Name: Rekombinante α-β und γ-Synucleins stimulieren Protein Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Aktivität in Zelle frei Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie rekombinante α-, β- und γ-Synucleine die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 2A in zellfreien Assays stimulieren. Diese Methode zeigt die Spezifität von α-Synuclein für PP2Ac im Mausgehirn.

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Die Autoren schätzen Bemühungen durch vorherige Labor Mitglieder Kendra Mackett, Sandra Slusher und Jie Chen, gearbeitet, um die Methode zu optimieren. Die Autoren danken auch der National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso wissenschaftliche Aktivität Forschung Projekt (SARP), Lizanell und Colbert Coldwell Stiftung, mehrfache System Atrophie Koalition, Hoy Familienforschung und Anna Mae Doyle Geschenk Mittel für die finanzielle Unterstützung dieser Forschung.

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien
<ol><li>
Vorbereitung der p-Nitrophenyl Phosphatpuffer (pNPP)
	<ol>
<li>50 mL pNPP Puffer wie folgt vorbereiten.</li>
		<li>Tris-Base 0,30285 g Abwiegen (siehe die Tabelle der Materialien) und in 25 mL hochreines deionisiertes Wasser auflösen.<ol>
<li>41.6 µL 120 mM CaCl2hinzufügen. Passen Sie auf pH 7,0 mit 1 M HCl und bringen Sie die endgültige Lösung Volumen bis 50 mL mit entionisiertem Reinstwasser.</li>
			<li>Sicherstellen Sie, dass die Endkonzentration 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.</li>
			<li>Speichern Sie pNPP Puffer bei 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Malachitgrün Lösungen Vorbereitung der folgenden.
	<ol>
<li>Bereiten Sie Lösung A durch Zugabe von 32,8 mL konzentrierter HCl auf 67,2 mL entionisiertem Reinstwasser eine 4 M HCl-Lösung erstellen. Hinweis: Malachit-Lösung wird in einer Abzugshaube mit Einweg-Handschuhe, Mundschutz und Schutzbrille vorbereitet.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung B mit einem Gewicht von 4,2 g Ammonium Molybdat und 95,8 mL der Lösung A. hinzufügen</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung C durch Wiegen 0,045 g Malachit Grün Oxalat Salz und Hinzufügen von hochreinen deionisiertes Wasser um das endgültige Gesamtvolumen auf 100 mL zu bringen.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung D durch das Mischen von Lösungen B und C im Verhältnis 1:3 (V/V), rühren für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Lösung D durch eine 0,22 µm Pore Größe Nitrozellulose Membran Filter-Einheit mit einer 50 mL-Spritze zu filtern.</li>
		<li>Bewahren Sie vorbereitete Malachit-Lösung bei 4 oC, vor Licht geschützt auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Aktivators
	<ol>
<li>Zur Vorbereitung einer 1 % entionisiertem Tween 20 Lösung, Pipette 10 µL Tween 20 in 990 µL des hochreinen Wasser (V/V) dann Wirbel bis das Tween 20 vollständig auflöst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Arbeitslösung Malachitgrün Tween 20 (MGT).
	<ol>
<li>Mischen Sie den Aktivator (Schritt 1.3) mit Malachitgrün-Lösung (Lösung D, Step 1.2.5) in einem Verhältnis von 1: 100 (z. B. 1 µL Aktivator zu 99 µL Malachitgrün Lösung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von Threonin Phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) Substrat.
	<ol>
<li>Fügen Sie um 2 mM Lager, Stätte bereiten eine 1 mg Phosphopeptide Ampulle auf Eis, 550 µL deionisiertes Reinstwasser und Wirbel sanft aufzulösen.<ol>
<li>~ 10 Aliquote erstellen und speichern Sie pT bei-20oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synuclein Vorbereitung
	<ol>
<li>Bereiten Sie Synucleins in einer Abzugshaube mit Einweg-Handschuhe, Mundschutz und Schutzbrille.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie 1 mg rekombinantes Synuclein in 1 mL entionisiertem Reinstwasser für eine Endkonzentration von 1 mg/mL.</li>
		<li>Wirbel sanft zu lösen und auf Eis legen.</li>
		<li>50 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erarbeitung von Phosphat-Normen
