforieren, und platzieren Sie die Kanüle oberhalb der Blutgefäße und unterhalb der dünnen, durchscheinenden Membran innerhalb der Wand. Sobald die Kanüle korrekt positioniert ist, injizieren Sie mithilfe eines Fußschalters über einen Zeitraum von 20 Sekunden 20 Mikroliter Zellen.Zwischen der dünnen, durchscheinenden Serosabedeckung, oberhalb der intramuralen Blutgefäße und der Muskulatur. Sobald alle Zellen injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Kanüle und legen einen trockenen Tupfer unter den Blinddarm. Um eine künstliche peritoneale Streuung zu verhindern, lysieren Sie ausgetretene Zellen durch gründliches Spülen mit destilliertem Wasser und bringen Sie den Blinddarm vorsichtig in die Bauchhöhle zurück.Schließen Sie die Bauchdecke mit schnell resorbierbaren Laufnahten und die Haut mit chirurgischen Wundclips. Anschließend wird die Maus auf eine auf 38 Grad Celsius eingestellte Heizmatte gelegt und unter Überwachung bis zur vollständigen Rekumbenz gehalten. Um die zirkulierenden Tumorzellen zu isolieren, füllen Sie bei dem entsprechenden experimentellen Endpunkt 15-Milliliter-Konischröhrchen mit jeweils fünf Millilitern Dichtegradientenmedium und übertragen vorsichtig die aus tumortragenden Tieren gewonnenen Vollblutproben auf die Dichtegradientenschichten.Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und gewinnen Sie vorsichtig die Grenzfläche, die die mononukleären Zellen enthält. Pipettieren Sie die mononukleären Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen für eine zweite Zentrifugation. Anschließend erfolgen Röhrchenwäschen in PBS.Nach der zweiten Wäsche die Pellets in 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit EDTA, erneut suspendieren und vier Mikroliter Anti-AMP-cAMP-Antikörper zu jeder Probe hinzufügen, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation auf Eis im Dunkeln. Verwenden Sie als Nächstes einen hydrophoben Markierstift, um in einer sterilen 6-Zentimeter-Petri-Schale pro Probe einen etwa einen Zentimeter durchmessenden Kreis zu zeichnen, und geben Sie 700 Mikroliter Puffer zum Aufsammeln in jeden Kreis, gefolgt von 50 Mikrolitern Zellsuspension. Überprüfen Sie mithilfe eines Mikroskops die Zelldichte und lassen Sie die Proben etwa fünf Minuten lang sedimentieren.Danach die Zelltropfen auf Amp-cAMP-Positivität screenen und mit dem Mikromanipulator die gewünschten Zellen in 15 Mikroliter geeignetes Puffermedium für die geplante nachgeschaltete Analyse überführen. Die Verwendung von kolorektalen Zellen in diesem Modell führt zuverlässig innerhalb von 35 Tagen nach der Tumorzellinjektion zu einer höheren Anzahl von Mäusen mit Tumoren, wobei die primären Tumoren etwa 10 Millimeter Größe erreichen und Leber- und Lungenmetastasen sowie zirkulierende Tumorzellen nahezu ausnahmslos vorhanden sind. Zudem können die zirkulierenden Tumorzellen problemlos für nachgeschaltete Analysen isoliert werden.Wenn die Technik einmal beherrscht ist und ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann sie innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden und ermöglicht die Bildung uniformer und metastatischer Tumoren, die sowohl für therapeutische als auch für molekulare Untersuchungen genutzt werden können. Zu den Einschränkungen des Modells gehören die Abhängigkeit von Zelllysat, das eigene Limitationen aufweist, sowie die Immundefizienz der Mäuse, die beide durch den Einsatz mutierter kolorektaler Krebszellen überwunden werden können. Aufgrund seiner Einfachheit könnte dieses Modell eine wertvolle Ergänzung zu den derzeit verfügbaren Modellen des kolorektalen Karzinoms darstellen.

