Name: Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Bestimmung der relativen Potenz von Anti-TNF-alpha-Antikörpern mit WEHI 164-Zellen. Diese bioanalytische Methode ermöglicht den Vergleich der Neutralisationseffizienz zwischen Referenz- und Proben-Antikörpern.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Council of Science und Technology (CONACYT), Mexiko gewähren PEI CONACYT 2015 220333, ohne Teilnahme an das Design der Studie.

1. Vorbereitung der Medien und Lösungen <ol><li>bereiten das Kulturmedium: RPMI-1640 mit 10 % FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Vorbereiten Assay Kulturmedium: RPMI-1640 ohne Phenol rot, aber mit 1 % FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Zelle Waschlösung vorbereiten: DPBS Mg und Ca-freie Lösung mit 0,02 % EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>Zelle Ablösung Lösung vorbereiten: 0,125 % Trypsin mit 1 mM EDTA.
	<ol><li>Auftauen einer 0,25 % igen Lösung von Trypsin-EDTA und Übertragung auf eine sterile 500-mL-Flasche 100 mL.</li>
		<li>Mix mit 100 mL Zelle Waschlösung und 15 mL Aliquots in 15 mL steriles Röhrchen zu verzichten. Shop unter-70 bis-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
		<li>Filtern diese Lösungen durch einen 0,22-µm-Membran und bis zu 37 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch warm.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Apoptose-Induktion-Stammlösung TNF-Lösung bei 3,3 µg/mL.
	<ol><li>Auflösen 20 µg von TNF mit 500 µL Filter-sterilisierte Wasser in seiner primären Container und mischen bis zur vollständigen Auflösung.</li>
		<li>In einem 15 mL steriles Röhrchen zu übertragen und dieses Rohr 5,5 mL des DPBS Mg und Ca-freie Lösung hinzufügen. Mischen Sie sanft mit einem Vortex-Mixer.</li>
		<li>Aliquot der Lösung in 70 µL-Portionen. Verzichten jedes aliquoten in 0,5 mL Mikroröhrchen und bei-80 ° c</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Apoptose Induktion Lösung: TNF-Lösung bei 40 ng/mL.
	<ol><li>Ein Aliquot der Apoptose Induktion Vorratslösung, Inkubation in einem Wasserbad bei 25 ° c für 10 min. Auftauen</li>
		<li>Apoptose-Induktion-Stammlösung auf 40 ng/mL zu verdünnen, indem 4,939 mL Assay Nährmedium in einem 15 mL steriles Röhrchen 61 µL 3,3 µg/mL TNF-Lösung hinzufügen.</li>
		<li>Mix von Vortex Mixer für 10 s; diese Lösung muss vor Gebrauch frisch zubereitet werden.</li>
		<li>Wärmen Sie die Lösung auf 37 ° C für mindestens 30 Minuten vor dem Gebrauch in th Eneutralization Assay.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten die Substratlösung: Caspase 3/7 Glo Lösung 7 , 8.
	<ol><li>Die Caspase-Pufferlösung (Caspase 3/7 Glo Puffer) 12 h vor dem Gebrauch auftauen.</li>
		<li>Lassen die Caspase-Puffer-Lösung und das Substrat (Caspase 3/7 Glo Substrat) separat am 25 ± 5 ° C für 30 min vor dem vermischen sitzen.</li>
		<li>Transfer 10 mL der Pufferlösung Caspase zum Substrat Fläschchen und Mix durch Umkehrung.</li>
		<li>Halten bei 25 ± 5 ° C, lichtgeschützt bis zur Verwendung. 
		Hinweis: Die Lösung ist für 6 h bei Raumtemperatur stabil.</li>
	</ol></li></ol> 2. Zelle Culturing und Counting <ol><li>Zelle Auftauen und die ersten Subkultur.
	<ol><li>Entfernen Sie ein Fläschchen mit WEHI 164 Zellen 9 aus einer Tiefkühltruhe bei-80 ° c und übertragen Sie sie auf einem Eisbad.</li>
		<li>Oben und unten mit 1 mL vorgewärmten Kulturmedium pipette, bis die gefrorenen Zellen vollständig auftauen.</li>
		<li>9 mL vorgewärmten Kulturmedium auf eine 15 mL steriles Röhrchen zu verzichten.</li>