	<ol>
<li>Die Phosphat-Stammlösung 0,1 mM wie folgt vorbereiten.<ol>
<li>Wiegen Sie 0,1361 g KH2PO4 ab und in ein Becherglas mit 80 mL entionisiertem Reinstwasser. Fügen Sie einen Stir Bar und Mischung auflösen. Übertragen Sie alle die Lösung zu einem Messzylinder und bringen Sie das endgültige Gesamtvolumen auf 100 mL mit entionisiertem Reinstwasser.</li>
			<li>Filtern Sie die gesamte Lösung durch eine 0,22 µm Pore Größe Nitrozellulose Membran Filter-Einheit mit einer 50 mL Spritze; die Endkonzentration beträgt 10 mM.</li>
			<li>Verdünnen Sie die Lösung (10 mM) 1: 100; die Endkonzentration werden 0,1 mM Phosphat (PO4) für Test-Standards verwendet werden.</li>
			<li>Speichern der Phosphat-Stammlösung bei 4 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Siehe Tabelle 1 für die Begrenzung der Verdünnungen verwendet, um mit einem total Endvolumen von 1250 µL PO4 Standards. 1,5 mL Röhrchen gemäß Tabelle 1 die entsprechende Menge an Phosphat und hochreinen deionisiertes Wasser hinzufügen.<ol>
<li>Store vorbereitet PO4 Standards bei-20 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">Phosphat-Standards</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 mM PO4 -Lösung (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hochreines entionisiertem Wasser (mL)</td>
			<td>1.250</td>
			<td>1.175</td>
			<td>1.100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endkonzentration von PO4 [Pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1.200</td>
			<td>2.400</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Phosphat Standards.
(2) PP2A Assay als Reaktion auf rekombinante Synucleins
Hinweis: Das letzte Gesamtvolumen für jede Reaktion werden 60 µL, so der Experimentator des Ausgangsvolumens pNPP Puffer entsprechend anpassen muss, um die Lautstärke des Synucleins für jede Probe verwendet unterzubringen. In den meisten Fällen wird das Volumen der pNPP Puffer zwischen 40 und 44 µL sein.
<ol><li>
Jeder PP2Ac Reaktion wie folgt vorbereiten.
	<ol>
<li>Fügen Sie in einer 1,5 mL Tube 39 µL pNPP Puffer und Platz auf dem Eis hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL (105 ng/µL oder 0.0007 U/µL) menschlichen rekombinante PP2Ac (rPP2Ac).</li>
		<li>Fügen Sie 4 µL 0, 1,5, 7,5, 15 oder 30 µM Synucleins, rPP2Ac in pNPP Puffer für Endkonzentrationen von 0, 0.1, 0.5, 1.0 und 2.0 µM und inkubieren Sie bei 4 ° C für 30 min auf einem rotierenden Kreisel; Das Endvolumen werden 60 µL.</li>
		<li>Bewegen Sie nach 30 min Proben zu Eis und 16 µL 2 mM pT Substrat hinzufügen.</li>
		<li>Inkubieren Sie jeder PP2A-Assay-Mischung für 10 min bei 30 ° C in einem Wasserbad mit intermittierenden schütteln.</li>
		<li>Hinzufügen ein Flachboden-96-Well-Platte 25 µL jeder PO4 standard (0, 150, 300, 600, 1.200 und 2.400 Pmol) in doppelte Brunnen von niedrig bis hoch.</li>
		<li>Als nächstes fügen Sie 25 µL jeder experimentellen Probe (PP2A Assay ± Synuclein), vorbereitet in Schritten 2.1.1 bis 2.1.6 Brunnen auf der gleichen 96-Well-Platte zu duplizieren.</li>
		<li>Fügen Sie 75 µL Arbeitslösung MGT, jeweils gut Standards und Proben.</li>
		<li>Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
		<li>Ein Farbwechsel in Proben mit messbaren Unterschiede in der Phosphatspiegel zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. photometrische Analyse
<ol><li>Analysieren Sie die 96-Well-Platte mit Standards und Proben mit einem spektralfotometrische Platte-Reader mit der Wellenlänge 630 nm29festgelegt.</li>
	<li>Plot die Absorption Kurve produziert (Proben lesen bei 630 nm) und beachten Sie, dass es linear bis zu 2.400 Pmol Konzentration von PO4bleibt.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
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<li>Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwingle%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).</li>
</ol>

Dr. Perez war ein Mitglied der Fakultät der Abteilung für Neurologie an der University of Pittsburgh School of Medicine von 1999 bis 2011.