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Zwei Techniken können verwendet werden, um dieses Modell zu etablieren werden: Injektion einer Krebszelle Suspension in den Blinddarm Wand oder Transplantation von einem Stück des subkutanen Tumor auf den Blinddarm. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung der natürlichen Entwicklung von Darmkrebs und Erprobung neuer Therapeutika gegen den Darmkrebs.

Orthotopen Mausmodell der Darmkrebs-

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Etablierung eines spontanen Metastasen-Mausmodells von Xenotransplantaten oder PDXs von Darmkrebspatienten. Diese Xenotransplantatmodelle ahmen teilweise die Merkmale menschlicher Karzinome nach und verstehen die kritischen Aspekte menschlicher Malignome, einschließlich Invasion und Metastasierung.

Mausmodelle für spontane Metastasen: Eine Plattform zur Untersuchung des Metastasierungspotenzials von orthotopisch injizierten kolorektalen Krebszellen

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Erzeugung von Metastasen durch die PDX-abgeleiteten CRC-Organoide, die mit GFP-Lentiviren markiert wurden, in die Milz einer immundefizienten Maus. Krebsmikrometastasen, die andere Organe besiedeln, können mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden, um die GFP-Expression zu beurteilen.

Etablierung eines experimentellen Metastasen-Mausmodells: Implantation von GFP-exprimierenden CRC-Organoidzellen in das PDX-Modell zum Nachweis von Mikrometastasen

Das Video beschreibt die Technik zur intrazikalen Injektion von Krebszellen, um ein orthotopes Mausmodell mit hochgradig einheitlichen Tumoren zu entwickeln. Daher ermöglicht das orthotope Mausmodell eine realistische Simulation der Metastasierung und stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die Phänotypveränderungen während des Tumorwachstums und der Tumorverbreitung zu untersuchen.

Injektion von intrazikalen Tumorzellen: Eine Technik zur Verabreichung von Krebszellen zur Etablierung eines orthotopen kolorektalen Krebs-Mausmodells

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen aus der Vollblutprobe eines euthanasierten kolorektalen Tumormausmodells. Diese isolierten CTCs können kultiviert und für die vorgesehene Downstream-Analyse verwendet werden.

CTC-Isolierung aus einer Vollblutprobe: Eine Methode zur Gewinnung von CTCs aus dem Modell des murinen Darmkrebses

Es wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen (CTCs) eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung spielen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung und Vermehrung von CTCs aus dem Vollblut eines syngenen Maustumormodells der Metastasierung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) beschrieben.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Einem Tiermodell wird benötigt, um die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Lunge Kolonisation in Krebsmetastasen zu entschlüsseln. Hier wir etabliert und erfolgreich durchgeführt eine in Vivo assay, speziell Test das Erfordernis der Polymeren Fibronektin (PolyFN) Montage auf CTCs zur Besiedlung der Lunge.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.

Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

Portalveneninjektion von Darmkrebs (CRC) Organoiden erzeugt stromareiche Lebermetastasen. Dieses Mausmodell der CRC-Lebermetastasierung stellt ein nützliches Werkzeug dar, um Tumor-Stroma-Interaktionen zu untersuchen und neuartige Stroma-gerichtete Therapeutika wie Adeno-assoziierte virusvermittelte Gentherapien zu entwickeln.

Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma

Dieses Protokoll beschreibt die orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen. Das Modell rekapituliert fortgeschrittene metastasierende Darmkrebserkrankungen und ermöglicht die Evaluierung neuer therapeutischer Medikamente in einem klinisch relevanten Szenario von Lungen- und Lebermetastasen.

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Erfahren Sie eine mikrochirurgische Technik zur Injektion von Tumorzellen in die Blinddarmwand von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung zirkulierender Tumorzellen und liefert ein reproduzierbares Modell für die Erforschung von metastasiertem Darmkrebs.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

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