		<li>Übertragen die Zellsuspension in der 15 mL steriles Röhrchen und mischen Sie fünfmal durch Umkehrung.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 125 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und die Zelle Pellet disaggregieren.</li>
		<li>5 mL Kulturmedium hinzufügen das Rohr. Mischen, bis die Zellen völlig Nukleinsäuretablette sind.</li>
		<li>Für Zellzählung, 50 µL Zellsuspension auf einer 500 µL Reaktionscup und vermischen sich mit 50 µL 0,4 % Trypan Blau übertragen. Zählen der Zellen und passen Sie auf 0,5 x 10 6 Zellen/mL. Schritt 2.2, s.u..</li>
		<li>75 mL Zelle Kultur Kolben 13 mL vorgewärmten Kulturmedium hinzufügen.</li>
		<li>Genügend Aussetzung Zellvolumen aus Schritt 2.1.6 0,5 x 10 6 Zellen/mL in der Zelle-Kultur-Kolben und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO 2 zu verzichten.</li>
	</ol></li> <li>Zellzählung. 
	Hinweis: Siehe Referenz 10.
	<ol><li>Mit der Lösung von Schritt 2.1.6, 0,05 mL auf eine Hemocytometer übertragen und bestimmen die Zelldichte unter dem Mikroskop verwenden Trypan blau Ausgrenzung.</li>
		<li>Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen zu quantifizieren.</li>
		<li>Einstellen der Zellsuspensionen 0,5 x 10 6 Zellen/mL. 
		Formel 1 
		V Kulturmedium (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V Kulturmedium (mL) = (5 mL - V Zellsuspension) V Kulturmedium (mL) = angepasste Lautstärke des WEHI 164 Zell-Aussetzung NVC = Anzahl der lebensfähigen WEHI 164 Zellen/mL V Kulturmedium (mL) = Assay Kulturmedium Volumen hinzugefügt, um die Zellsuspension zu 0,5 x 10 6 Zellen/mL 0,5 x 10 6 = Ziel Zelldichte</li>
	</ol></li> <li>Zell-Distanz und der zweiten und dritten Subkultur. 
	Hinweis: Ein Vakuumsystem kann verwendet werden, um die Lösungen aus den Kolben zu entfernen. Einweg- oder Glas sterile Pipetten können verwendet werden. Wenn die Pipette eine Baumwolle Verstopfung hat an der Spitze, sie muss vor dem Gebrauch entfernt werden.
	<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Zellkultur T-Kolben mit einer 1 mL sterilen Pipette und ein Vakuum.</li>
		<li>Zelle waschen verzichten 5 mL Lösung in die Kultur T-Kolben, vorsichtig mischen und die Lösung zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. 
		Hinweis: Die vollständige Entfernung des Kulturmediums ist entscheidend für effiziente Zelle Loslösung.</li>
		<li>T-Kolben 15 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzu und lassen Sie stehen für 3 min in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
		<li>Stellen Sie sicher das Fehlen der angeschlossenen Zellen in die Innenwand der Flasche unter die Lupe genommen. Entfernen Sie die Zellen aus der Kultur T-Kolben mit einer sterilen 20 mL-Pipette und verzichten sie in ein steriles Röhrchen 50 mL.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 125 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und das Pellet mit einem anderen 5 mL Kulturmedium Aufschwemmen.</li>
		<li>Der Zellen zu zählen und fügen Sie genug Nährmedium zur Erreichung der gewünschten Zellkonzentration nach Gleichung 1.</li>
		<li>72 cm 2 T Kolben dieser Suspension hinzu und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
		<li>Subkultur assay die Zellen mindestens zwei Mal vor der Verwendung in der Neutralisation. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1-2.3.8 für die nächsten zwei Tage.</li>
	</ol></li> <li>Assay Zellsuspension.
	<ol><li>Wählen Sie eine WEHI-164-Subkultur, die mindestens drei Pässe hat. Siehe Schritt 2.1.</li>