Malachitgrün Assays mit pT wurde verwendet, um PP2Ac-Aktivität zu messen, weil es einfacher durchzuführen als die klassische Methode, die 32P-gekennzeichnete Substrate verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Assay über radioaktive Proben ist, dass Radioisotope einige Gefahr und können teuer werden, vor allem 32P-markierte Moleküle haben kurze Halbwertszeiten, die beschränkt die Anzahl der Tests, die man ausführen kann, bevor Reagenzien ablaufen. Verschwenden Sie mit Malachitgrün, anstatt Radioaktivität auch die Notwendigkeit beseitigt zu entsorgen, 32P. Malachitgrün-Assays sind auch sehr empfindlich bei der Messung der Aktivität von Serin/Threonin Phosphatasen im Vergleich zu anderen farbmetrischen Assay, die verwendet das Substrat p-Nitrophenylphosphate (pNPP), die ist nicht selektiv, da es sein kann Rezeptorsignals von einer Vielzahl von Enzymen32.
Kommerzielle Malachitgrün Sets, PP2A Aktivität zu messen sind seit einiger Zeit verfügbar und wurden zuvor im Labor eingesetzt. Allerdings wurde dabei viele Malachitgrün-Assays, solche Sets zu teuer. Darüber hinaus kommerzielle Kits für PP2A Aktivität sind nur für ein Jahr stabil, während mit Reagenzien für die Form Puderzucker und bieten fachgerechte Lagerung leicht zugänglich Assay-Komponenten, die für längere Zeit strukturell stabil sind.
Vor der Prüfung bSyn und gSyn, aSyn diente als Positivkontrolle, PP2Ac Aktivität zu stimulieren und zu bestimmen, die Höhe der PP2Ac für die Assays erforderlich, und auch zu bestätigen, dass die resultierende Daten bleiben auf der Skala mit der Standardkurve (150-2400 Pmol PO4 ). Es ist bemerkenswert, dass wenn aSyn PP2Ac regt zu stark, obwohl die Reaktion in der Regel linear ist, Daten Skala erlischt und Chemikalien in der MGT-Lösung auszufällen, macht es unmöglich, genaue Mengen freigegeben frei-PO4 mit einem Teller zu messen Reader.
Angesichts der Tatsache, dass aSyn beiträgt, um PP2Ac Aktivität in Vivo und in Vitro12,19,21,23,25, und dass alle Synucleins beträchtliche Homologie, es war gewesen die Hypothese, dass alle Familienmitglieder Synuclein möglicherweise in der Lage, PP2Ac in Zelle kostenlose Tests zu stimulieren. Mit Hilfe des kolorimetrischen Tests beschrieben hier wurde festgestellt, dass in der Tat, alle drei rekombinante Synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) stimuliert PP2Ac Aktivität, Anhebung der Möglichkeit, dass alle drei Synucleins im Nervensystem ähnliche Funktionen ausführen kann. Jedoch Gehirn von Parkinson oder Demenz mit Lewy-Körper-Fälle haben weniger PP2Ac Aktivität in Geweben mit hoch aggregierten aSyn23. Maus-Gewebe beherbergen Lewy-Körper-wie Pathologie auch ausstellen reduziert PP2Ac Aktivität25. Dies, und neue Daten in Abbildung 3 sowie vorherige Daten von aSyn Knockout Mäuse12, stark darauf hin, dass weder bSyn noch gSyn in der Regel den Verlust der löslichen aSyn kompensieren kann im Gehirn, oder alternativ, dass die Synuclein homologe können nicht Ordnen Sie PP2Ac so stark wie aSyn wie abgebildet (Abb. 3). Allen Brain Atlas zeigt NS1 von allen drei Synuclein mRNAs in vielen Bereichen des Gehirns, und zwar dreifach-Synuclein-Knockout-Mäusen wurden generierten9,33, PP2Ac Aktivität in diesem Modell nicht bewertet worden ist. Interessanterweise aSyn, die auf Ser129 von Polo-Like Kinase 2, phosphoryliert wird ist weniger in der Lage, PP2Ac12zu aktivieren, aber Beweise für bSyn hier gezeigten empfehlen, dass bSyn Phosphorylierung unwahrscheinlich, PP2Ac Aktivität zu beeinflussen ist, wie sehr wenig bSyn kam mit PP2Ac im Gehirn der Maus (Abbildung 3). Zusammen genommen, die Daten deuten darauf hin, dass endogene PP2Ac Aktivität Modulatoren, wie aSyn, wahrscheinlich zu Wellness und Krankheit beitragen.
Das Protokoll hier skizzierten ist eine einfache, aber wirkungsvolle Technik, um die Fähigkeit des PP2Ac, ein Phosphopeptide Substrat in Reaktion auf verschiedene Behandlungen dephosphorylate bestimmen. Zum Beispiel kann diese dieselbe Methode, andere PP2Ac Aktivatoren wie Ceramide sowie möglicher neuer Therapeutika34, zu testen oder zur Bewertung der Auswirkungen von PP2Ac Inhibitoren in Vitroverwendet werden. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass ähnliche Tests können die Aktivität der PP2Ac messen, die von 1 6 isoliert worden Immunopräzipitation Zellextrakte oder Körpergewebe, wie oben beschrieben die Autoren12,19, 25. Zukunft Anwendungen für Malachitgrün-Assay existieren jenseits Messung PP2Ac Aktivität, da ATP Tätigkeit auch mit solch einem Assay ermittelt werden kann.
Beachten Sie, dass eine Standardkurve jedes Mal für jeden unabhängigen PP2Ac Assay generiert werden muss. Es ist zwingend erforderlich, um sicherzustellen, dass alle verwendete Reagenzien Phosphat frei, wie freie Phosphate künstlich Hintergrundsignal erhöhen und falsche Ergebnisse zu produzieren. Am Tag des Tests ist es wichtig, genügend frische MGT-Lösung für alle Proben untersucht werden vorzubereiten. Außerdem ist MGT nur gut der Tag, an dem es gemacht ist und neigt zu überstürzen sich nach ein paar Stunden. PP2Ac von einem Händler gekauft und gespeichert muss Aliquotted werden eingefroren, sobald sie eingegangen ist, um Einfrieren Auftauen Zyklen zu verhindern, die seine Aktivität zu reduzieren. Wie andere Phosphatasen pT-Substrat (z.B. PP1 und PP535), dephosphorylate können bei der Analyse der Zelle oder eines Gewebes Auszüge in der PP2Ac nicht durch Immunopräzipitation lokalisiert worden Proben müssen übergangen werden Spalten, freie Phosphate zu entfernen und spezifische Inhibitoren der Phosphatasen müssen zur Phosphatase Spezifität, wie zuvor beschrieben18zu bestätigen.

