Rekombinante α-β und γ-Synucleins stimulieren Protein Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Aktivität in Zelle frei Assays
13. August 2017
Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll zeigt, wie die Aktivität des rekombinanten Proteins Phosphatase 2A katalytische Untereinheit (PP2Ac) Messen in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein, β-Synuclein oder γ-Synuclein Proteine mit einem einfachen farbmetrischen Assay. Feststellungen zur Spezifität der α-Synuclein in Richtung PP2Ac zeigen wir im Gehirn der Maus.
Rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine stimulieren die Aktivität der katalytischen Untereinheiten der Proteinphosphatase 2A in zellfreien Assays. Hallo, mein Name ist Sovanarak Lek. Ich bin Medizinstudent am Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L.Foster School of Medicine.
In diesem Video werde ich einen Zwei-Wege-Farbmetrik-Assay für Proteinphosphatase unter Verwendung rekombinanter Synucleinproteine demonstrieren. Vorbereitung von Puffern und Radianten. Zubereitung von p-Nitrophenolphosphat-Puffer.
Zur Herstellung von 50 mil pNPP-Puffer wird die Trizma-Base in 25 mil ultrareinem deionisiertem Wasser in einem Becherglas gelöst. Einen sauberen Rührstab darauf geben und auf einen Magnetrührer legen. Sobald sich Trizma aufgelöst hat, fügen Sie Calciumchlorid unter ständigem Rühren hinzu.
Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein. Übertragen Sie die Lösung in einen Messzylinder. Bringen Sie das endgültige Gesamtvolumen mit ultrareinem entionisiertem Wasser auf 50 mil.
Zubereitung der malachitgrünen Lösung. Für die grüne Malachitlösung werden drei Lösungen benötigt, die Teile A, B und C. Lösung A ist viermolare Salzsäure. Lösung ist eine Kombination aus Ammoniummolybdat und Lösung A. Lösung C ist 0,045% Malachitgrünoxalatsalz.
Zur Herstellung von Lösung D mischen Sie einen Teil B mit drei Teilen C im Verhältnis eins zu drei. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Zum Schluss die Lösung D durch eine 22-Mikrometer-Membran filtrieren und bei vier Grad Celsius lagern.
Vor Licht schützen. Vorbereitung des Aktivators. Aktivator ist eine einprozentige Tween 20 Lösung.
Pippette 10 Mikroliter Tween 20 in 990 Mikroliter ultrareines deionisiertes Wasser. Vortexen, bis sich Tween 20 vollständig aufgelöst hat. Zubereitung Malachit Grün plus Tween 20 Arbeitslösung.
Geben Sie den Aktivator zu Lösung D in einem Verhältnis von eins bis 100. Zubereitung von Threonin-Phosphopeptid. Um eine zwei mM pT-Stammlösung herzustellen, fügen Sie 550 Mikroliter ultrareines deionisiertes Wasser zu einem Milligramm pT hinzu.
Vortexen, bis das Phosphopeptid vollständig aufgelöst ist. Auf Eis legen, um es sofort zu verwenden. Lagern Sie zusätzliche pT-Aliquoten bei minus 20 Grad Celsius.
Synuclein-Vorbereitung. Ein Milligramm Synuclein wird in mil ultrareinem entionisiertem Wasser in einer Endkonzentration von einem Milligramm pro mil resuspendiert. Sanft vortexen, um sich aufzulösen.
Sofort verwenden und unbenutzte Aliquots bei minus 80 Grad Celsius lagern. Erstellung von Phosphatstandards. Phosphatstandards Schritt eins.
Zur Herstellung von 1 mM Phosphat-Stammlösung Kaliumphosphat in ultrareinem entionisiertem Wasser in einem Becherglas mit einem Rührstab auflösen. In den Teilstrichzylinder umfüllen und das Endvolumen auf 100 mils bringen. Hierbei handelt es sich um eine 10 mM Lösung.
Filtrieren Sie die gesamte Lösung mit einer großen Spritze durch einen 22-Mikros-Filter. Verdünnen Sie diese auf 1 bis 100, um 1 mM Phosphatlösung herzustellen, die für Assay-Standards verwendet wird. Phosphatstandards Schritt zwei.
Geben Sie die entsprechende Menge Phosphat plus ultrareines deionisiertes Wasser in 1,5 mils Röhrchen gemäß Tabelle. Dies ergibt Röhrchen mit 150, 300, 600, 1, 200 und 2.400 pmol Phosphat. Und lagern Sie Aliquots bei minus 20 Grad Celsius.
PP2A-Aktivitäts-Assay. Bereiten Sie den PP2A-Assay in 1,5-mil-Röhrchen auf Eis vor. Fügen Sie 43 Mikroliter pNPP-Puffer hinzu.
