Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Das übergeordnete Ziel der magnetischen Mikroglia-Isolierung von CD11b ist es, eine hochreine Endausbeute an postnatalen Mikroglia in relativ kurzer Zeit zu erreichen, um vielseitige In-vitro-Experimente durchführen zu können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Signalmechanismen, die für neuronale Entzündungen relevant sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den derzeit verfügbaren Methoden besteht darin, dass die Isolierung etwa 30 Minuten dauert, ohne dass Abstriche bei der Reinheit, Ausbeute oder Lebensfähigkeit gemacht werden.

Beginnen Sie damit, frisch enthauptete Köpfe von ein bis zwei Tage alten Mäusewelpen in eine laminare Luftstromhaube zu übertragen. Verwenden Sie dann eine gerade 4,5-Zoll-Mikropräparierschere, um einen kleinen Schnitt in den Schädel und die Hirnhäute zu machen, indem Sie die Spitzen in die durch die Enthauptung gebildete Öffnung einführen und von kaudal nach rostral schneiden. Nachdem du den Schnitt gemacht hast, schäle eine der Halbkugeln zur Seite.

Verwenden Sie dann eine gebogene oder hakenförmige Pinzette, um das gesamte Gehirn zu entfernen. Übertragen Sie das Gehirn in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA und inkubieren Sie es 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Waschen Sie das Gehirn mit frischem Wachstumsmedium, indem Sie das Medium hinzufügen und entfernen.

Fügen Sie nach Beendigung der Wäschen zwei Milliliter Wachstumsmedium pro Gehirn hinzu und homogenisieren Sie das Gehirn, indem Sie es verreiben. Wenn das Hirngewebe nicht kleiner wird, wechseln Sie zu einer Pipette mit einer kleineren Öffnung. Am Ende der Verreibung, wenn die Suspension klar und ohne sichtbare Stücke ist, passieren Sie die Suspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um eine einzelne Zellkultur zu erzeugen.

Pipettieren Sie dann acht bis neun Milliliter Wachstumsmedium in T75-Kolben, zwei Kolben pro Gehirn, und fügen Sie jedem Kolben Milliliter Gehirnhomogenat hinzu. Züchten Sie die Zellen bis zur Isolation am sechzehnten Tag. Nach sechzehn Tagen wird das Wachstumsmedium aus dem Kolben in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Geben Sie drei Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jeden T75-Kolben. Schütteln Sie dann die Kolben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. Zentrifugieren Sie das Wachstumsmedium bei 0,4-fachen g für fünf Minuten.

Nach fünfminütigem Schütteln werden mindestens vier Milliliter des zentrifugierten Kulturmediums hinzugefügt, um die Trypsin-EDTA-Reaktion zu stoppen, und trituiert, um sicherzustellen, dass alle Zellen abgelöst wurden. Anschließend werden die Zellen durch ein 70-Mikromolares Zellsieb geleitet, um eine einzelne Zellkultur zu erzeugen. Führen Sie eine Zellzählung durch, und drehen Sie dann fünf Minuten lang mit dem 0,4-fachen g nach unten.

Nehmen Sie als Nächstes eine Fünf-Milliliter-Polystyroltube, fügen Sie einen Milliliter des empfohlenen Mediums hinzu und markieren Sie den Meniskus. Fügen Sie das empfohlene Medium bis zu 2,5 Milliliter hinzu und markieren Sie auch diesen Meniskus. Entfernen Sie dann das Medium und suspendieren Sie das Pellet erneut in 500 Mikrolitern des empfohlenen Mediums.

Füllen Sie diese Mischung in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und verdünnen Sie sie dann auf eine Millilitermarke. Fügen Sie dann 50 Mikroliter Rattenserum pro Milliliter suspendierter Zellen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Während der Inkubation wird der Selektionscocktail durch Mischen von 25 Mikrolitern der Komponente A und 25 der Mikroliter der Komponente B zubereitet. Nach Ablauf der fünf Minuten werden 50 Mikroliter des Selektionscocktails in die Zellen gegeben und weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Wirbeln Sie die Mikrokügelchen 45 Sekunden lang ein. Fügen Sie dann 80 Mikroliter Mikrokügelchen pro Milliliter Probe hinzu und inkubieren Sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend das empfohlene Medium bis zur 2,5-Milliliter-Markierung auf der Styroportube hinzu.

Legen Sie das Röhrchen für drei Minuten bei Raumtemperatur in die Magnethalterung. Gießen Sie das Medium nach der Inkubation langsam in ein 15-Milliliter-Styroporröhrchen, das sich noch im Magneten befindet. Wiederholen Sie die magnetische Trennung noch dreimal und fügen Sie jedes Mal das empfohlene Medium bis zur 2,5-Milliliter-Markierung hinzu.

Nach der letzten magnetischen Trennung fügen Sie drei Milliliter Wachstumsmedium hinzu und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. Plattieren Sie die Zellen für die Behandlungen in Poly-D-Lysin-beschichteten Platten. Die negative Fraktion aus dem 15-Milliliter-Röhrchen, das hauptsächlich Astrozyten enthält, wird in T75-Kolben überfüllt.

Nach mindestens sechsstündiger Inkubation in einem 37-Grad-Inkubator ist das gesamte Wachstumsmedium in den Kolben mit der negativen Fraktion zu ersetzen, bevor Sie in den Inkubator zurückkehren. Dieses Bild zeigt die Immunzytochemie einer isolierten Mikrogliakultur, die auf IBA, einen Marker für Mikroglia im grünen Kanal, und GFAP, einen Marker für Astrozyten, im roten Kanal untersucht wurde. Die Hoechst-Färbung zeigt das Vorhandensein von Zellkernen.

Das Fehlen von GFAP-positiven Zellen zeigt, dass auch Mikroglia, die mit dem CD11b-Positiv-Selektionskit isoliert wurden, eine hohe Reinheit aufweisen. Diese immunblottierten Proteine aus einer isolierten Mikrogliakultur wurden auf GFAP untersucht, das als etwa 51-Kilodalton-Bande erscheint, und auf IBA1, das als etwa 15-Kilodalton-Bande erscheint. Beta-Aktin wurde als Belastungskontrolle verwendet und liegt bei etwa 42 Kilodalton.

Ein Problem mit dem alten Isolationskit war, dass PE-Fluoreszenz im roten Kanal beobachtet werden konnte, wie hier zu sehen. Das modifizierte Verfahren erzeugt keine Autofluoreszenz aus den magnetischen Kügelchen, wie hier im roten Kanal zu sehen. Die mit diesem Verfahren isolierten Mikroglia können für Signalstudien verwendet werden.

Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass Fünen und Phospho-src-Tyrosin Y416 aus Mikroglia nachgewiesen werden können, die mit unserer neu verfeinerten Methode isoliert wurden. Die negative Fraktion aus der Mikroglia-Trennung enthält Astrozyten, die für Signalstudien verwendet werden können. Western Blot zeigt, dass die negative Fraktion GFAP-positive Zellen enthält.

Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass Fyn und Phospho-src-Tyrosin Y416 aus den GFAP-positiven Zellen nachgewiesen werden können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskopie, Western Blot und quantitative PCR, durchgeführt werden, um Fragen zur Genexpression und Proteinsignalisierung zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese schnelle Isolationstechnik für die Zwecke von Mikroglia-Experimenten nutzen können.