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Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Die Verteilung der Synucleins in Gehirn und Rückenmark zeigen, dass alle drei Synucleins in den neuralen Geweben angereichert sind definiert, obwohl unterschiedliche Muster der Lokalisierung wurden Studien berichtet1. Z. B. aSyn ist am häufigsten vorkommende an präsynaptischen Standorten in Hirnrinde und Basalganglien2,3, bSyn hat eine gleichmäßigere Verteilung im Gehirn und Rückenmark4,5und gSyn ist häufiger im Rückenmark und periphere Ganglien6. Obwohl einige embryonalen Ausdruck alle Synucleins auftreten kann, werden drei homologen häufiger während der Neugeborenen Periode4,5,6,7,8. Bemerkenswert ist, Daten aus Synuclein triple Knockout-Mäusen zeigen, dass Verlust von allen drei Synucleins Alter Beginn neuronale Dysfunktion9, unterstützen wichtige Synuclein Funktionen im zentralen Nervensystem (ZNS)10, verursacht 11. es ist noch nicht bekannt, ob Synuclein triple Knockout-Mäusen Veränderungen in PP2Ac Verteilung oder Aktivität zeigen. Daten aus einzelnen Synuclein-Knockout-Mäusen zeigen, dass Verlust der aSyn allein in der Lage, PP2Ac Aktivität im Gehirn12deutlich zu reduzieren. Neben der CNS lokalisieren Sie alle Synucleins in andere Gewebe im gesamten Körper13,14,15.
Wegen seiner etablierten genetischen Verbindungen zur Neurodegeneration16,17wird aSyn gehört zu den besten der drei Synucleins untersucht. Perez-Labor hat lange daran gearbeitet, die um normalen funktionelle Aktivitäten des aSyn, vor allem in der CNS11,12,18,19,20,21zu definieren, 22,23 und seit kurzem in peripheren Geweben24,25. Unter diesen war die Entdeckung, dass aSyn spielt eine wichtige regulatorische Rolle in anregenden PP2Ac Aktivität19. PP2A Aktivität trägt allgemein zur normalen Gehirnfunktion, einschließlich der für die Regulierung der Dopamin-Produktion-26. Die PP2A Holoenzym besteht aus drei unabhängigen Untereinheiten, die katalytische Untereinheit C PP2Ac, ein Baugerüst A-Untereinheit und eines mehrere verschiedene regulatorische/Ausrichtung B Untereinheiten, die helfen, PP2A zu bestimmten subzellulären Microdomains, wodurch PP2A lokalisieren funktionale Diversität27. Belege dafür, dass aSyn Interaktionen mit PP2Ac zum die Phosphatase-Aktivität in Vitro und in Vivo12,19,21,23Beitrag, 25. Wenn aSyn sammelt sich in Protein-Aggregate, wie bei der Lewy Körper Form innen Neuronen von Parkinson und Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Gewebe mit aggregierten aSyn haben PP2Ac Aktivität23,25vermindert, wenn Ebenen der löslichen aSyn verringern. Angesichts der Tatsache, dass alle drei Synucleins deutliche Homologie28 haben (aSyn teilt 66 % Identität mit bSyn und 56 % mit gSyn) und die aSyn trägt zur Aktivierung des PP2Ac, es wurde die Hypothese aufgestellt, dass alle Mitglieder der Adelsfamilie Protein Synuclein möglicherweise Steigerung der PP2Ac Aktivität, zumindest in Vitro. Um dies zu beurteilen, wurde als Reaktion auf rekombinante aSyn, bSyn und gSyn mit einem einfachen farbmetrischen Assay, modelliert nach der Methode von Fathi Et Al. PP2Ac Aktivität gemessen. 29. diese Methode und die neuen Erkenntnisse sind hier aufgeführt.

