Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Das übergeordnete Ziel dieser mikrochirurgischen Technik ist es, kolorektale Tumorzellen in die Blinddarmwand zu injizieren, um reproduzierbare und metastasierende kolorektale Tumoren bei Mäusen zu induzieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen auf dem Gebiet der zirkulierenden Tumorzellbiologie beantworten, ihre Hauptvorteile sind die hochgradig reproduzierbaren und einheitlichen Tumore, die eine zuverlässige Vorhersage des Stadiens und der zirkulierenden Tumorzellen ermöglichen. Beginnen Sie mit einer atraumatischen Pinzette, um den Blinddarm einer sechs bis acht Wochen alten immungeschwächten Maus vorsichtig nach außen zu entfernen.

Legen Sie das blinde Ende des Blindschwanzes so auf den Bauch, dass der Beutel nach Schädeln zeigt. Für die intrazäkale Injektion montieren Sie eine Standard-Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Canella ausgestattet ist, und laden Sie sie mit den Tumorzellen auf eine Mikroinjektionspumpe, die auf einem Mikromanipulator montiert ist. Fassen Sie dann mit der atraumatischen Pinzette vorsichtig die Spitze des Blinddarms und verwenden Sie eine zweite Pinzette, die mit warmer Kochsalzlösung angefeuchtet ist, um den Blinddarm sanft mit Abwärtsbewegungen zu glätten.

Bewegen Sie nun das Tier unter ein binokulares Operationsmikroskop und dehnen Sie mit der Canella direkt parallel zum und über dem Blinddarm mit zwei atraumatischen Zangen vorsichtig das Gewebe an beiden Enden des äußeren Endes des Blindfußes. Ziehen Sie den Blinddarm langsam über die Canella, achten Sie darauf, dass nicht der gesamte Gürtel der Wand oder die Serosa über den anfänglichen Eindringpunkt hinaus perforiert wird, und platzieren Sie die Canella über den Blutgefäßen und unter der dünnen durchscheinenden Membran im inneren Gürtel der Wand. Wenn die Canella an Ort und Stelle ist, injizieren Sie mit einem Fußschalter 20 Mikroliter Zellen über einen Zeitraum von 20 Sekunden.

Zwischen der dünnen durchscheinenden Serosa-Schleimhaut, oberhalb der intramuralen Blutgefäße und der Muscularis. Wenn alle Zellen injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Canella und legen Sie einen Trockenswap unter den Blinddarm. Um eine künstliche peritoneale Dissemination zu verhindern, lysieren Sie ausgetretene Zellen mit einer gründlichen Spülung mit destilliertem Wasser und führen Sie den Blinddarm vorsichtig in die Bauchhöhle zurück.

Die Bauchdecke mit schnell resorbierbaren Laufnähten verschließen, in der Haut mit chirurgischen Wundclips. Legen Sie dann die Maus auf eine auf 38 Grad Celsius eingestellte Heizmatte mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen. Um die zirkulierenden Tumorzellen zu isolieren, füllen Sie am geeigneten experimentellen Endpunkt 15 Milliliter konische Röhrchen mit fünf Millilitern Dichtegradientenmedium pro Röhrchen und überführen Sie vorsichtig Vollblutproben von tumortragenden Tieren auf die Dichtegradientenschichten.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und bergen Sie vorsichtig die Grenzfläche, die die mononukleären Zellen enthält. Pipettieren Sie die mononukleären Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen für eine zweite Zentrifugation. Gefolgt von Schlauchwäschen in PBS.

Nach dem zweiten Waschen werden die Pellets in 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit EDTA, erneut suspendiert und jeder Probe vier Mikroliter Anti-Amp-Camp-Antikörper zugesetzt, um sie 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis zu inkubieren. Als nächstes zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen etwa einen Zentimeter großen Kreis in eine sterile sechs Zentimeter große Petrischale pro Probe und fügen Sie jedem Kreis 700 Mikroliter Picking-Puffer hinzu, gefolgt von 50 Mikrolitern Zellsuspension. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Dichte der Zellen zu überprüfen, und lassen Sie die Proben etwa fünf Minuten lang absetzen.

Untersuchen Sie dann den Zelltropfen auf Amp-Camp-Positivität und übertragen Sie mit dem Mikromanipulator die interessierenden Zellen in 15 Mikroliter des entsprechenden Puffers für die beabsichtigte nachgeschaltete Analyse. Die Verwendung von kolorektalen Zellen in diesem Modell führt zuverlässig zu einer größeren Anzahl von Mäusen innerhalb von 35 Tagen nach der Injektion von Tumorzellen, wobei die Primärtumoren etwa 10 Millimeter groß sind und Leber- und Lungenmetastasen sowie zirkulierende Tumorzellen fast ausnahmslos vorhanden sind. Darüber hinaus können die zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Analyse leicht isoliert werden.

Sobald diese Technik gemeistert und richtig durchgeführt wird, kann sie innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, was die Bildung von einheitlichen und metastasierenden Tumoren erleichtert, die sowohl für therapeutische als auch für molekulare Studien verwendet werden können. Zu den Einschränkungen des Modells gehören die Abhängigkeit von der Zelllyse, die ihre eigenen Grenzen haben, sowie die Immunschwäche der Mäuse, die beide durch den Einsatz mutierter Darmkrebszellen überwunden werden können. Aufgrund seiner Einfachheit ist dieses Modell vielleicht eine wertvolle Ergänzung zu den derzeit verfügbaren Modellen für Darmkrebs.