		<li>Trennen und die Zellen entsprechend Schritte 2.2 und 2.3 dieses Protokolls zählen.</li>
		<li>Verdünnen die Zellsuspension nach Gleichung 1 0,5 x 10 6 Zellen/mL.</li>
		<li>Verwenden diese Zellsuspension für die Neutralisation Assay. Mischen Sie alle Zellsuspensionen von Vortex Mixer vor dem Gebrauch.</li>
	</ol></li></ol> 3. Antikörper-Vorbereitung und Verdünnungen <ol><li>Quantifizierung der mAbs.
	<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration der Referenzstoff Kontrollprobe und analytische Probe durch UV-Absorption bei 280 nm mit ihren Massensterben Koeffizient (1,39) 11. 
		Hinweis: Original Konzentrationen könnten Drogen Produktetiketten entnommen werden. Allerdings muss dies durch UV-Absorption überprüft.</li>
	</ol></li> <li>mAb Verdünnungen.
	<ol><li>Verdünnt alle Proben unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung, mit DPBS Mg und Ca-frei in 2 mL Mikroröhrchen bis 2 mg/mL Lösung. Bestätigen Sie diese Konzentration durch UV-Absorption in dreifacher Ausfertigung, mit DPBS Mg und Ca-freie Lösung als Rohling.</li>
		<li>Mischen die Lager Proteinlösungen für 5 s mit einem Vortex-Mixer.</li>
		<li>Verdünnen 100 µL jeder 2 mg/mL-mAb-Lösung mit 0,9 mL Kulturmedium Assay.</li>
		<li>Mix für 5 s von Vortex Mixer. 
		Hinweis: Diese Lösungen haben eine Konzentration von 200 µg/mL. Verdünnungen erfolgen für jedes dreifacher.</li>
		<li>Zu verdünnen, 10 & #181; L jede 200 µg/mL-mAb-Lösung mit 0,99 mL Kulturmedium Assay. Mix für 5 s mit einem Vortex-Mixer. Diese Lösungen haben eine Konzentration von 2 µg/mL. Verdünnungsreihen für jedes dreifacher durchführen, vor der Verwendung in der Neutralisation Test.</li>
		<li>Anti-TNF mAb Verdünnungen in drei unabhängige Mikroplatten machen. Machen Sie ein Duplikat jedes unabhängige dreifacher Ausfertigung zu und verzichten sie in einer Mikrotestplatte zu, wie in Tabelle 1 angegeben. Bezug Stoff < tabelle Fo:keep-together.within-seite = "1" Fo:keep-mit-next.within-seite = "immer" Fo:text-ausrichten = "center" > <tbody><tr><td colspan="2"> Platte 1</td> <td colspan="2"> Platte 2</td>
					<td colspan="2"> Platte 3</td></tr>
				<tr><td>Wells</td> <td>Probe</td> <td>Wells</td> <td>Probe</td> <td>Wells</td> <td>Probe</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> Kontrollprobe</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> analytische Probe</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> analytische Probe</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> Kontrollprobe</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Beispiel für ein Steuerelement</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Analyseprobe</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> Tabelle 1: Mikrotestplatte Probe Arrays. Ein vollständige Neutralisation Assay muss in drei Mikrotiterplatten in Koordinaten B2 G11 ausgeführt werden. Gelegentliche Abgabe von Verweis, analytische, und Kontrollproben erlauben Forschern, jede Bias in der Probe zu überprüfen.</li>
		<li>Perform mAb Verdünnungen von jeder Referenz probieren oder zu steuern, wie in Tabelle 2 dargestellt. 