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Calciumchlorid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Konzentriertes HCl&nbsp; &nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniummolybdat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>Malachitgrünoxalatsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Threonin Phosphopeptid (KRpTIRR)</td><td>New England Peptide LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 ( Kaliumphosphat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane PP2A C Untereinheit</td><td>Cayman Chemical</td><td></td><td></td>10011237</tr><tr><td>Rekombinantes humanes &alpha;-Synuclein</td><td>rPeptid</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes &beta;-Synuclein</td><td>rPeptid</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes &gamma;-Synuclein</td><td>rPeptid</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>aSyn Antikörper C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>bSyn Antikörper EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>gSyn Antikörper E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Entsalzungssäulen, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Spectrum Plate Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>51118650</tr><tr><td>pH-Messgerät&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinante α-β und γ-synucleins stimulieren protein phosphatase 2a katalytische untereinheit aktivität in zelle frei assays

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) und γ-Synuclein (gSyn) sind Mitglieder einer konservierten Familie von Chaperon-ähnliche Proteine, die hoch in vertebrate neuronalen Geweben exprimiert werden. Von den drei Synucleins hat nur aSyn stark bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Demenz mit Lewy-Körpern und Multiple System Atrophie verwickelt. In der Untersuchung normal aSyn Funktion, zeigen Daten, dass aSyn stimuliert die Aktivität der katalytischen Untereinheit der eine reichlich ausgedrückt dephosphorylating Enzym, PP2Ac in Vitro und in Vivo. Vorherige Daten zeigen, dass aSyn Aggregation im menschlichen Gehirn PP2Ac Aktivität in Regionen mit Lewy-Körper Pathologie, reduziert in der löslichen aSyn unlöslich geworden ist. Da alle drei Synucleins beträchtliche Homologie in der Aminosäure-Sequenzen haben, wurden jedoch Experimente entwickelt, um zu testen, ob alle PP2Ac Aktivität modulieren kann. Mit rekombinanten Synucleins und rekombinante PP2Ac Protein, wurde Aktivität von Malachitgrün farbmetrischen Assay bewertet. Daten zeigten, dass alle drei rekombinante Synucleins PP2Ac Aktivität in zellfreien Assays stimuliert, Anhebung der Möglichkeit, dass die konservierte Homologie zwischen Synucleins alle drei homologen, mit der Fähigkeit verleihen kann zu binden und die PP2Ac zu aktivieren. Co-Immunopräzipitation Daten zufolge jedoch wahrscheinlich PP2Ac Modulation durch endogene Wechselwirkungen zwischen aSyn und PP2Ac in Vivoauftritt.

