Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern
October 2nd, 2017
Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.
Das übergeordnete Ziel des sequentiellen Salzextraktionsverfahrens ist es, Proteinbindungsprofile an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie die Bindung verändert wird, wenn das Protein oder seine Umgebung manipuliert wird. Diese Methode misst die relative Affinität epigenetischer Regulatoren zum Chromatin und kann verwendet werden, um zu bewerten, wie sich diese Wechselwirkungen durch genetische, chemische und umweltbedingte Manipulation ändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit ist, die Bindungsprofile von Chromatin-bindenden Proteinen zu bewerten.
Personen, die neu auf dem Gebiet des Chromatins sind, haben oft Probleme mit der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Die sequentielle Salzextraktion ist eine alte Technik, mit der selbst unerfahrene Wissenschaftler viele der gleichen Fragen beantworten können. Um das Verfahren zu beginnen, ernten Sie 8.000.000 Zellen aus jeder Zelllinie von Interesse.
Waschen Sie jede Zellprobe zweimal mit fünf Millilitern eiskaltem PBS. Resuspendieren Sie jede Probe und einen Milliliter eines hypotonen Puffers mit Proteaseinhibitoren. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Drehen Sie die Suspensionen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius von oben nach unten und zentrifugieren Sie die Suspension dann fünf Minuten lang bei derselben Temperatur bei 6.000 g. Entsorgen Sie den Überstand. Statten Sie eine Mikropipette mit einer Ein-Milliliter-Spitze aus.
Dem Pellet werden 200 Mikroliter salzfreier modifizierter Ripa-Puffer mit Proteasehemmern zugesetzt. Klopfen Sie mit der Pipettenspitze gegen den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, um das Pellet in die Spitze zu ziehen. Pipettieren Sie das Pellet 15 Mal auf und ab.
Die Probe sollte dick und klebrig werden, wenn das Pellet aufbricht. Homogenisieren Sie jede Probe auf diese Weise und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Proben bei 6500 g bei vier Grad Celsius für drei Minuten.
Übertragen Sie die Überstände in saubere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zu jedem Pellet werden 200 Milliliter modifizierter Ripa-Puffer mit 100 millimolaren Natriumchlorid und Proteaseinhibitoren gegeben. Pipettieren Sie das Pellet 15 Mal auf und ab.
Wenn sich das Pellet anfangs nur schwer in die Pipettenspitze ziehen lässt, klopfen Sie mit der Spitze an der Unterseite des Röhrchens an. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 6500 g bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie die Überstände auf neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie die Extraktion der Proben in modifizierte Ripa-Pufferlösungen mit steigenden Natriumchloridkonzentrationen fort. Wenn das Pellet nicht mehr am Boden des Röhrchens verbleibt, legen Sie das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchens, bevor Sie den Überstand umfüllen.
Nach der seriellen Salzextraktion werden für jede Probe 70 Milliliter des vierfachen Proteinbeladungsfarbstoffs zu jeder der fünf Überstandsfraktionen hinzugefügt. Laden Sie 30 Mikroliter jeder Fraktion auf ein SDS-Acrylamidgel. Führen Sie einen Standard-Western-Blot durch, indem Sie die Proteine auf eine Membran übertragen und mit den entsprechenden Primärantikörpern färben.
Inkubieren Sie den Blot in Sekundärantikörpern, die mit einem Infrarotfarbstoff markiert sind, und bilden Sie den Blot ab. Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Bandenintensität jeder Salzkonzentration zu berechnen. Plotten Sie die Bandenintensität gegen die Salzkonzentration auf, um das Elutionsmuster des interessierenden Proteins zu bestimmen.
Die sequentielle Salzextraktion der Proteine ARID1a und Polybromo 1 zeigte eine konsistente Elution mit Salzkonzentrationen von 200 bzw. 300 Millimolar. Die nicht-sequentielle Salzextraktion der gleichen Proteine zeigte weniger konsistente Ergebnisse. Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein optimiert werden.
Daher wurde SSE verwendet, um Elutionsprofile nach unterschiedlichen Inkubationslängen zu untersuchen. Ein transkriptioneller Aktivator, Polybromo 1, zeigte ähnliche Elutionsprofile, wenn er drei Minuten und 10 Minuten inkubiert wurde. Der Transkriptionsrepressor, Polycomb Repressive Complex 1, angezeigt durch BMI1, benötigte mehr als drei Minuten, um aus dem Chromatin freigesetzt zu werden.
Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden untersucht, indem die Veränderung der Elutionsprofile untersucht wurde. In Gegenwart eines Inhibitors trat die Bromodomäne, die das Protein vier enthält, bei niedrigeren Salzkonzentrationen auf als ohne den Inhibitor. Unterschiede in den Histonmustern wurden beobachtet, wenn Zellen mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor behandelt wurden, wodurch sich die Landschaft des Chromatins veränderte.
Veränderungen in der Proteinbindung, wenn Zellen genomischem Stress ausgesetzt waren, spiegelten sich auch in den Elutionsprofilen wider. Hier deutete die Erhöhung der Salzkonzentration, die für die Elution benötigt wird, darauf hin, dass Polybrom 1 nach einer DNA-Schädigung mit Doxorubicin fester an das Chromatin bindet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, jede Probe so konsequent wie möglich zu behandeln. Dieses Verfahren kann in den ersten Schritten einer Studie eingesetzt werden, um den Mechanismus und die Regulation eines Chromatin-bindenden Proteins aufzuklären. Dies spart Zeit und Geld für unnötige genomweite Studien.