		Hinweis: Die Anti-TNF-mAb-Konzentrationen in dieser Tabelle beschriebenen sind nicht die Endkonzentrationen in der Neutralisation Assay.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Platte Spalte</td> <td>Volumen der Assay-Nährmedium (μL)</td> <td>Volumen Referenzstoff, analytische Probe oder Kontrolle Probe (uL)</td> <td>Konzentration in der Probe-Platte (ng/mL)</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>150 von Linie 2</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 von Zeile 3</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>50 von Zeile 3</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 4</td> < td > 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 5</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 6</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 her m-Linie 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 9</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>75 von Zeile 10</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T Möglichkeit 2: Anti-TNF mAb Verdünnungen. Serielle Verdünnungen von Anti-TNF mAbs sind in dieser Tabelle gezeigt. In dieser Tabelle beschriebenen Endkonzentrationen sind nicht die Konzentration in der Probe wo Anti-TNF mAbs wurden um den Faktor 3 (Kulturmedium, mAb Verdünnung + Zellen Aussetzung) verdünnt. Linien in Fettdruck stellen Verdünnungen aus Linien 3, 5, 7, 9 und 10; nicht fett gedruckten Linien stehen für Verdünnung von Linien 3, 4 und 6. Diese serielle Verdünnungen werden kurz vor Durchführung der Neutralisierung-Assay durchgeführt. Muss darauf geachtet werden, zu mischen, durch Pipettieren rauf und runter dreimal vor der Abgabe der Verdünnungen.</li>
		<li>Halten die Platten bei 25 ± 5 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol></li></ol> 4. Neutralisation Assay mit WEHI 164 Zellen <ol><li>Mix durch alle Suspensionen (0,5 x 10 6 Zellen/mL) Zelle vor Abgabe bei jedem Schritt dieses Protokolls vortexen. 
	Hinweis: In diesem Abschnitt, jede Lösung auf 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch warm.</li>
	<li>Übertragen 50 µL Zellsuspension zu jedem der 60 Brunnen von Mikrotiterplatten, Umzug von Spalte 2 bis 11 und Linie B bis G.</li>
	<li>Transfer 50 µL der mAb-Referenz, Probe und Kontrolle Verdünnungen in Mikrotiterplatten. Folgen Sie den Schritten, die in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung für jedes gut.</li>
	<li>Zellulärer Bedienung von 50 µL des WEHI 164 Zellen, verzichtet in drei Brunnen. Bringen jedes gut zu einem Endvolumen von 150 µL mit Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Zytotoxizität Steuerelement aus einer Mischung von 50 µL WEHI 164 Zellen plus 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung. Bringen jedes gut zu einem Endvolumen von 150 µL mit Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Für TNF-Steuerelement verwenden 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung und bringen es auf 150 µL mit dem Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Für den Rohling verwenden 150 µL des Kulturmediums Assay allein.</li>
	<li>Füllen Sie die restlichen Brunnen mit 150 µL Kulturmedium Platte Verdunstung Auswirkungen zu vermeiden.</li>
	Wiederholen Sie die Schritte <li>4.1.1-4.1.9 zweimal in zwei anderen Mikroplatten. 
	Hinweis: Die mAb Endkonzentrationen in die Mikrotestplatte sind: 0.666, 0.333, 0.167 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0,028, 0,014 und 0,004 µg/mL.</li>
	<li>Laden die Proben in Mikrotiterplatten, wie in Abbildung 1 gezeigt. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> Abbildung 1: Disposition der Proben in den Assay Platten. B1 bis G11 sind auch Koordinaten in die Mikrotiterplatten und beschreiben die Positionen, wo die Probe Verdünnungen platziert werden. Fehlende Koordinaten sind Brunnen mit Kontrollen und Assay Kulturmedium (A1-A12 und H1-H12) gefüllt. Diese zufällige Verteilung von Proben (vorwärts- und Verdünnungen der Mikroplatten) hilft, um Verzerrungen in den Ergebnissen aufgrund der Verdunstung des Mediums oder anderen Variablen zu beseitigen. Es wird empfohlen, dass jeder Mikrotestplatte durch ein Analyst zu einem Zeitpunkt erfolgt. R:, S: Referenzprobe, CS: Kontrollprobe, Dil: Verdünnung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a></li>