Proteinfunktion und Aktivität können durch post-translationalen Modifikationen, z. B. Phosphorylierung verändert werden. Viele Proteine können durch eine Kinase phosphoryliert werden, oder durch eine Phosphatase Rezeptorsignals. Im Falle von Protein Phosphatase 2A (PP2A), diese speziellen Phosphatase erleichtert die Dephosphorylation von Serin und Threonin Rückstände auf einer Vielzahl von Phosphoproteine. Abnorme PP2A Aktivität kann zu Dysregulation der Proteinfunktion führen, tritt bei vielen Krankheiten, einschließlich der Parkinson-Krankheit wo aSyn hyperphosphoryliertem, werden kann und bei der Alzheimer-Krankheit wo Tau-Protein hyperphosphoryliertem werden kann. Dies lieferte die Rechtfertigung für die Optimierung eine interne Verfahren, um schnell PP2Ac Aktivität zu bewerten und festzustellen, ob abnormale PP2Ac Aktivität zu zellulären Dysfunktion führen kann.
Mit Hilfe dieser zellfreie farbmetrischen Assay, PP2Ac Aktivität gemessen wurde, durch die Menge der freien PO4 Quantifizierung gespalten aus dem pT-Substrat (Abbildung 1A) und im Vergleich zu bekannten pikolomaren Mengen von PO4 in der Standardkurve (Abbildung 1 b ). PP2Ac Aktivität war auch als Reaktion auf 0.0, 0.1, 0,5, 1,0 und 2,0 µM Synucleins (Abbildung 1A), im Vergleich zum Ausgangswert PP2Ac Aktivität keine zusätzlichen Synuclein (bei den großen Pfeil in Abbildung 1A) gemessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg"> Abbildung 1 : PP2A Aktivierung durch rekombinante Synucleins ist im Vergleich zum bekannten Niveau von Phosphat in den Standards gemessen. (A) aSyn, bSyn und gSyn wurden in einem Bereich von 0 - 2 µM Proteinkonzentrationen, um im Vergleich zu 0 - 2400 Pmol PO4 Standards. (B) eine Standardkurve für Malachitgrün-PP2Ac-Assay wurde generiert, um bekannte Mengen an Phosphat bieten gegen die Werte, die in experimentellen Bedingungen berechnet werden können. In allen Fällen wenn PP2Ac Aktivität erhöht, die Menge der freien PO4 gespalten aus dem pT-Substrat erhöht und erzeugt eine dunklere grüne Farbe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Synucleins zu PP2Ac in der ersten Inkubationsschritt kostenlos PO4 gemessen, so bekunden, erhöhten PP2Ac Aktivität erhöhen könnte. Die statistische Auswertung nach vielen Wiederholungen zeigen, dass alle drei rekombinante Synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac Aktivität (Abbildung 2) deutlich erhöhen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Änderungen in der Höhe von löslichen zellulären Synucleins PP2Ac Aktivität verändern können; und somit kann die zelluläre Homöostase auswirken. Es ist nicht bekannt, jedoch, wenn alle drei Synucleins zur Aktivierung des PP2Ac in Vivo tragen, wenn Daten in Abbildung 3 deuten darauf hin, dass wahrscheinlich aSyn trägt zur PP2Ac Aktivität in Vivo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg"> Abbildung 2 : PP2Ac Aktivität wird angeregt durch alle drei Synucleins. Grafische Darstellung der PP2Ac Aktivierung als Reaktion auf unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinanten aSyn, bSyn oder gSyn wird angezeigt. Alle drei rekombinante Synucleins stimuliert PP2Ac Aktivität. aSyn in die meisten Experimente schien etwas stärker, obwohl ANOVAs mit Statistiksoftware durchgeführt insgesamt bemerkenswert ähnlich waren. Darstellung der Mittelwert ± SEM von 4-9 unabhängigen Experimenten. ns, nicht signifikant; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um zu beurteilen, welche Synuclein(s) mit PP2Ac im Gehirn interagieren können, wurden co-Immunopräzipitation (Co-IP) Assays mit Wildtyp-Maus-Gehirn und PP2Ac-spezifischer-Antikörper, 1 6 durchgeführt. Proteine wurden dann getrennt durch SDS-PAGE und Flecken waren für aSyn, PP2Ac, bSyn und gSyn mit etablierten Methoden19sondiert. Rekombinante Synuclein Steuerelemente zeigen aSyn, bSyn und gSyn Antikörperbesonderheit (Abb. 3A). Co-IP-Daten zeigen, dass die großen Synuclein mit PP2Ac im Gehirn verbunden aSyn, war, wie viel weniger bSyn in der co-IP (Abb. 3 b fiel), und keine gSyn in der Co-IP (Daten nicht gezeigt kam). Dies deutet auf eine besondere Rolle für die endogene aSyn bei der Regulation des PP2Ac im Gehirn. Es wirft auch die Möglichkeit, dass PP2Ac Modulation mit bSyn Therapien Potenzial PP2A Aktivität bei Patienten mit Synucleinopathy, Wiederherstellung haben könnte, wie bSyn als bekannt ist Nonamyloidogenic noch wie gezeigt hier können stimulieren PP2Ac30, 31.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Wechselwirkung des PP2Ac mit endogenen Synucleins im Mäusegehirn. (A) rekombinante aSyn, bSyn und gSyn wurden mit spezifischen Antikörpern Synuclein sondiert, wie unten beschrieben. (B) Using Maus Gehirn Homogenat, Co-IP mit Antikörper 1 6, durchgeführt wurde, dann Proben auf Immunoblots analysiert wurden. Daten werden angezeigt, für PP2Ac, aSyn und bSyn, aber nicht für gSyn, was nicht Co-IP mit PP2Ac Tat. Start Beispiele zeigen die relativen Pegel der PP2Ac (Spur 1) aSyn (Bahn 4) und bSyn (Spur 7) in der ersten Homogenates. End-Beispiele zeigen die übrigen Ebenen von PP2Ac (Bahn 2) aSyn (Bahn 5) und bSyn (Bahn 8) in Homogenates nach der 1-6 PP2Ac Co-IP. Erhebliches Maß an PP2Ac wurden Immunoprecipitated mit 1 6 Antikörper (Bahn 3), der auch reichlich aSyn (Bahn 6, Pfeil) aber sehr wenig bSyn (Bahn 9, um schwache bSyn Signal am Pfeil zeigen stark überbelichtet) brachte. * Sternchen und Klammern markieren die unspezifische Signale auf Flecken. Siehe die Tabelle der Materialien für Details verwendeten Antikörper. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll zeigt, wie die Aktivität des rekombinanten Proteins Phosphatase 2A katalytische Untereinheit (PP2Ac) Messen in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein, β-Synuclein oder γ-Synuclein Proteine mit einem einfachen farbmetrischen Assay. Feststellungen zur Spezifität der α-Synuclein in Richtung PP2Ac zeigen wir im Gehirn der Maus.

