Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern
2. Oktober 2017
Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.
Das übergeordnete Ziel des sequenziellen Salzextraktionsverfahrens besteht darin, die Bindungsprofile von Proteinen an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie sich die Bindung verändert, wenn das Protein oder seine Umgebung verändert wird. Diese Methode misst die relative Affinität epigenetischer Regulatoren zum Chromatin und kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich diese Wechselwirkungen nach genetischen, chemischen und umweltbedingten Eingriffen verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit bietet, die Bindungsprofile chromatinbindender Proteine zu bewerten.
Personen, die neu im Bereich Chromatin sind, haben oft Schwierigkeiten mit der chromatinimmunpräzipitation, oder ChIP. Die sequenzielle Salzextraktion ist eine alte Technik, mit der auch unerfahrene Wissenschaftler viele derselben Fragen beantworten können. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie 8.000.000 Zellen aus jeder interessierenden Zelllinie gewinnen.
Jedes Zellprobe mit fünf Milliliter eiskaltem PBS zweimal waschen. Jede Probe in einem Milliliter eines hypotonen Puffers mit Proteaseinhibitoren resuspendieren. Die Zellsuspensionen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Drehen Sie die Suspensionen von oben nach unten für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie anschließend die Suspension fünf Minuten bei derselben Temperatur mit 6.000 G. Entsorgen Sie den Überstand. Statten Sie einen Mikropipettierer mit einer 1-Milliliter-Spitze aus.
Fügen Sie zum Pellet 200 Mikroliter salzfreien modifizierten RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren hinzu. Klopfen Sie die Pipettenspitze leicht gegen den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, um das Pellet in die Spitze aufzunehmen. Pipettieren Sie das Pellet 15-mal auf und ab.
Die Probe sollte dick und klebrig werden, während der Pellet sich auflöst. Homogenisieren Sie jede Probe auf diese Weise und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben drei Minuten lang bei 6500 G bei vier Grad Celsius.
Überführen Sie die Überstände in saubere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie zu jedem Pellet 200 Milliliter modifiziertes RIPA-Puffer mit 100 Millimolar Natriumchlorid und Proteaseinhibitoren hinzu. Pipettieren Sie den Pellet 15 Mal auf und ab.
Wenn sich das Pellet anfangs schwer in die Pipettenspitze aufziehen lässt, klopfen Sie leicht mit der Spitze auf den Boden des Reaktionsgefäßes. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe und inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 6500 G bei vier Grad Celsius.
Überführen Sie die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fahren Sie mit der Extraktion der Proben in modifizierte RIPA-Pufferlösungen mit steigenden Natriumchlorid-Konzentrationen fort. Wenn das Pellet nicht mehr am Boden des Röhrchens verbleibt, stellen Sie das Pellet vor dem Abgießen des Überstands in die Zentrifugenröhrchenkappe.
Nach der seriellen Salzextraktion geben Sie für jede Probe 70 Milliliter vierfaches Protein-Ladepuffer zu den fünf Überstandfraktionen hinzu. Laden Sie jeweils 30 Mikroliter jeder Fraktion auf ein SDS-Acrylamid-Gel auf. Führen Sie eine Standard-Western-Blot-Analyse durch, indem Sie die Proteine auf eine Membran übertragen und mit den entsprechenden primären Antikörpern anfärben.
Die Membran mit sekundären Antikörpern, die mit einem Infrarotfarbstoff markiert sind, inkubieren und die Membran aufnehmen. Mit Hilfe einer Bildanalyse-Software die Bandenintensität für jede Salzkonzentration berechnen. Die Bandenintensität in Abhängigkeit von der Salzkonzentration auftragen, um das Elutionsmuster des Proteins von Interesse zu bestimmen.
Die sequenzielle Salzextraktion der Proteine ARID1a und Polybromo 1 zeigte eine konsistente Elution bei Salzkonzentrationen von 200 bzw. 300 Millimolar. Die nicht-sequenzielle Salzextraktion derselben Proteine zeigte weniger konsistente Ergebnisse. Die Inkubationszeit muss für jedes untersuchte Protein optimiert werden.
Daher wurde SSE verwendet, um Elutionsprofile nach unterschiedlichen Inkubationszeiten zu untersuchen. Ein transkriptioneller Aktivator, Polybromo 1, zeigte ähnliche Elutionsprofile nach dreiminütiger und zehnminütiger Inkubation. Der transkriptionelle Repressor, der Polycomb-Repressorkomplex 1, gekennzeichnet durch BMI1, benötigte mehr als drei Minuten, um von der Chromatinstruktur freigesetzt zu werden.
