Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Erzeugung von aus iPSCs abgeleiteten menschlichen Gehirnorganoiden besteht darin, frühe menschliche neurodevelopmentale Störungen zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der menschlichen Gehirnentwicklung zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Synthesomen und Zilien bei der neuartigen Neurogenese und der primären Mikrozephalie spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein robustes und schnelles Modell darstellt, um reproduzierbare Ergebnisse aus aus Patienten-iPSCs abgeleiteten Gehirnorganoiden zu erhalten.

Die Prozedur wird Elke Gabriel, eine Postdoktorandin aus meinem Labor am Zentrum für Molekulare Medizin in Köln, demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Neurosphären mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette und einer zuvor mit sterilen Scheren abgeschnittenen 2-Millimeter-Spitze aufsammeln. Anschließend platzieren Sie die Neurosphären etwa fünf Millimeter voneinander entfernt auf einer Paraffinfolie in einer 100-Milliliter-Schale.

Und entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich vom verbleibenden Medium. Geben Sie dann einen Tropfen EHS-Matrix auf jede einzelne Neurosphäre. Inkubieren Sie die Tropfen mit der EHS-Matrix und den Neurosphären 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Anschließend spülen Sie die Neurosphären vorsichtig vom Paraffinfilm ab, indem Sie sie mit Neurosphärenmedium überspülen. Danach inkubieren Sie die Neurosphären für die folgenden vier Tage und geben am zweiten Tag zwei Millimeter frisches Neurosphärenmedium hinzu. Fügen Sie in diesem Verfahren über die Seitenarme jeweils 100 Milliliter Gehirnorganoid-Medium zu jedem Rührkolben hinzu.

Und erwärmen Sie das Medium im Inkubator auf 37 Grad Celsius für mindestens 20 Minuten vor. Stellen Sie dann sicher, dass alle Neurosphären getrennt sind. Falls zwei oder mehr über die EHS-Matrix verbunden sind, trennen Sie sie, indem Sie die verbindende Matrix mit einem Skalpell durchschneiden.

Richten Sie ein Rührprogramm mit 25 U/min ein. Überführen Sie die in der EHS-Matrix eingebetteten Neurosphären vorsichtig in die Rundkolben mit 100 Milliliter Organoid-Medium. Danach platzieren Sie die Rundkolben gleichmäßig auf einer magnetischen Rührplattform im Inkubator für 14 Tage bei 37 Grad Celsius.

Dies ist der Tag null der Organoidkultur. Wechseln Sie das Medium einmal pro Woche, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und die gleiche Menge frisches Medium hinzufügen. In diesem Schritt sammeln Sie die Organoiden am Tag 14 aus der Rührtöpfchenkultur mit einer vorgeschnittenen Ein-Milliliter-Mikropipette.

Geben Sie alle in eine 60 Millimeter große Petrischale und waschen Sie sie einmal mit fünf Milliliter warmem DMEM F12 für drei Minuten. Danach bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern warmem, 4 %igem PFA vor. Legen Sie jedes Organoid einzeln in ein separates Röhrchen und fixieren Sie sie 30–60 Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend die Organoiden mit einem Inokulationsloop entnehmen. Danach PFA entfernen und die fixierten Organoiden zweimal für jeweils 10 Minuten mit einem Milliliter PBS waschen. Im Anschluss die Organoiden für bis zu 7 Tage bei vier Grad Celsius in einem Milliliter PBS zur weiteren Verwendung lagern.

Um die Organoiden für die Kryoschnittpräparation einzubetten, entfernen Sie das PBS und geben Sie 1 Milliliter einer 30%igen Saccharoslösung in jedes Röhrchen, um die Organoiden vor dem Einfrieren zu dehydrieren. Nach Zugabe der Saccharoslösung sollten die Organoiden an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoiden über Nacht in der Saccharoslösung bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag sollten die Organoide auf den Boden des Röhrchens gesunken sein. Danach füllen Sie eine Vinyl-Form mit 400 Milliliter OCT-Verbindung und verwenden eine Inokulationsnadel, um ein Organoid in die Mitte der Form zu legen.

Beschriften Sie den Rand der Form mit dem Probennamen. Anschließend gefrieren Sie die organoidhaltige Form bei minus 80 Grad Celsius bis zur Kryoschnittechnik. Danach beschichten Sie die Glas-Kryoschnitte mit 0,1 % PLL und PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend die Objektträger drei Stunden lang trocknen lassen. Die Objektträger bei vier Grad Celsius lagern und vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen. Danach die kryo-gefrorenen Organoiden in 20 bis 50 Mikrometer dicke Schnitte auf den PLL-beschichteten Glas-Cryoträgern schneiden.

Lassen Sie die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie die Schnitte bis zur weiteren Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius. Immunfluoreszenz-Aufnahmen von kryoseziierten Organoiden, die ein typisches VZ und die primitive kortikale Platte zeigen. Das VZ erstreckt sich von der apikalen Seite bis zur basalen Seite.

Beachten Sie, dass die Zellen innerhalb der VZ palisadenartige Kerne aufweisen, was darauf hindeutet, dass es sich um radiale gliale Zellen handelt. Das rechte Panel zeigt die immunfluoreszenzfarbliche Markierung von nestinpositiven NPCs innerhalb der VZ sowie TUJ1-positiver Neuronen in der primitiven kortikalen Platte. Hier sind zwei Beispiele von VZs dargestellt, die mit PVIM und ARL 13B gefärbt wurden.

Die Bereiche, die durch weiße Quadrate markiert sind, werden vergrößert dargestellt. Apikale radiale Gliazellen, die sich an der apikalen Seite der VZ teilen, sind PVIM-positiv. Die Teilungsebene einer Zelle in der Anaphase verläuft horizontal zur Lumenoberflächenlinie, die durch die ARL-13B-Färbung markiert ist.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 23 Tagen durchgeführt werden. Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, regelmäßige Qualitätskontrollen und Mikroplasmakontrollen an den Kulturen durchzuführen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der neurobiologischen Entwicklung den Weg, die Mechanismen der Neuroentwicklung in menschlichen Gehirnorganoiden zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche Gehirnorganoiden aus verschiedenen iPSC-Zelllinien erzeugt werden können, einschließlich Patientenzelllinien mit beeinträchtigten zellulären Funktionen.