	<li>Brüten die drei Platten bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 16 ± 2 h.</li>
	<li>Lassen Sie die Caspase 3/7 Glo-Reagenz bei 25 ± 5 ° C für 30 min vor Gebrauch stehen.</li>
	<li>Dieses Reagenz in alle Vertiefungen, einschließlich der Proben und Kontrollen hinzufügen 100 µL.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platten mit einer Mikrotestplatte Vortex Mixer für 3 min bei 25 ± 5 ° C sofort nach der Entnahme in die Vertiefungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten für 2,5 ± 0,5 h bei 25 ± 5 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Legen Sie das MikrofonRoplates in der Luminometer und füllen Sie den nächsten Abschnitt.</li>
</ol> 5. Analyse der Ergebnisse <ol><li>mit einer Software für die Erkennung von Lumineszenz Funktion Lumineszenz-Modus und dem Endpunkt.</li>
	<li>Wählen Sie einen 96-Well Clear-Boden-Platte und seine 80 interne Wells, ausgenommen Spalten 1 und 12.</li>
	<li>Wählen Sie eine Integrationszeit von 1.250 ms und 10 s für das Mischen der Mikrotestplatte vor Lesung.</li>
	<li>Wählen Sie die Brunnen wo Referenzstoff, analytische Substanz und Beispiel für ein Steuerelement platziert werden und identifizieren uns mit ihren entsprechenden Konzentrationen.</li>
	<li>Lesen Sie die Proben in Mikrotiterplatten mit der Luminometer gelegt.</li>
	<li>Verwenden eine vierte Parameter-Gleichung für die Analyse der Ergebnisse. Graph eine Dosis-Wirkungs-Kurve, wie in Abbildung 2 dargestellt. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> Abbildung 2: Dosis-Wirkungs-Kurve. Anti-TNF-mAb-Konzentration im Vergleich zu Lumineszenz (Zellviabilität) wird dargestellt. Eine vierte Parameter-Gleichung beschreibt den Anti-TNF-Schutz der mAbs diente als Vorbild. EC50 ist die Konzentration von mAb, das neutralisieren kann die Menge an TNF, die 50 % Zelltod in jedem Test, beispielhaft in der Grafik als die Veränderung der Neigung verursachen. Bars beschreiben die Standardabweichung der Lumineszenz für jede mAb-Konzentration. X steht für Anti-TNF Ab Konzentration und wird als eine logarithmische Funktion in ng/mL, während y steht für die Lumineszenz-Antwort in willkürlichen Lumineszenz-Einheiten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
	Hinweis: In der vierten Parameter Gleichung, C ist die effektive Konzentration (EC50) 50. Dieser Wert wird verwendet werden, um den Referenzstoff Analyseprobe und Kontrollprobe durch die Effektor-Funktion vergleichen.</li>
	<li>Für die Berechnung der relativen Potenzen, Referenzstoff zu 100 % zu beheben und die Potenzen der Probe zu berechnen und entsprechend zu kontrollieren. 
	Hinweis: Diese Werte sind in Abbildung 3 dargestellt. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> Abbildung 3: mathematische Gleichung zur Berechnung der EC50s und ihre Werte verwendet. EC50-Werte oder C-Parameter haben ihre Unsicherheit als Standardfehler dargestellt. Ein Vergleich der EC50s zwischen der Probe und Referenz Ergebnisse der relative Potenz wird auch dargestellt. Das Konfidenzintervall wird berechnet mit einem α = 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a></li>
</ol>

