Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kontrollierte dreidimensionale Zellkultivierungsmethoden in der elektrischen Stimulation zu nutzen, um die Reifung von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen, Kardiomyozyten, zu fördern. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des kardiologischen Tissue Engineering zu beantworten, einschließlich der Frage, wie sich unterschiedliche elektrische Stimulationsparameter oder -dauer auf die Funktion und den Reifungszustand von Herzzellen auswirken. Das Endergebnis sind künstlich hergestellte menschliche Herzgewebe mit verbesserter Reife.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf diagnostische Anwendungen wie die Prüfung der Sicherheit und Wirksamkeit neuer Medikamente, da Kardiomyozyten mit ausgereiften Eigenschaften wie dem elektrischen Fortschritt am ehesten als genauere Modelle menschlicher Herzzellen in Wirkstoff-Screening-Studien dienen. Kombinieren Sie das PDMS-Monomer und das Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 und mischen Sie es gut. Lassen Sie es fünf Minuten lang aushärten, um es zu entgasen.

Laden Sie dann eine Petrischale, die den Master für das Biodraht-Template enthält, mit der PDMS-Mischung. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu minimieren. Anschließend härten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius aus.

Stellen Sie dann den erstarrten Schimmel wieder her, indem Sie ihn zuerst mit einer scharfen Klinge um die Ränder herum verwenden und dann abziehen. Schneiden Sie dann das überschüssige PDMS ab und sammeln Sie alle Schablonen in einem Sterilisationsbeutel. Erhitzen Sie die Schablonen 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius im Dampfautoklavier.

Und dann laden Sie jede Schablone in eine sterile Petrischale unter der Belüftung einer Biosicherheitswerkbank. Verwenden Sie nun für jede Schablone eine Pinzette, um ein Stück steriles 6.0-Seidennaht in die Rille zu stecken, die den gesamten Kanal überspannt. Die Templates sind dann bereit für das Cell Seeding.

Die Naht dient als Vorlage für die Bildung von 3D-Konstrukten, die sich entlang der Nahtachse ausrichten und die Form von Herzfasern nachahmen. Stellen Sie für jede Kammer ein Paar rechteckige Polycarbonatstücke her, die als Rahmen für die elektrische Stimulationskammer dienen. Bohren Sie entlang der Mittellinie jedes Stücks zwei drei Millimeter breite Löcher im Abstand von zwei Zentimetern.

Bereiten Sie für jede Kammer zwei 1,5 Zentimeter lange Carbonstäbe vor. Bohren Sie etwa 3 Millimeter vom Ende jeder Stange entfernt ein einen Millimeter breites Loch. Fädeln Sie dann jedes Loch mit einem Platindraht ein und wickeln Sie ein Ende des Drahtes um den Stab.

Als nächstes führen Sie für jede Kammer zwei Stäbe zwischen zwei Polycarbonat-Stücke ein, um einen Rahmen zu bilden. Gießen Sie dann etwa zwei Milliliter PDMS in eine Vertiefung mit einer Platte mit sechs Vertiefungen und setzen Sie den Rahmen mit PDMS in die Vertiefung ein, wobei Sie den Boden der Rahmen eintauchen lassen. Härten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius aus, damit das PDMS den Rahmen sichert.

Entfernen Sie dann die fertige Kammer von der Platte, an der das PDMS befestigt ist. Um die Funktion einer zusammengebauten Kammer zu testen, schließen Sie die Platindrähte an eine Batterie an und überprüfen Sie mit einem Voltmeter, ob Strom durch die Stäbe geleitet wird. Übertragen Sie nun die Funktionskammern in einen Sterilisationsbeutel und bereiten Sie sie durch eine 20-minütige Dampfsterilisation bei 121 Grad Celsius für die Zellkultur vor.

Um das Gel zuzubereiten, kühlen Sie alle Gelkomponenten auf Eis vor, bevor Sie sie in einem sterilen Röhrchen mischen. Achten Sie darauf, dass Sie das Kollagen und die extra zelluläre Matrix zuletzt hinzufügen und die Komponenten durch Pipettieren mischen. Denn die Zellen weisen Kardiomyozyten auf, die von humanen pluripotenten Stammzellen differenziert sind.

Sammeln Sie die Zellen und bereiten Sie für jede Biodraht-Vorbereitungsanlage 3,5 Mikroliter Kollagengel vor, das eine halbe Million Zellen enthält. Verwenden Sie nun eine P10-Pipettenspitze, um etwa vier Milliliter Suspension in die 0,5 Zentimeter lange Kanalschablone in jeder Schale zu füllen. Passen Sie die Position der Naht mit einer sterilen Pinzette nach Bedarf an, damit sie vollständig gedehnt ist.

