Rekombinante α-β und γ-Synucleins stimulieren Protein Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Aktivität in Zelle frei Assays
13. August 2017
Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll zeigt, wie die Aktivität des rekombinanten Proteins Phosphatase 2A katalytische Untereinheit (PP2Ac) Messen in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein, β-Synuclein oder γ-Synuclein Proteine mit einem einfachen farbmetrischen Assay. Feststellungen zur Spezifität der α-Synuclein in Richtung PP2Ac zeigen wir im Gehirn der Maus.
Rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine stimulieren die katalytische Aktivität der Proteinkinase 2A in zellfreien Assays. Hallo, mein Name ist Sovanarak Lek. Ich bin Medizinstudent am Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.
In diesem Video werde ich einen zweiwegfarbmetrischen Proteinphosphatase-Assay unter Verwendung rekombinanter Synuclein-Proteine demonstrieren. Herstellung von Puffern und Reagenzien. Herstellung des p-Nitrophenylphosphat-Puffers.
Zur Herstellung von 50 ml pNPP-Puffer Trizma-Basis in 25 ml ultrareinem, deionisiertem Wasser in einem Becher lösen. Einen sauberen Rührstab hinzufügen und auf einen Magnetrührer stellen. Nach dem Auflösen des Trizmas unter weiterem Rühren Calciumchlorid zugeben.
Den pH-Wert auf 7,0 einstellen. Die Lösung in einen Messzylinder überführen. Das endgültige Gesamtvolumen mit ultrareinem entionisiertem Wasser auf 50 ml auffüllen.
Zubereitung der Malachitgrün-Lösung. Die Malachitgrün-Lösung erfordert drei Lösungen, Teil A, B und C. Lösung A ist eine viermolare Salzsäure. Lösung B ist eine Kombination aus Ammoniummolybdat und Lösung A. Lösung C ist ein 0,045 %iges Malachitgrün-Oxalat-Salz.
Zur Herstellung von Lösung D mischen Sie ein Teil B mit drei Teilen C im Verhältnis eins zu drei. Rühren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Schließlich filtrieren Sie Lösung D durch eine 22 µm-Membran und lagern Sie bei vier Grad Celsius.
Vor Licht schützen. Herstellung des Aktivators. Der Aktivator ist eine einprozentige Tween-20-Lösung.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter Tween 20 in 990 Mikroliter ultrareines, deionisiertes Wasser. Vortexen Sie die Lösung, bis sich Tween 20 vollständig gelöst hat. Herstellung der Arbeitslösung aus Malachitgrün und Tween 20.
Fügen Sie den Aktivator in einem Verhältnis von eins zu 100 der Lösung D hinzu. Vorbereitung des Threonin-Phosphopeptids. Um eine 2-mM-pT-Stammlösung herzustellen, geben Sie 550 Mikroliter ultrareines, deionisiertes Wasser zu einem Milligramm pT hinzu.
Vortexen Sie, bis das Phosphopeptid vollständig gelöst ist. Zum sofortigen Gebrauch auf Eis stellen. Überschüssige pT-Aliquote bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Präparation von Synuclein. Ein Milligramm Synuclein in einem Milliliter ultrareinem, deionisiertem Wasser unter Erreichen einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter resuspendieren. Vorsichtig wirbeln, um aufzulösen.
Unmittelbar verwenden und ungenutzte Aliquote bei minus 80 Grad Celsius lagern. Herstellung von Phosphat-Standards. Phosphat-Standards, erster Schritt.
Zur Herstellung einer 1-mM-Phosphat-Stammlösung Kaliumphosphat in einem Becher mit Rührfisch in ultrareinem, deionisiertem Wasser auflösen. In einen Messzylinder umfüllen und das Endvolumen auf 100 mils auffüllen. Dies ergibt eine 10-mM-Lösung.
Filtern Sie die gesamte Lösung mithilfe einer großen Spritze durch einen 22-Mikrometer-Filter. Verdünnen Sie diese im Verhältnis 1 zu 100, um eine 1 mM Phosphatlösung herzustellen, die als Assay-Standard verwendet wird. Phosphat-Standard, Schritt zwei.
Geben Sie die entsprechende Menge Phosphat sowie ultrareines, deionisiertes Wasser gemäß Tabelle in 1,5-mL-Röhrchen. Dadurch erhält man Röhrchen mit 150, 300, 600, 1.200 und 2.400 pmol Phosphat. Lagern Sie die Aliquote bei minus 20 Grad Celsius.
PP2A-Aktivitäts-Assay. Bereiten Sie den PP2A-Assay in 1,5-ml-Röhrchen auf Eis vor. Geben Sie 43 µL pNPP-Puffer hinzu.