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<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Diese Charakterisierung hilft apriorische das biologische Verhalten eines Moleküls in der Entwicklung um zu bestimmen, bevor teure und zeitaufwendige klinische Studien durchgeführt werden. Es ist auch nützlich für die Freilassung von Charge zu Charge eines Produkts zugelassenes Medikament. Es ist erwähnenswert, dass diese Tests eignen sich zum bestimmen, ob ein Molekül eine ausreichende biologische Wirkung bezüglich sein Wirkungsmechanismus hat. Die Bio-analytische Methode präsentiert in diesem Tutorial ist von ...

Biologische Potenz ist die quantitative Messung der biologischen Aktivität basierend auf den definierten Produkt-Attribute, die die relevanten biologischen Eigenschaften verknüpft sind, während Menge (in Masse) eine physikalisch-chemische Maßnahme der Proteingehalt ist. Potenz-Tests, zusammen mit anderen analytischen Methoden sind im Rahmen der Produktkonformität, Stabilität und Vergleichbarkeit Studien durchgeführt. In diesem Sinne dienen die Potenz Messungen nachweisen, dass Produktchargen der kritischen Qualitätsattribute (CQAs) oder Akzeptanzkriterien in allen Phasen der klinischen Studien und nach Marktzulassung erfüllen.
Apoptose programmierter Zelltod, natürlich vorkommende, wenn Zellen infiziert sind, mit einem Virus oder wenn die Zellen durch einen ökologischen betonte, dass Kompromisse zellulären Lebensfähigkeit und Funktion1,2Faktor. Unter anderem zählt Apoptose-Hemmung oder biologische Neutralisation, die hauptsächlich bekannten therapeutischen Mechanismen der mAbs, insbesondere bei der Behandlung von chronischen Krankheiten, wie immun-vermittelte entzündliche Erkrankungen. Anti-TNF-Moleküle ausüben ihrer therapeutischen Eigenschaften durch die Blockierung der Interaktion von Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) mit dem p55 und p75 Zelle Oberfläche Rezeptoren3, wodurch Signalwege, die schließlich zur zellulären Apoptose führen.
TNF kann Entzündungen in einigen chronischen Krankheiten4produzieren. TNF wird fälschlicherweise in das extrazelluläre Milieu durch Makrophagen, abgesondert die Wachposten des angeborenen Immunsystems und die Hauptakteure in dieser Art von Krankheit5sind. Als ein gemeinsamer Weg ist TNF Deregulierung der Pathogenese dieser Erkrankungen zugeordnet. Ohne Kontrolle und unter ständiger Induktion und Zelle Stress induziert TNF Tod und Gewebe Zelldegeneration, letztlich zu rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und andere pathologische Profile6.
TNF-Antagonisten, die das Zusammenspiel von TNF und seine Rezeptoren blockieren kamen verstärkt zum Einsatz als eine wirksame Therapie zur Verringerung der Symptomatik und behindern das Fortschreiten dieser Erkrankungen. Heutzutage sind Anti-TNF-Arzneimitteln verbreitet, die systemische Konzentration dieses Zytokin damit Verhinderung weiterer Degeneration der betroffenen Gewebe zu kontrollieren. In diesem Sinne ist es unerlässlich, bietet eine reproduzierbare und robuste Bioassay um zu beschreiben, die spezifische Fähigkeit eines Arzneimittels, seine biologische Wirkung zu erzielen.
In diesem Protokoll, kritischen Schritte bei der Entwicklung eines Neutralisation Assays identifiziert-für die erfolgreiche Messung der biologischen Potenz markiert sind, mit besonderem Schwerpunkt auf die Fähigkeiten, um die Bio-analytische Methode ausgeführt werden. Diese Bio-analytische Methode informiert nützliche Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Chargen oder Anti-TNF Arzneimittel im Vergleich zu einem klinisch getesteten Referenzstoff.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Fibrosarkomzellen aus Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Medium bei 2 &deg; C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Medium bei 2 Grad lagern; C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Medium bei -10 & Grad lagern; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Medium bei 2 > C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-alpha-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Lagern bei -20 > C bis -70 &Grad; C</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (USA), Super Low IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>Lagern bei -10 &de; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (USA), charakterisiert</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>lagern bei -10 &de; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Lagern Sie das Caspase-Glo. 3/7 Substrat und den Caspase-Glo. 3/7 Puffer bei &ndash; 20 &ordm; C geschützt durchLight</td></tr><tr><td>EDTA, Dinatriumsalz, Dihydrat, Kristall, A.C.S. Reagenz</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>-</td></tr><tr><td>-Probe mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Die endgültigen Konzentrationen in der Mikroplatte betragen: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 und 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Referenz und Kontrolle mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>Die Endkonzentrationen in der Mikroplatte sind: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 und 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 Multi-Mode-Mikroplatten-Reader</td></tr><tr><td>Software&nbsp;</td><td>Molekulare Bauelemente</td> <td>-</td> <td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB CO2-Laminar-Flow-Haube mit Umluft</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Die Bäckerfirma&nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>Baker SG603A-HE | Hoher Wirkungsgrad, Klasse II Typ A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