Fügen Sie einen Mikroliter humanes rekombinantes PP2Ac hinzu. Fügen Sie Synuclein hinzu und inkubieren Sie PP2A plus Synuclein 30 Minuten auf einem Nutator bei vier Grad Celsius. Fügen Sie als nächstes 16 Mikroliter 2mM pT hinzu.
10 Minuten bei 30 Grad Celsius im Wasserbad inkubieren. Geben Sie auf einer 96-Well-Platte mit flachem Boden 25 Mikroliter jedes Phosphatstandards in doppelter Ausführung von niedrig nach hoch. Pipettieren Sie 24 Mikroliter jedes PP2A-Assays in doppelter Ausführung auf dieselbe 96-Well-Platte mit den Standards.
Pipettieren Sie 75 Mikroliter Lösung D mit Tween 20 auf jede Probe und jeden Standard. Nach der Zugabe von MGT sehen Sie eine Farbänderung in den Vertiefungen, wenn freie Phosphate vorhanden sind. Photometrische Analyse.
Analysieren Sie mit einem Spektralphotometer, das auf 630 Nanometer eingestellt ist. Repräsentative Ergebnisse. Hier haben wir einen repräsentativen PP2A-Assay und die Grafik, die die Standardkurve zeigt.
Auf der linken Seite sind die Phosphatstandards zu sehen. Je mehr Phosphat die Vertiefungen enthalten, desto dunkler ist der Grünton. Rechts haben wir PP2A, das mit Alpha-, Beta- oder Gamma-Synucleinen in unterschiedlichen molaren Konzentrationen inkubiert wurde.
Höhere Konzentrationen waren wirksamer bei der Stimulierung der Aktivität der katalytischen PP2A-Untereinheiten. Hier sehen wir die grafische Darstellung der PP2A-Aktivität als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein. Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein waren alle signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivität bei Konzentrationen von ein bis zwei Mikromolaren.
Nur Alpha-Synuclein und Beta-Synuclein waren signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivität bei einer Konzentration von 0,5 Mikromolaren. Abbildung drei zeigt die Interaktion von PP2Ac mit endogenen Synucleinen im Gehirn von Mäusen. In A sind rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine als Positivkontrollen dargestellt.
In B wurde eine Co-Immunpräzipitation mit dem PP2Ac-spezifischen Antikörper 1D6 durchgeführt, der PP2Ac abbaute und auch beträchtliches interagierendes Alpha-Synuclein, aber fast kein Beta-Synuclein abbaute. In der Co-Immunpräzipitation kam es nicht zu einem Gamma-Synuclein mit PP2Ac. Diese Co-Immunpräzipitationsdaten deuten darauf hin, dass Alpha-Synuclein der endogene Modulator von PP2Ac in vivo ist.
Wir möchten uns bei allen bedanken, die uns bei der Erstellung dieses Videos geholfen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich um Ruth Perez handelt. Sonavarak Lek.
Javier Vargas. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg. Auf Wiedersehen und viel Glück.
Übersicht
In dieser Veröffentlichung wird ein Protokoll zur Messung der Aktivität der katalytischen Untereinheit der rekombinanten Proteinphosphatase 2A (PP2Ac) in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein-, β-Synuclein- oder γ-Synuclein-Proteine mittels einer farbmetrischen Assaymethode vorgestellt. Die Ergebnisse deuten auf eine Spezifität von α-Synuclein gegenüber PP2Ac im Maushirn hin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist ein entscheidendes Enzym, das an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt ist.
- Synucleine sind eine Proteinfamilie, die mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird.
- Das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Synucleinen und PP2A kann Aufschluss über ihre Rolle bei der neuronalen Funktion geben.
- Farbmessassays sind wirksam zur Bestimmung der Enzymaktivität in vitro.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beurteilung der PP2Ac-Aktivität in Gegenwart von Synucleinen.
- Beurteilung der Spezifität von α-Synuclein gegenüber PP2Ac.
- Vorlage einer detaillierten Methodik für Forschende auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Herstellung der Puffer und Reagenzien für den farbmetrischen Assay.
- Inkubation von PP2Ac mit variierenden Konzentrationen von Synucleinen.
- Messung der Enzymaktivität mittels Spektralphotometer.
- Co-Immunpräzipitation zur Beurteilung von Wechselwirkungen in Maushirnproben.
Hauptergebnisse
- Alle drei Synucleine (α, β, γ) stimulierten die PP2Ac-Aktivität bei spezifischen Konzentrationen.
- α-Synuclein zeigte die höchste Spezifität und Wechselwirkung mit PP2Ac.