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Überblick
Das Sequential Salt Extraction-Verfahren wurde entwickelt, um Protein-Bindungsprofile an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie diese Bindungen durch verschiedene Manipulationen verändert werden. Diese Methode ist besonders nützlich für die Bewertung der Affinität epigenetischer Regulatoren zu Chromatin.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Chromatinbiologie
- Proteininteraktionen
- Epigenetik
Hintergrund
- Sequential Salt Extraction ist eine Technik zur Untersuchung von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Es bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP).
- Diese Methode ist auch für unerfahrene Wissenschaftler zugänglich.
- Es ermöglicht die Bewertung, wie sich Proteininteraktionen durch genetische, chemische und umweltbedingte Faktoren ändern.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Bindungsprofile von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Bewertung der Auswirkungen verschiedener Manipulationen auf die Proteinbindung.
- Bereitstellung einer unkomplizierten Methode für Forscher im Chromatin-Bereich.
Verwendete Methoden
- Ernte von 8.000.000 Zellen aus jeder Zelllinie von Interesse.
- Sequenzielle Salzextraktion zur Isolierung von Chromatin-gebundenen Proteinen.
- Bewertung der Proteinbindungsaffinität an Chromatin.
- Bewertung der Änderungen der Bindungsprofile unter verschiedenen Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Die Methode charakterisiert effektiv Proteinbindungsprofile.
- Es zeigt, wie Bindungsaffinitäten durch Umweltfaktoren verändert werden können.
- Die Ergebnisse deuten auf den Nutzen dieser Technik für erfahrene und angehende Forscher hin.
- Liefert Einblicke in die Interaktionen epigenetischer Regulatoren mit Chromatin.
Schlussfolgerungen
- Sequential Salt Extraction ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Chromatin-Interaktionen.
- Die Methode ist effizient und für verschiedene Forschungsanwendungen zugänglich.
- Es verbessert das Verständnis der Proteinbindungsdynamik in der Chromatinbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Sequential Salt Extraction (SSE) provides a rapid, cost-effective method to evaluate chromatin-binding protein affinity, enabling early-stage target validation in epigenetics-focused drug discovery. By quantifying how genetic, chemical, or environmental perturbations alter protein-chromatin interactions, SSE supports mechanistic de-risking of chromatin-modifying complexes before committing to resource-intensive assays. This approach improves predictive confidence in lead identification by distinguishing direct binding effects from indirect cellular responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding affinity changes when complex subunits are lost or domains inactivated, clarifying functional contributions of individual proteins to chromatin engagement.
- Scientific Value: Profiles elution patterns under increasing salt concentrations to differentiate specific chromatin binding from nonspecific associations, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enables non-experts to generate quantitative binding data without specialized ChIP expertise, accelerating early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible elution profiles that serve as quantitative readouts for screening compound effects on chromatin landscape alterations.
- Operational Value: Uses standard western blot infrastructure and image analysis, facilitating assay standardization across laboratories and reducing technical variability.
- Operational Value: Requires only basic centrifugation and electrophoresis equipment, lowering barriers to adoption in screening cascades for epigenetic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links alterations in chromatin environment (e.g., via HDAC inhibitors) to changes in protein binding, supporting biomarker-aligned mechanistic studies in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Evaluates binding shifts under genomic stress (e.g., doxorubicin-induced DNA damage), informing predictive models of target engagement under pathophysiological conditions.
- Operational Value: Complements cellular and biochemical assays by providing orthogonal validation of chromatin interaction continuity from discovery to preclinical stages.
Pipeline & Workflow Integration
SSE fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a mechanistic bridge between biochemical binding assays and cellular phenotypic readouts in epigenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how complex alterations affect chromatin binding, enabling pathway clarification and biological de-risking of epigenetic targets.
- Screening: Delivers salt-dependent elution profiles as quantitative outputs for comparing compound-induced chromatin state changes across screening campaigns.
- Analytics: Generates band intensity data plotted against salt concentration, providing calculable binding affinity shifts that inform structure-activity relationship discussions.
- Translational Research: Connects in vitro binding changes to cellular chromatin landscape modifications, supporting translational biomarker alignment when coupled with functional readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-cost capability applicable across multiple chromatin targets, promoting platform reuse in epigenetic drug discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by distinguishing direct chromatin binding from indirect cellular effects through controlled salt elution.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative binding profiles using widely available laboratory equipment, enhancing cross-team standardization.
- Strategic Value: Reduces reliance on low-throughput ChIP for initial binding assessments, improving capital efficiency in early epigenetics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying complex targets based on quantitative binding resilience to environmental perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biochemistry and western blot quantification to ensure accurate elution profile interpretation.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, microcentrifuge tubes, and standard SDS-PAGE/western blot instrumentation.
- Necessitates standardized cell harvesting and lysis protocols to minimize variability between samples and ensure comparable salt extraction results.
- Involves optimization of incubation times for each target protein, as binding release kinetics vary across chromatin-modifying complexes.
- Limited to relative affinity comparisons; absolute binding constants require orthogonal biophysical methods for validation.