Achten Sie nach der Aussaat der Zellen darauf, die Gelzellmischung vor der Entnahme im Autoklaven immer wieder zu resuspendieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Decken Sie nach dem Laden der Kanäle den Boden der Schale mit sterilem PBS ab und achten Sie darauf, das Gel nicht zu berühren. Dadurch wird sichergestellt, dass die Biodrähte während der Polymerisation nicht austrocknen.

Nachdem Sie die Biodrähte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, ersetzen Sie das PBS durch ausreichend Nährmedium, um die Zellen zu bedecken. 12 Milliliter sind in der Regel ausreichend. Kulturieren Sie das Gericht dann eine Woche lang und ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag.

Geben Sie in einer Biosicherheitswerkbank zwei Milliliter PBS in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, in der sich eine elektrische Stimulatorkammer befindet. Setzen Sie dann die Autoklavengeräte mit einer sterilen Pinzette vorsichtig in die Vertiefungen ein. Sobald es in Position ist, entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter warmes Medium, das die Kohlenstoffstäbe vollständig bedecken sollte.

Bevor Sie die Zellen 24 Stunden lang kultivieren, beobachten Sie die Kontraktilität der Kardiomyozyten als Reaktion auf die elektrische Stimulation, um sicherzustellen, dass die Zellen den elektrischen Reiz einfangen und mit Kontraktionen reagieren. Legen Sie dann die Biodrähte in die elektrische Stimulatorkammer und richten Sie die Kanäle senkrecht zu den Kohlenstoffstäben aus. Ziehe die Platindrähte von der Platte weg und decke sie dann ab.

Schließen Sie die Drähte an einen elektrischen Stimulator an. Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er biphasische Ein-Millisekunden-Impulse mit einem Hertz und drei Volt pro Zentimeter abgibt. Anschließend werden die Präparate im elektrischen Stimulator in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius überführt.

Erhöhen Sie die Stimulationsrate schrittweise alle 24 Stunden von einem Hertz am Tag Null auf sechs Hertz am sechsten Tag. Wechseln Sie während dieser Kulturwoche jeden zweiten Tag das Medium. Und beobachten Sie täglich die Kontraktilität der Kardiomyozyten.

Nach siebentägiger Vorkultur im Biodraht formten die Zellen das Gel um die Naht herum. Die Zellen schlossen sich entlang der Achse der Naht zu ausgerichtetem Herzgewebe zusammen. Die Zellen, die kardiale kontraktile Proteine exprimierten, zeigten eine sarkomerische Bänderung im kontraktilen Apparat und ihre Myofibrillen waren entlang der Achse der Naht ausgerichtet.

Zellen im Biodraht wiesen niedrigere Proliferationsraten auf als Zellen im Embryoidenkörper. Die Kalziumhandhabung war in den Kardiomyozyten, die in Biodrähten kultiviert wurden, signifikant verbessert. Die Behandlung mit Koffein führte zu einer abrupten Freisetzung von Kalzium aus dem sakroplasmatischen Retikulum.

Solche Transienten wurden nur in stimulierten Zellen gefunden. Es gab auch signifikant höhere Stimulationsfrequenz in Abhängigkeit von den Amplituden der Kalziumfreisetzung. Darüber hinaus zeigten Kardiomyozyten, die in Biodrähten kultiviert wurden, im Vergleich zur Kultivierung in Embryoidkörpern verbesserte hERG- und nach innen gerichtete Gleichrichterstromdichten, was durch elektrische Stimulation weiter verbessert wurde.

Der verbesserte nach innen gerichtete Gleichrichterstrom stimmte mit einer erhöhten Expression des nach innen gerichteten Kalium-Kanals Jean, KCN J2, überein. Die Automatik, also die Fähigkeit, spontan zu schlagen, war bei Kardiomyozyten aus dem Embryoidkörper signifikant höher als bei kontrollierten Biodrähten. Die Kontrolle zeigte eine Automatik, die mit der Aufbereitung von Biodraht vergleichbar ist, die dem Sechs-Hertz-Regime unterzogen wurde. Einmal gemeistert, kann die Einrichtung der Biodrähte in einem halben Tag erledigt werden.

Die Einrichtung der Elektrostimulation wird einige Stunden dauern und die endgültigen Ergebnisse können in zwei Wochen erreicht werden. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass Kardiomyozyten, die aus verschiedenen Zelllinien oder nach unterschiedlichen Protokollen differenziert werden, in ihrer Reife und Reinheit leicht variieren können. Daher kann es erforderlich sein, die experimentellen Parameter, wie z. B. die Stimulationsrate Ihrer Zellen, zu optimieren.

Nach diesem Verfahren können andere Bedingungen, einschließlich der Variation der zellulären Zusammensetzung und der Nutzung mutierter Kardiomyozyten, optimiert werden, um eine Vielzahl zusätzlicher Fragen zu beantworten.