- Die Co-Immunpräzipitation wies α-Synuclein als primären endogenen Modulator von PP2Ac aus.
- Farbmetrische Veränderungen korrelierten mit den Phosphatgehalten im Assay.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll eignet sich zur Untersuchung der PP2Ac-Aktivität.
- α-Synuclein ist ein bedeutender Modulator der PP2Ac in vivo.
- Diese Studie vertieft das Verständnis der Synuclein-Interaktionen in der Neurobiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Studie etabliert einen zellfreien Assay zur Bewertung der synucleinvermittelten Modulation der PP2Ac-Aktivität und stellt damit ein mechanistisches Werkzeug für die Zielvalidierung in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen bereit. Indem gezeigt wird, dass alle drei Synuclein-Isoformen die PP2Ac in vitro stimulieren können, unterstützt die Methode die Überprüfung von Hypothesen zur konservierten funktionellen Homologie und deren Auswirkungen auf die Entlastung von Signalwegen. Die Co-Immunpräzipitationsdaten verfeinern zudem die Zielgenauigkeit, indem sie α-Synuclein als endogenen Modulator in vivo hervorheben, was bei der Priorisierung therapeutischer Hypothesen hilft und die mechanistische Unschärfe in der frühen Entdeckungsphase verringert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich der Wechselwirkungen zwischen Synuclein und PP2Ac bei Neurodegeneration.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung, indem geklärt wird, ob beobachtete Effekte auf einer direkten Enzymmodulation oder indirekten Wegen beruhen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Beurteilung des Target-Vertrauens durch den Vergleich isoformspezifischer Aktivitäten in einem kontrollierten, reproduzierbaren System.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet einen standardisierten, quantitativen Endpunkt (Phosphatfreisetzung mittels Malachitgrün-Assay) zur Beurteilung der Wirkung von Verbindungen auf die PP2Ac-Aktivität.
- Operativer Wert: Verwendet rekombinante Proteine und definierte Puffer, um die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen verschiedenen Laboren und bei Screening-Kampagnen sicherzustellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Erstellung validierter biologischer Werkzeuge (z. B. Dosis-Wirkungs-Kurven) für die nachgeschaltete Bewertung von Verbindungen und die Bestätigung von Hits.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verknüpft in vitro-Befunde mit endogenen Interaktionen, die im Maushirn beobachtet wurden, und unterstützt so die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Risikominderung bei Target-Engagement-Strategien, indem zwischen unspezifischer in vitro-Aktivität und selektiver in vivo-Modulation unterschieden wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Auswahl präklinischer Modelle, indem angegeben wird, welche Synuclein-Isoformen in physiologischen Kontexten voraussichtlich PP2Ac ansprechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Zielvalidierung sowie die Identifizierung von Leitsubstanzen, indem er quantitative, mechanismenbasierte Messgrößen liefert, die über Go/No-Go-Entscheidungen entscheiden, bevor erhebliche Investitionen in die Optimierung von Verbindungen getätigt werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem dosisabhängige Messungen der PP2Ac-Aktivierung durch Synuclein-Isoformen ermöglicht werden.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Reagenzherstellung und einen farbmetrischen Output, der mit plattenbasierten Formaten kompatibel ist.
- Analytik: Erzeugt quantitative Phosphatmessungen, die den Vergleich der Potenz und Wirksamkeit von Modulatoren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem bestätigt wird, dass beobachtete in-vitro-Effekte mit endogenen Interaktionen im Gehirngewebe übereinstimmen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung der Wirkung von Modulatoren auf PP2Ac, die nicht nur für Synucleine, sondern auch für andere regulatorische Proteine oder kleine Moleküle anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Modulation von Zielstrukturen, indem direkte, quantitative Daten zur Enzymaktivität bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch detaillierte Angaben zur Reagenzherstellung und definierte Inkubationsbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Abhängigkeit von indirekten oder korrelativen Biomarkern verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf mechanistischen Nachweisen der Signalwegaktivierung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinbiochemie und Enzymassay-Techniken, einschließlich des Umgangs mit rekombinanten Proteinen und der Nachweis von Phosphorylierungen.
- Setzt den Zugang zu spektrophotometrischen Geräten voraus, die Absorptionsmessungen bei 630 nm ermöglichen, sowie temperaturgesteuerte Inkubationssysteme.
- Erfordert eine standardisierte Reagenzherstellung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg (z. B. Malachitgrün-Lösung, pNPP-Puffer), um die Konsistenz des Assays sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn der Assay auf nicht-neuronale Modellsysteme oder alternative PP2Ac-Quellen ausgeweitet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit frischer Phosphopeptid-Substrate und eine strikte Temperaturkontrolle während der Inkubationsschritte.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
