Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Herstellung und Schneiden mit einem Vibratom. Drei Agarblöcke sind erforderlich, um das Gehirn während des Schneidens zu stabilisieren. Verwenden Sie zur Vermeidung von Kontaminationen ein autoklaviertes Instrumentenset.

Entfernen Sie das Agar. Es sollte auf Filterpapier getrocknet werden, bevor es mit medizinischem Cyanoacrylat-Kleber auf der Metallplatte befestigt wird. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spatel und legen Sie es vorsichtig in die mit Puffer gefüllte Petrischale.

Trocknen Sie das Gehirn anschließend kurz auf dem Filterpapier. Bedecken Sie die Metallplatte mit medizinischem Cyanoacrylat-Kleber. Positionieren Sie das Gehirn mit Hilfe der Pinzette und des Spatels auf dem Probenträger.

Verwenden Sie die zuvor vorbereiteten zwei Agar-Stücke, um die mechanische Stabilität von beiden Seiten sicherzustellen. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Gehirn neben den Agar-Block platziert und mit zwei weiteren Blöcken stabilisiert werden, um Schäden während des Schneidens zu verhindern. Stellen Sie die Metallplatte in das Vibratom und bedecken Sie das Gewebe mit kaltem Präparationsmedium.

Anschließend wird das Gewebe mit einem Schiebevibratom horizontal in 350 Mikrometer dicke OHSCs präpariert. Die Schnitte werden mit der Rückseite einer gebrochenen Pasteurpipette gesammelt und in die Petrischale überführt. Die Gehirnschnitte werden in kaltem Präparationsmedium aufbewahrt.

Die Schnitte optisch mit einem Binokularmikroskop auswerten. Mithilfe eines Skalpells mit einer runden Klinge der Größe 15 den Hippocampus-Bereich und den inneren Kortex trennen. Es ist wichtig, nur die Schnitte zu verwenden, die eine intakte Zytoarchitektur aufweisen und aus dem mittleren Teil des Hippocampus zwischen dem dorsalen und dem ventralen Hippocampus isoliert wurden.

OHSCs von geringer Qualität sollten sofort verworfen werden. Überführen Sie zwei bis drei der erhaltenen Schnitte in ein Zellkulturinsert mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometer. Aspirieren Sie ein Präparationsmedium von der Oberseite des Zellkulturinserts mithilfe einer Pasteurpipette.

Platzieren Sie den Insert in eine 6-Loch-Kulturplatte, die pro Mulde ein Milliliter Kulturmedium enthält. Inkubieren Sie die 6-Loch-Platten bei 35 Grad Celsius in einer voll befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 und wechseln Sie das Zellkulturmedium alle zwei Tage. Nach sechs Tagen Kultivierung bei Rattengewebe bzw. 14 Tagen bei murinem Gewebe sind entzündliche Reaktionen, die mit dem Schneideverfahren selbst einhergehen, verschwunden.

Nun können Experimente durchgeführt werden. Stellvertretende Ergebnisse für Neuroprotektionsstudien. Bildteil A zeigt ungelesionierte OHSC, die neun Tage lang in vitro ohne Behandlung im Kulturmedium gehalten wurden und als Kontrollschnitte dienen.

Wie durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie bestätigt, zeigten die Kontroll-OHSC eine gute neuronale Erhaltung. Die Isolectin-B4-positiven Mikrogliazellen waren hauptsächlich in den molekularen und plexiformen Schichten lokalisiert und wiesen ein verzweigtes Phänotyp auf. In der granulären Zellschicht des Gyrus dentatus fanden sich nur sehr wenige Isolectin-B4-positive Mikrogliazellen und praktisch keine Propidiumiodid-positiven Kerne.

Ein weiterer Satz von OHSC, dargestellt in Bildteil B, wurde sechs Tage lang im Kulturmedium gehalten und anschließend vier Stunden lang mit 50 Mikromolar NMDA verletzt. Danach wurden sie weitere drei Tage im Kulturmedium aufbewahrt. Nach der NMDA-Läsion kam es zu einer massiven Ansammlung aktivierter, Isolectin-B4-positiver Mikrogliazellen, die sich an der Stelle der neuronalen Verletzung festsetzten und sich über alle Schichten des Gyrus dentatus erstreckten.

Die quantitative Analyse zeigte, dass in der granulären Zellschicht des Gyrus dentatus die Anzahl der Isolectin-B4-positiven Mikrogliazellen in geschädigten OHSC höher war als unter Kontrollbedingungen. In ähnlicher Weise war die Anzahl der Propidiumiodid-positiven degenerierenden Neuronen in der granulären Zellschicht von mit NMDA geschädigten Schnitten stark erhöht. Beispielergebnisse für Untersuchungen zur Tumorausbreitung.

Alle Bilder zeigen Ergebnisse der Tumorzellinvasion im SS-Verfahren unter Verwendung von OHSC, die mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurden. Die rote Farbe markiert die Zytoarchitektur der OHSC und grüne Tumorzellen. Bild A zeigt ein typisches Invasionsmuster von U138-Glioblastomzellen, die vier Tage lang zur Invasion freigegeben wurden.

Klare, sphärische, abgegrenzte Tumore sind erkennbar, und die OHSC-Struktur scheint intakt zu sein, mit einem deutlich sichtbaren Gyrus dentatus und Cornu Ammonis. Abbildung B zeigt ein anderes Invasionsmuster, das durch LN229-Glioblastomzellen nach vier Tagen entstanden ist. In diesem Fall lassen sich einzelne Tumore aufgrund des gebildeten Netzwerks, das den größten Teil des OHSC bedeckt, nicht klar voneinander abgrenzen, obwohl die Zytoarchitektur mit einem nicht deformierten Gyrus dentatus und Cornu Ammonis erhalten bleibt.

Weiterhin lässt sich schließen, dass LN229-Zellen invasiver sind als U138-Zellen. Bild C und D zeigen das gleiche Tumorausbreitungsergebnis für LN229-Zellen nach vier Tagen Invasion. Auf der linken Seite ist zu erkennen, dass die Tumormasse nahezu das gesamte Sichtfeld bedeckt.

Bild D zeigt die entsprechende Propidiumiodid-Färbung. Bei diesem Präparat ist die Zytarchitektur nicht mehr intakt, da der Cornu ammonis nicht mehr sichtbar ist und auch der Gyrus dentatus verformt ist. Eine mögliche Ursache für ein solches Ergebnis könnte ein OHSC sein, der zu Beginn des Experiments nicht vollständig intakt war, eine zu hohe Anzahl applizierter Tumorzellen oder eine zu lange Invasionzeit, die zum beobachteten Strukturverlust geführt hat.

Daher sollten diese Art von Invasionsergebnissen verworfen werden. Organotypische hippokampale Schnittkulturen stellen ein sehr gutes In-vitro-Modell dar, das die Physiologie des Gehirns mit intakten neuronalen Verbindungen widerspiegelt. Da aus einem Modell mehrere Schnittkulturen gewonnen werden können, ermöglicht dies die Untersuchung mehrerer Bedingungen in Gewebe von einem Tier, und die Ergebnisse sind hochgradig reproduzierbar.

Aufgrund des hohen Maßes an Zugänglichkeit eignen sich organotypische Hippocampus-Schnittkulturen hervorragend für eine Vielzahl experimenteller Ansätze. Dazu gehören elektrophysiologische und Neurogenese-Studien, aber auch Experimente zur Neuroprotektion, Tumorzellinvasion und Wechselwirkungen von Tumorzellen mit gesundem Hirngewebe.