Rekombinante α-β und γ-Synucleins stimulieren Protein Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Aktivität in Zelle frei Assays

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

Rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine stimulieren die katalytische Aktivität der Proteinkinase 2A in zellfreien Assays. Hallo, mein Name ist Sovanarak Lek. Ich bin Medizinstudent am Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.In diesem Video werde ich einen zweiwegfarbmetrischen Proteinphosphatase-Assay unter Verwendung rekombinanter Synuclein-Proteine demonstrieren. Herstellung von Puffern und Reagenzien. Herstellung des p-Nitrophenylphosphat-Puffers.Zur Herstellung von 50 ml pNPP-Puffer Trizma-Basis in 25 ml ultrareinem, deionisiertem Wasser in einem Becher lösen. Einen sauberen Rührstab hinzufügen und auf einen Magnetrührer stellen. Nach dem Auflösen des Trizmas unter weiterem Rühren Calciumchlorid zugeben.Den pH-Wert auf 7,0 einstellen. Die Lösung in einen Messzylinder überführen. Das endgültige Gesamtvolumen mit ultrareinem entionisiertem Wasser auf 50 ml auffüllen.Zubereitung der Malachitgrün-Lösung. Die Malachitgrün-Lösung erfordert drei Lösungen, Teil A, B und C. Lösung A ist eine viermolare Salzsäure. Lösung B ist eine Kombination aus Ammoniummolybdat und Lösung A. Lösung C ist ein 0,045 %iges Malachitgrün-Oxalat-Salz.Zur Herstellung von Lösung D mischen Sie ein Teil B mit drei Teilen C im Verhältnis eins zu drei. Rühren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Schließlich filtrieren Sie Lösung D durch eine 22 µm-Membran und lagern Sie bei vier Grad Celsius.Vor Licht schützen. Herstellung des Aktivators. Der Aktivator ist eine einprozentige Tween-20-Lösung.Pipettieren Sie 10 Mikroliter Tween 20 in 990 Mikroliter ultrareines, deionisiertes Wasser. Vortexen Sie die Lösung, bis sich Tween 20 vollständig gelöst hat. Herstellung der Arbeitslösung aus Malachitgrün und Tween 20.Fügen Sie den Aktivator in einem Verhältnis von eins zu 100 der Lösung D hinzu. Vorbereitung des Threonin-Phosphopeptids. Um eine 2-mM-pT-Stammlösung herzustellen, geben Sie 550 Mikroliter ultrareines, deionisiertes Wasser zu einem Milligramm pT hinzu.Vortexen Sie, bis das Phosphopeptid vollständig gelöst ist. Zum sofortigen Gebrauch auf Eis stellen. Überschüssige pT-Aliquote bei minus 20 Grad Celsius lagern.Präparation von Synuclein. Ein Milligramm Synuclein in einem Milliliter ultrareinem, deionisiertem Wasser unter Erreichen einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter resuspendieren. Vorsichtig wirbeln, um aufzulösen.Unmittelbar verwenden und ungenutzte Aliquote bei minus 80 Grad Celsius lagern. Herstellung von Phosphat-Standards. Phosphat-Standards, erster Schritt.Zur Herstellung einer 1-mM-Phosphat-Stammlösung Kaliumphosphat in einem Becher mit Rührfisch in ultrareinem, deionisiertem Wasser auflösen. In einen Messzylinder umfüllen und das Endvolumen auf 100 mils auffüllen. Dies ergibt eine 10-mM-Lösung.Filtern Sie die gesamte Lösung mithilfe einer großen Spritze durch einen 22-Mikrometer-Filter. Verdünnen Sie diese im Verhältnis 1 zu 100, um eine 1 mM Phosphatlösung herzustellen, die als Assay-Standard verwendet wird. Phosphat-Standard, Schritt zwei.Geben Sie die entsprechende Menge Phosphat sowie ultrareines, deionisiertes Wasser gemäß Tabelle in 1,5-mL-Röhrchen. Dadurch erhält man Röhrchen mit 150, 300, 600, 1.200 und 2.400 pmol Phosphat. Lagern Sie die Aliquote bei minus 20 Grad Celsius.PP2A-Aktivitäts-Assay. Bereiten Sie den PP2A-Assay in 1,5-ml-Röhrchen auf Eis vor. Geben Sie 43 µL pNPP-Puffer hinzu.Fügen Sie ein Mikroliter humanes rekombinantes PP2Ac hinzu. Fügen Sie Synuclein