Fügen Sie ein Mikroliter humanes rekombinantes PP2Ac hinzu. Fügen Sie Synuclein hinzu und inkubieren Sie PP2A zusammen mit Synuclein 30 Minuten lang auf einem Nutator bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend 16 Mikroliter 2 mM pT dazu.
30 Minuten bei 30 Grad Celsius im Wasserbad inkubieren. Auf einer 96-Well-Platte mit flachem Boden jeweils 25 Mikroliter der Phosphatstandards in Duplikat von niedrig bis hoch zugeben. Mit der Pipette jeweils 24 Mikroliter der PP2A-Assays in Duplikat auf dieselbe 96-Well-Platte mit den Standards übertragen.
Pipettieren Sie 75 Mikroliter Lösung D, die Tween 20 enthält, in jede Probe und jeden Standard. Nach Zugabe von MGT wird eine Farbänderung in den Vertiefungen sichtbar, wenn freie Phosphate vorhanden sind. Photometrische Analyse.
Analysieren Sie mit einem Spektrophotometer, das auf 630 Nanometer eingestellt ist. Repräsentative Ergebnisse. Hier sehen wir einen repräsentativen PP2A-Assay und den Graphen, der die Standardkurve veranschaulicht.
Auf der linken Seite befinden sich die Phosphatstandards. Je mehr Phosphat die Vertiefungen enthalten, desto dunkler ist der Grünton. Auf der rechten Seite sehen wir PP2A, das mit Alpha-, Beta- oder Gamma-Synuclein bei unterschiedlichen molaren Konzentrationen inkubiert wurde.
Höhere Konzentrationen waren wirksamer bei der Stimulierung der katalytischen Untereinheit von PP2A. Hier sehen wir die grafische Darstellung der PP2A-Aktivität als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein. Alpha-Synuclein, Beta-Synuclein und Gamma-Synuclein erwiesen sich alle als signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivität bei einer Konzentration von ein bis zwei Mikromolar.
Nur Alpha-Synuclein und Beta-Synuclein waren bei einer Konzentration von 0,5 Mikromolar signifikante Stimulatoren der PP2A-Aktivität. Abbildung drei zeigt die Wechselwirkung von PP2Ac mit endogenen Synucleinen im Maushirn. In A sind rekombinante Alpha-, Beta- und Gamma-Synucleine als positive Kontrollen dargestellt.
In B wurde eine Co-Immunpräzipitation mit dem PP2Ac-spezifischen Antikörper 1D6 durchgeführt, der PP2Ac heruntergezogen hat und außerdem beträchtliche Mengen des interagierenden Alpha-Synucleins, jedoch nahezu kein Beta-Synuclein. Kein Gamma-Synuclein wurde gemeinsam mit PP2Ac in der Co-Immunpräzipitation heruntergezogen. Diese Co-Immunpräzipitationsdaten legen nahe, dass Alpha-Synuclein der endogene Modulator von PP2Ac in vivo ist.
Wir möchten uns bei allen bedanken, die uns bei der Erstellung dieses Videos unterstützt haben. Abschließend ist dies Ruth Perez. Sonavarak Lek.
Javier Vargas. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg. Auf Wiedersehen und viel Glück.
Übersicht
In dieser Veröffentlichung wird ein Protokoll zur Messung der Aktivität der katalytischen Untereinheit der rekombinanten Proteinphosphatase 2A (PP2Ac) in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein-, β-Synuclein- oder γ-Synuclein-Proteine mittels einer farbmetrischen Assaymethode vorgestellt. Die Ergebnisse deuten auf eine Spezifität von α-Synuclein gegenüber PP2Ac im Maushirn hin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Proteinphosphatase 2A (PP2A) ist ein entscheidendes Enzym, das an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt ist.
- Synucleine sind eine Proteinfamilie, die mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird.
- Das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Synucleinen und PP2A kann Aufschluss über ihre Rolle bei der neuronalen Funktion geben.
- Farbmessassays sind wirksam zur Bestimmung der Enzymaktivität in vitro.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beurteilung der PP2Ac-Aktivität in Gegenwart von Synucleinen.
- Beurteilung der Spezifität von α-Synuclein gegenüber PP2Ac.
- Vorlage einer detaillierten Methodik für Forschende auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Herstellung der Puffer und Reagenzien für den farbmetrischen Assay.
- Inkubation von PP2Ac mit variierenden Konzentrationen von Synucleinen.
- Messung der Enzymaktivität mittels Spektralphotometer.
- Co-Immunpräzipitation zur Beurteilung von Wechselwirkungen in Maushirnproben.
Hauptergebnisse
- Alle drei Synucleine (α, β, γ) stimulierten die PP2Ac-Aktivität bei spezifischen Konzentrationen.
- α-Synuclein zeigte die höchste Spezifität und Wechselwirkung mit PP2Ac.
