Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Vorbereitung und Schneiden mit einem Vibratom. Drei Agarblöcke werden benötigt, um das Gehirn während des Schneidevorgangs zu stabilisieren. Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie ein Autoklaven-Instrumentarium.

Entferne den Agar. Sollte auf dem Filterpapier getrocknet werden, bevor es mit medizinischem Cyanacrylatkleber auf die Metallplatte geklebt wird. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spatel und legen Sie es vorsichtig in die mit Vorbereitungsmedium gefüllte Petrischale.

Anschließend trocknest du das Gehirn kurz auf dem Filterpapier ab. Bedecken Sie die Metallplatte mit medizinischem Cyanacrylat-Kleber. Positionieren Sie das Gehirn mit der Pinzette und dem Spatel auf dem Probenhalter.

Verwenden Sie die zuvor vorbereiteten zwei Stücke Agar, um die mechanische Stabilität von beiden Seiten zu gewährleisten. An dieser Stelle sollte das Gehirn neben den Agarblock gelegt und mit zwei weiteren Blöcken stabilisiert werden, um Schäden während des Schneidens zu vermeiden. Legen Sie die Metallplatte in das Vibratom und bedecken Sie das Gewebe mit kaltem Präparationsmedium.

Danach wird das Gewebe horizontal in 350 Mikrometer dickem OHSC mit einem Gleitvibratom präpariert. Übertragen Sie die Scheiben in die Petrischale und verwenden Sie die Rückseite einer zerbrochenen Pasteurpipette, um die Scheiben zu sammeln. Bewahren Sie die Gehirnschnitte in kaltem Zubereitungsmedium auf.

Bewerten Sie die Schnitte optisch mit einem binokularen Mikroskop. Trennen Sie die Hippocampusregion und dringen Sie mit einem Skalpell mit einer runden Klinge der Größe 15 in die innere Rinde ein. Es ist wichtig, nur solche Schnitte innerhalb einer intakten Zytoarchitektur zu nehmen, die aus dem mittleren Teil des Hippocampus zwischen dem dorsalen und dem ventralen Hippocampus isoliert wurden.

OHSC von geringer Qualität sollten sofort verworfen werden. Zwei bis drei der erhaltenen Scheiben werden in einen Zellkultureinsatz mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometer überführt. Aspirieren Sie ein Präparationsmedium mit einer Pasteur-Pipette von der Oberseite des Zellkultureinsatzes.

Legen Sie den Einsatz in eine Sechs-Well-Kulturschale mit einem Millimeter Nährmedium pro Well. Inkubieren Sie die sechs Well-Schalen bei 35 Grad Celsius in voll befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO2 und wechseln Sie das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag. Nach sechs Tagen in Kultur für Rattengewebe oder 14 Tagen für Mausgewebe sind Entzündungsreaktionen, die mit dem Schneideverfahren selbst verbunden sind, verschwunden.

Nun können Experimente durchgeführt werden. Repräsentative Ergebnisse für Neuroprotektionsstudien. Bildteil A zeigt unläsioniertes OHSC, das neun Tage lang in vitro in Kulturmedium aufbewahrt wurde, ohne dass eine Behandlung als Kontrollschnitte diente.

Wie die konfokale Laser-Rastermikroskopie bestätigte, zeigte die Kontroll-OHSC eine gute neuronale Konservierung. Die Isolectin B4-positiven Mikrogliazellen waren hauptsächlich in den molekularen und plexiformen Schichten lokalisiert und wiesen einen verzweigten Phänotyp auf. In der körnigen Zellschicht des Gyrus dentatus wurden nur sehr wenige Isolectin B4-positive Mikrogliazellen und praktisch keine Propidiumiodid-positiven Zellkerne gefunden.

Ein weiterer Satz von OHSC, der in Bild Teil B zu sehen ist, wurde sechs Tage lang in Kulturmedium aufbewahrt und vier Stunden lang mit 50 mikromolaren NMDA läsioniert. Und weitere drei Tage in Kulturmedium aufbewahrt. Nach der NMDA-Läsion kam es zu einer massiven Anhäufung von aktivierten Isolectin B4-positiven Mikrogliazellen an der Stelle der neuronalen Verletzung, und zwar in allen Schichten des Gyrus dentatus.

Die quantitative Analyse zeigte, dass in der granulären Zellschicht des Gyrus dentatus die Anzahl der Isolectin B4-positiven Mikrogliazellen bei läsioniertem OHSC im Vergleich zu den Kontrollbedingungen höher war. In ähnlicher Weise war die Anzahl der Propidiumiodid-positiven degenerierenden Neuronen in der granulären Zellschicht von NMDA-läsionierten Schnitten stark erhöht. Beispielergebnisse für Studien zur Tumorinvasion.

Alle Bilder zeigen Ergebnisse der Tumorinvasion SS mittels OHSC, die mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurden. Rote Farbe markiert die Zytoarchitektur des OHSC und grüne Tumorzellen. Bild A zeigt ein typisches Invasionsmuster für U138-Glioblastomzellen, die vier Tage lang eindringen durften.

Es können klare, kugelförmige, differenzierte Tumoren beobachtet werden und die OHSC-Struktur scheint intakt zu sein, mit einem deutlich sichtbaren Gyrus dentatus und Cornu Ammonis. Bild B zeigt ein anderes Invasionsmuster, das von LN229-Glioblastomzellen nach vier Tagen erzeugt wurde. In diesem Fall können einzelne Tumoren aufgrund des gebildeten Netzwerks, das den größten Teil des OHSC bedeckt, nicht eindeutig unterschieden werden, obwohl die Zytoarchitektur mit einem undeformierten Gyrus dentatus und Cornu Ammonis intakt bleibt.

Daraus lässt sich schließen, dass LN229-Zellen invasiver sind als U138-Zellen. Bild C und D zeigen das gleiche Ergebnis der Tumorinvasion für LN229-Zellen nach vier Tagen der Invasion. Auf der linken Seite ist zu sehen, dass die Tumormasse fast das gesamte Sichtfeld bedeckt.

Bild D zeigt die entsprechende Propidiumiodid-Färbung. In diesem Dia ist die Zytoarchitektur nicht mehr intakt, da das Cornu Ammonis nicht mehr sichtbar ist und der Gyrus dentatus ebenfalls verzerrt ist. Ein möglicher Grund für ein solches Ergebnis könnte ein OHSC sein, der zu Beginn des Experiments nicht vollständig intakt war, eine zu hohe Anzahl applizierter Tumorzellen oder eine zu lange Invasionszeit, die zu dem beobachteten Strukturverlust führte.

Daher sollten diese Art von Invasionsergebnissen verworfen werden. Organotypische hippokampale Schnittkulturen stellen ein sehr gutes in vitro Modell dar, das die Physiologie des Gehirns mit intakten neuronalen Verbindungen widerspiegelt. Da von einem Modell aus mehrere Schnittkulturen gewonnen werden können, können mehrere Bedingungen im Gewebe eines Tieres getestet werden und die Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar.

Aufgrund der hohen Zugänglichkeit eignen sich organotypische Hippocampus-Schnittkulturen hervorragend für eine Vielzahl von experimentellen Typen. Dazu gehören elektrophysiologische und Neurogenese-Studien, aber auch Experimente zur Neuroprotektion, Tumorinvasion und Wechselwirkungen von Tumorzellen mit gesundem Hirngewebe.