hinzu und inkubieren Sie PP2A zusammen mit Synuclein 30 Minuten lang auf einem Nutator bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend 16 Mikroliter 2 mM pT dazu.30 Minuten bei 30 Grad Celsius im Wasserbad inkubieren. Auf einer 96-Well-Platte mit flachem Boden jeweils 25 Mikroliter der Phosphatstandards in Duplikat von niedrig bis hoch zugeben. Mit der Pipette jeweils 24 Mikroliter der PP2A-Assays in Duplikat auf dieselbe 96-Well-Platte mit den Standards übertragen.Pipettieren Sie 75 Mikroliter Lösung D, die Tween 20 enthält, in jede Probe und jeden Standard. Nach Zugabe von MGT wird eine Farbänderung in den Vertiefungen sichtbar, wenn freie Phosphate vorhanden sind. Photometrische Analyse.Analysieren Sie mit einem Spektrophotometer, das auf 630 Nanometer eingestellt ist. Repräsentative Ergebnisse. Hier sehen wir einen repräsentativen PP2A-Assay und den Graphen, der die Standardkurve veranschaulicht.Auf der linken Seite befinden sich die Phosphatstandards. Je mehr Phosphat die Vertiefungen enthalten, desto dunkler ist der Grünton. Auf der rechten Seite sehen wir PP2A, das mit Alpha-, Beta- oder Gamma-Synuclein bei unterschiedlichen molaren Konzentrationen inkubiert wurde.H&ouml;here Konzentrationen waren wirksamer bei der Stimulierung der katalytischen Untereinheit von PP2A. Hier sehen wir die grafische Darstellung der PP2A-Aktivit&auml;t als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein. Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein erwiesen sich alle als signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivit&auml;t bei einer Konzentration von ein bis zwei Mikromolar.Nur Alpha-Synuclein und Beta-Synuclein waren bei einer Konzentration von 0,5 Mikromolar signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivität. Abbildung drei zeigt die Wechselwirkung von PP2Ac mit endogenen Synucleinen im Maushirn. In A sind rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine als positive Kontrollen dargestellt.In B wurde eine Co-Immunpräzipitation mit dem PP2Ac-spezifischen Antikörper 1D6 durchgeführt, der PP2Ac heruntergezogen hat und außerdem beträchtliche Mengen des interagierenden Alpha-Synucleins, jedoch nahezu kein Beta-Synuclein. Kein Gamma-Synuclein wurde gemeinsam mit PP2Ac in der Co-Immunpräzipitation heruntergezogen. Diese Co-Immunpräzipitationsdaten legen nahe, dass Alpha-Synuclein der endogene Modulator von PP2Ac in vivo ist.Wir möchten uns bei allen bedanken, die uns bei der Erstellung dieses Videos unterstützt haben. Abschließend ist dies Ruth Perez. Sonavarak Lek.Javier Vargas. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg. Auf Wiedersehen und viel Glück.

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Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Leishmania Translational Extract (LTE) ist ein eukaryotisches zellfreies Proteinexpressionssystem, das aus dem einzelligen Parasiten Leishmania tarentolae gewonnen wird. Dieses optimierte Protokoll macht LTE einfach und kostengünstig in der Herstellung. Es eignet sich für verschiedene Anwendungen, die sich auf die multiparallele Expression und Untersuchung komplexer eukaryotischer Proteine und ihrer Wechselwirkungen konzentrieren.

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

Erfahren Sie, wie rekombinante α-, β- und γ-Synucleine die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 2A in zellfreien Assays stimulieren. Diese Methode zeigt die Spezifität von α-Synuclein für PP2Ac im Mausgehirn.

Rekombinante α-β und γ-Synucleins stimulieren Protein Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Aktivität in Zelle frei Assays

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