- Die Co-Immunpräzipitation wies α-Synuclein als primären endogenen Modulator von PP2Ac aus.
- Farbmetrische Veränderungen korrelierten mit den Phosphatgehalten im Assay.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll eignet sich zur Untersuchung der PP2Ac-Aktivität.
- α-Synuclein ist ein bedeutender Modulator der PP2Ac in vivo.
- Diese Studie vertieft das Verständnis der Synuclein-Interaktionen in der Neurobiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Studie etabliert einen zellfreien Assay zur Bewertung der synucleinvermittelten Modulation der PP2Ac-Aktivität und stellt damit ein mechanistisches Werkzeug für die Zielvalidierung in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen bereit. Indem gezeigt wird, dass alle drei Synuclein-Isoformen die PP2Ac in vitro stimulieren können, unterstützt die Methode die Überprüfung von Hypothesen zur konservierten funktionellen Homologie und deren Auswirkungen auf die Entlastung von Signalwegen. Die Co-Immunpräzipitationsdaten verfeinern zudem die Zielgenauigkeit, indem sie α-Synuclein als endogenen Modulator in vivo hervorheben, was bei der Priorisierung therapeutischer Hypothesen hilft und die mechanistische Unschärfe in der frühen Entdeckungsphase verringert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich der Wechselwirkungen zwischen Synuclein und PP2Ac bei Neurodegeneration.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung, indem geklärt wird, ob beobachtete Effekte auf einer direkten Enzymmodulation oder indirekten Wegen beruhen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Beurteilung des Target-Vertrauens durch den Vergleich isoformspezifischer Aktivitäten in einem kontrollierten, reproduzierbaren System.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet einen standardisierten, quantitativen Endpunkt (Phosphatfreisetzung mittels Malachitgrün-Assay) zur Beurteilung der Wirkung von Verbindungen auf die PP2Ac-Aktivität.
- Operativer Wert: Verwendet rekombinante Proteine und definierte Puffer, um die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen verschiedenen Laboren und bei Screening-Kampagnen sicherzustellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Erstellung validierter biologischer Werkzeuge (z. B. Dosis-Wirkungs-Kurven) für die nachgeschaltete Bewertung von Verbindungen und die Bestätigung von Hits.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verknüpft in vitro-Befunde mit endogenen Interaktionen, die im Maushirn beobachtet wurden, und unterstützt so die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Risikominderung bei Target-Engagement-Strategien, indem zwischen unspezifischer in vitro-Aktivität und selektiver in vivo-Modulation unterschieden wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Auswahl präklinischer Modelle, indem angegeben wird, welche Synuclein-Isoformen in physiologischen Kontexten voraussichtlich PP2Ac ansprechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Zielvalidierung sowie die Identifizierung von Leitsubstanzen, indem er quantitative, mechanismenbasierte Messgrößen liefert, die über Go/No-Go-Entscheidungen entscheiden, bevor erhebliche Investitionen in die Optimierung von Verbindungen getätigt werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem dosisabhängige Messungen der PP2Ac-Aktivierung durch Synuclein-Isoformen ermöglicht werden.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Reagenzherstellung und einen farbmetrischen Output, der mit plattenbasierten Formaten kompatibel ist.
- Analytik: Erzeugt quantitative Phosphatmessungen, die den Vergleich der Potenz und Wirksamkeit von Modulatoren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem bestätigt wird, dass beobachtete in-vitro-Effekte mit endogenen Interaktionen im Gehirngewebe übereinstimmen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung der Wirkung von Modulatoren auf PP2Ac, die nicht nur für Synucleine, sondern auch für andere regulatorische Proteine oder kleine Moleküle anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Modulation von Zielstrukturen, indem direkte, quantitative Daten zur Enzymaktivität bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch detaillierte Angaben zur Reagenzherstellung und definierte Inkubationsbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Abhängigkeit von indirekten oder korrelativen Biomarkern verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf mechanistischen Nachweisen der Signalwegaktivierung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinbiochemie und Enzymassay-Techniken, einschließlich des Umgangs mit rekombinanten Proteinen und der Nachweis von Phosphorylierungen.
- Setzt den Zugang zu spektrophotometrischen Geräten voraus, die Absorptionsmessungen bei 630 nm ermöglichen, sowie temperaturgesteuerte Inkubationssysteme.
- Erfordert eine standardisierte Reagenzherstellung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg (z. B. Malachitgrün-Lösung, pNPP-Puffer), um die Konsistenz des Assays sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn der Assay auf nicht-neuronale Modellsysteme oder alternative PP2Ac-Quellen ausgeweitet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit frischer Phosphopeptid-Substrate und eine strikte Temperaturkontrolle während der Inkubationsschritte.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