bestimmung der relativen potenz von einer anti-tnf monoklonaler antikörper (mab) durch neutralisieren tnf mit einer in vitro bioanalytische methode

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Dieses Protokoll zeigt die Messung des apoptotischen Aktivität Neutralisierung TNF in einem Fibroblast Zellen Mausmodell (WEHI 164) mit einem Anti-TNF-mAb. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, andere Anti-TNF-Moleküle, wie zum Beispiel Fusionsproteine zu bewerten. Die zelluläre Modell hier beschäftigt ist empfindlich gegen TNF-vermittelten Apoptose, wenn ein zusätzlicher Stressfaktor in Zelle Kulturbedingungen (z. B. Serum Deprivation) induziert wird. Dieses Verfahren ist ein Beispiel für gewusst wie: Ausführen dieser analytische Assay, Hervorhebung der wichtigsten Vorgänge im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung, Zelle Verdünnung Apoptose-Induktion und photometrische Messungen, die entscheidend für die erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten. Dieses Protokoll zeigt die beste Leistung-Bedingungen zur Apoptose-Induktion und effiziente Signal aufzeichnen, was zu niedrigen Unsicherheit Werte.

Dosis-Wirkungs-Diagramm (mit Steuerung) 
Abbildung 1 stellt die Lumineszenz-Antwort gegen mAb Konzentration. Diese sigmoidale Funktion veranschaulicht Caspase 3 und 7 Release Assay Kulturmediums durch Lyse der Zelle. Zelltod wird durch Serum Hunger plus TNF signalisieren Induktion verbessert. Daher interagiert Anti-TNF-Molekül (mAb) mit Zytokin, Hemmung (durch sterische Behinderung) seine Wechselwirkung mit dem TNF-Zelle-Rezeptor. Dadurc...

Ein Protokoll für die Bestimmung der relativen Anti-apoptotische Aktivität eine Anti-TNF-MAB WEHI 164 Zellen eine Neutralisation Mechanismus mit wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll eignet sich für die Neutralisation Stärke der verschiedenen Moleküle mit der gleichen biologischen Funktionen zu vergleichen.

Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relative Potenz von Anti-TNF-alpha-Molekülen zu bestimmen. In diesem Beispiel vergleichen wir zwei monoklonale Anti-TNF-alpha-Antikörper, um die Neutralisationswirksamkeit eines Referenz-mAb im Vergleich zu einem zu untersuchenden Proben-mAb zu ermitteln. Dieses Tutorial zeigt detaillierte Schritte zur Bestimmung der Neutralisationspotenz von TNF-alpha, die in der Literatur nicht enthalten sind. Zellen können durch verschiedene Umweltfaktoren belastet werden, beispielsweise durch Nahrungsmangel. Jede Zelle verfügt über unterschiedliche Proteine auf ihrer Oberfläche, die als Rezeptoren bezeichnet werden. Einige davon sind spezifisch für das Zytokin TNF-alpha.Wenn dieses Molekül mit seinem Rezeptor interagiert und ein spezifisches Signal ausgelöst wird, durchläuft diese Signalgebung in Kombination mit einem Umweltstressfaktor einen programmierten Zelltod, der als Apoptose bezeichnet wird. Im Vorhandensein eines anti-TNF-alpha-Moleküls, das ein monoklonaler Antikörper sein kann, kann das Zytokin durch den mAb titriert werden, wodurch ein Neutralisierungsprozess erfolgt, der den Zellen das Überleben ermöglicht. Somit kann unte

determination-relative-potency-an-anti-tnf-monoclonal-antibody-mab

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Ein ELISA kann leicht zu einem Luminex xMAP Assay umgewandelt werden und durch die Vorteile der Multiplexen mehrere Antikörper gleichzeitig gescreent werden, um eine optimale Antikörperpaar zu identifizieren, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und den Dynamikbereich, während reduzierenden Assay einsehbar.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Bewertung der Wirksamkeit von Antikörpern gegen Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα), ein inflammatorisches Zytokin, durch einen in vitro bioanalytischen Ansatz. Wenn TNFα in gestresste Zellen eingeführt wird, löst es die Apoptose aus. Die Bindung an die Antikörper schränkt TNFα jedoch ein und verhindert so die Apoptose. Der Grad der Apoptose wird mit Hilfe eines Biolumineszenz-Assays quantifiziert.

Eine in vitro Methode zur Bestimmung der anti-apoptotischen Aktivität von Antikörpern gegen TNFα

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Hier präsentieren wir ein umfassendes Kapillarzonenelektrophoreseprotokoll zur Beurteilung der intrinsischen physikochemischen Heterogenität von monoklonalen Antikörpern als Qualitätsmerkmal.

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Dieses Protokoll beschreibt den in vitro - Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.

In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

Erfahren Sie die Bestimmung der relativen Potenz von Anti-TNF-alpha-Antikörpern mit WEHI 164-Zellen. Diese bioanalytische Methode ermöglicht den Vergleich der Neutralisationseffizienz zwischen Referenz- und Proben-Antikörpern.

Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode

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