Protein-Protein-Interaktionen wurden durch die Untersuchung der Änderungen in den Elutionsprofilen analysiert. In Gegenwart eines Inhibitors eluierte das Bromodomain-enthaltende Protein vier bei niedrigeren Salzkonzentrationen als in Abwesenheit des Inhibitors. Unterschiede in den Histonmustern wurden beobachtet, wenn Zellen mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor behandelt wurden, wodurch die Beschaffenheit der Chromatinstruktur verändert wurde.
Änderungen in der Proteinbindung, wenn Zellen genomischem Stress ausgesetzt waren, spiegelten sich ebenfalls in den Elutionsprofilen wider. Hier deutete die erhöhte Salzkonzentration, die für die Elution benötigt wurde, darauf hin, dass Polybromo 1 nach DNA-Schädigung durch Doxorubicin fester an Chromatin bindet. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden.
Während Sie dieses Verfahren durchführen, achten Sie darauf, bei der Behandlung jeder Probe so konsistent wie möglich vorzugehen. Dieses Verfahren kann in den Anfangsschritten einer Studie verwendet werden, um den Wirkmechanismus und die Regulation eines Chromatin-bindenden Proteins aufzuklären. Dies spart Zeit und Geld für unnötige genomweite Untersuchungen.
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Übersicht
Das sequenzielle Salzextraktionsverfahren dient dazu, die Bindungsprofile von Proteinen an Bulk-Chromatin zu charakterisieren und zu bewerten, wie diese Bindungen durch verschiedene experimentelle Manipulationen verändert werden. Diese Methode eignet sich besonders zur Beurteilung der Affinität epigenetischer Regulatoren zum Chromatin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Chromatinbiologie
- Proteinwechselwirkungen
- Epigenetik
Hintergrund
- Die sequenzielle Salzextraktion ist eine Technik zur Untersuchung von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Sie bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur chromatinimmunpräzipitation (ChIP).
- Diese Methode ist auch für unerfahrene Wissenschaftler zugänglich.
- Sie ermöglicht die Bewertung, wie sich Proteinwechselwirkungen in Abhängigkeit von genetischen, chemischen und umweltbedingten Faktoren verändern.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Bindungsprofile von Chromatin-bindenden Proteinen.
- Beurteilung der Auswirkungen verschiedener Manipulationen auf die Proteinbindung.
- Vorstellung einer einfachen Methode für Forscher im Bereich Chromatin.
Verwendete Methoden
- Isolierung von 8.000.000 Zellen aus jeder gewünschten Zelllinie.
- Schrittweise Salzextraktion zur Isolierung chromatingebundener Proteine.
- Bestimmung der Proteinbindungsaffinität zum Chromatin.
- Untersuchung von Veränderungen in den Bindungsprofilen unter verschiedenen Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Die Methode charakterisiert effektiv Protein-Bindungsprofile.
- Sie zeigt, wie Bindungsaffinitäten durch Umweltfaktoren verändert werden können.
- Die Ergebnisse deuten auf die Nützlichkeit dieser Technik sowohl für erfahrene als auch für unerfahrene Forscher hin.
- Liefert Einblicke in die Wechselwirkungen epigenetischer Regulatoren mit Chromatin.
Schlussfolgerungen
- Die sequenzielle Salzextraktion ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Chromatin-Wechselwirkungen.
- Die Methode ist effizient und für verschiedene Forschungsanwendungen zugänglich.
- Sie verbessert das Verständnis der Proteingebindungsdynamik in der Chromatinbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die sequenzielle Salzextraktion (SSE) bietet eine schnelle und kostengünstige Methode zur Beurteilung der Affinität chromatinbindender Proteine und ermöglicht eine Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium der entwicklung von Wirkstoffen, die auf die Epigenetik abzielen. Indem quantifiziert wird, wie genetische, chemische oder umweltbedingte Störungen die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Chromatin verändern, unterstützt die SSE die mechanistische Absicherung chromatinmodifizierender Komplexe, bevor aufwändige Assays durchgeführt werden. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem direkte Bindungseffekte von indirekten zellulären Reaktionen unterschieden werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst relative Änderungen der Bindungsaffinität, wenn Komplex-Untereinheiten verloren gehen oder Domänen inaktiviert werden, und verdeutlicht so die funktionellen Beiträge einzelner Proteine zur Chromatinbindung.
- Wissenschaftlicher Wert: Profiliert Elutionsmuster unter steigenden Salzkonzentrationen, um spezifische Chromatinbindung von unspezifischen Assoziationen zu unterscheiden, wodurch falsch-positive Ergebnisse bei der Zielvalidierung reduziert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht es Nicht-Experten, quantitative Bindungsdaten ohne spezialisierte ChIP-Kenntnisse zu erzeugen und beschleunigt so die Hypothesentestung in frühen Entwicklungsstadien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare Elutionsprofile, die als quantitative Messgrößen zur Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf chromatinbasierte Veränderungen dienen.
- Operativer Wert: Nutzt die Standardinfrastruktur für Western Blot und Bildanalyse, was die Assay-Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren erleichtert und die technische Variabilität verringert.
- Operativer Wert: Benötigt lediglich grundlegende Zentrifugier- und Elektrophoresegeräte, wodurch die Einführung in Screening-Verfahren für epigenetische Modulatoren vereinfacht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Veränderungen im Chromatin-Umfeld (z. B. durch HDAC-Hemmer) mit Veränderungen der Proteinbindung und unterstützt so mechanistische, biomarkerbasierte Studien in krankheitsrelevanten Systemen.
- Wissenschaftlicher Wert: Bewertet Bindungsverschiebungen unter genomischem Stress (z. B. durch Doxorubicin induzierte DNA-Schäden) und liefert damit Daten für prädiktive Modelle der Targetbindung unter pathophysiologischen Bedingungen.
- Operativer Wert: Ergänzt zelluläre und biochemische Assays, indem er eine orthogonale Validierung der Kontinuität von Chromatin-Wechselwirkungen von der Entdeckungsphase bis in die präklinische Entwicklung bietet.
Pipeline- und Workflow-Integration
SSE fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und bietet eine mechanistische Brücke zwischen biochemischen Bindungsassays und zellulären phänotypischen Messungen in epigenetischen Programmen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie komplexe Veränderungen die Chromatinbindung beeinflussen, wodurch Signalwege geklärt und epigenetische Zielstrukturen biologisch entrisikot werden können.
- Screening: Liefert salzabhängige Elutionsprofile als quantitative Ausgabe zur Vergleichbarkeit von durch Verbindungen induzierten Chromatinzustandsänderungen über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.
- Analytik: Erzeugt Bandintensitätsdaten, die gegen die Salzkonzentration aufgetragen werden und berechenbare Verschiebungen der Bindungsaffinität liefern, die für struktur-aktivitätsbezogene Diskussionen herangezogen werden können.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Bindungsänderungen mit Modifikationen des zellulären Chromatinlandschaftsprofils und unterstützt so die Abstimmung translationaler Biomarker, wenn sie mit funktionellen Endpunkten kombiniert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, kostengünstige Methode dar, die auf mehrere Chromatinziele anwendbar ist und die Plattformwiederverwendung in epigenetischen Wirkstoffentwicklungsprozessen fördert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem direkte Chromatinbindung von indirekten zellulären Effekten durch kontrollierte Salzelution unterschieden wird.
- Operationaler Wert: Liefert reproduzierbare, quantitative Bindungsprofile unter Verwendung weit verbreiteter Laborgeräte und verbessert so die Standardisierung zwischen Teams.
- Strategischer Wert: Verringert die Abhängigkeit von niedrigdurchsatzfähigen ChIP-Analysen für erste Bindungsbeurteilungen und steigert damit die Kapitalwirtschaftlichkeit in frühen Epigenetik-Projekten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets, die chromatinmodifizierende Komplexe darstellen, basierend auf der quantitativen Bindungsstabilität gegenüber umweltbedingten Störungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Chromatin-Biochemie und der Quantifizierung von Western Blots, um eine genaue Interpretation des Elutionsprofils sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu gekühlten Zentrifugen, Mikrozentrifugenröhrchen und Standardausrüstung für SDS-PAGE/Western Blot ab.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Zellernte und Zelllyse voraus, um die Variabilität zwischen Proben zu minimieren und vergleichbare Ergebnisse bei der Salzextraktion zu gewährleisten.
- Erfordert die Optimierung der Inkubationszeiten für jedes Zielprotein, da sich die Kinetik der Bindungsauflösung zwischen verschiedenen chromatinmodifizierenden Komplexen unterscheidet.
- Auf relative Affinitätsvergleiche beschränkt; absolute Bindungskonstanten erfordern zur Validierung orthogonale biophysikalische Methoden.
