Name: Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Bestimmung der relativen Potenz von Anti-TNF-alpha-Antikörpern mit WEHI 164-Zellen. Diese bioanalytische Methode ermöglicht den Vergleich der Neutralisationseffizienz zwischen Referenz- und Proben-Antikörpern.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Council of Science und Technology (CONACYT), Mexiko gewähren PEI CONACYT 2015 220333, ohne Teilnahme an das Design der Studie.

1. Vorbereitung der Medien und Lösungen <ol><li>bereiten das Kulturmedium: RPMI-1640 mit 10 % FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Vorbereiten Assay Kulturmedium: RPMI-1640 ohne Phenol rot, aber mit 1 % FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Zelle Waschlösung vorbereiten: DPBS Mg und Ca-freie Lösung mit 0,02 % EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>Zelle Ablösung Lösung vorbereiten: 0,125 % Trypsin mit 1 mM EDTA.
	<ol><li>Auftauen einer 0,25 % igen Lösung von Trypsin-EDTA und Übertragung auf eine sterile 500-mL-Flasche 100 mL.</li>
		<li>Mix mit 100 mL Zelle Waschlösung und 15 mL Aliquots in 15 mL steriles Röhrchen zu verzichten. Shop unter-70 bis-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
		<li>Filtern diese Lösungen durch einen 0,22-µm-Membran und bis zu 37 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch warm.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Apoptose-Induktion-Stammlösung TNF-Lösung bei 3,3 µg/mL.
	<ol><li>Auflösen 20 µg von TNF mit 500 µL Filter-sterilisierte Wasser in seiner primären Container und mischen bis zur vollständigen Auflösung.</li>
		<li>In einem 15 mL steriles Röhrchen zu übertragen und dieses Rohr 5,5 mL des DPBS Mg und Ca-freie Lösung hinzufügen. Mischen Sie sanft mit einem Vortex-Mixer.</li>
		<li>Aliquot der Lösung in 70 µL-Portionen. Verzichten jedes aliquoten in 0,5 mL Mikroröhrchen und bei-80 ° c</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Apoptose Induktion Lösung: TNF-Lösung bei 40 ng/mL.
	<ol><li>Ein Aliquot der Apoptose Induktion Vorratslösung, Inkubation in einem Wasserbad bei 25 ° c für 10 min. Auftauen</li>
		<li>Apoptose-Induktion-Stammlösung auf 40 ng/mL zu verdünnen, indem 4,939 mL Assay Nährmedium in einem 15 mL steriles Röhrchen 61 µL 3,3 µg/mL TNF-Lösung hinzufügen.</li>
		<li>Mix von Vortex Mixer für 10 s; diese Lösung muss vor Gebrauch frisch zubereitet werden.</li>
		<li>Wärmen Sie die Lösung auf 37 ° C für mindestens 30 Minuten vor dem Gebrauch in th Eneutralization Assay.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten die Substratlösung: Caspase 3/7 Glo Lösung 7 , 8.
	<ol><li>Die Caspase-Pufferlösung (Caspase 3/7 Glo Puffer) 12 h vor dem Gebrauch auftauen.</li>
		<li>Lassen die Caspase-Puffer-Lösung und das Substrat (Caspase 3/7 Glo Substrat) separat am 25 ± 5 ° C für 30 min vor dem vermischen sitzen.</li>
		<li>Transfer 10 mL der Pufferlösung Caspase zum Substrat Fläschchen und Mix durch Umkehrung.</li>
		<li>Halten bei 25 ± 5 ° C, lichtgeschützt bis zur Verwendung. 
		Hinweis: Die Lösung ist für 6 h bei Raumtemperatur stabil.</li>
	</ol></li></ol> 2. Zelle Culturing und Counting <ol><li>Zelle Auftauen und die ersten Subkultur.
	<ol><li>Entfernen Sie ein Fläschchen mit WEHI 164 Zellen 9 aus einer Tiefkühltruhe bei-80 ° c und übertragen Sie sie auf einem Eisbad.</li>
		<li>Oben und unten mit 1 mL vorgewärmten Kulturmedium pipette, bis die gefrorenen Zellen vollständig auftauen.</li>
		<li>9 mL vorgewärmten Kulturmedium auf eine 15 mL steriles Röhrchen zu verzichten.</li>
		<li>Übertragen die Zellsuspension in der 15 mL steriles Röhrchen und mischen Sie fünfmal durch Umkehrung.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 125 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und die Zelle Pellet disaggregieren.</li>
		<li>5 mL Kulturmedium hinzufügen das Rohr. Mischen, bis die Zellen völlig Nukleinsäuretablette sind.</li>
		<li>Für Zellzählung, 50 µL Zellsuspension auf einer 500 µL Reaktionscup und vermischen sich mit 50 µL 0,4 % Trypan Blau übertragen. Zählen der Zellen und passen Sie auf 0,5 x 10 6 Zellen/mL. Schritt 2.2, s.u..</li>
		<li>75 mL Zelle Kultur Kolben 13 mL vorgewärmten Kulturmedium hinzufügen.</li>
		<li>Genügend Aussetzung Zellvolumen aus Schritt 2.1.6 0,5 x 10 6 Zellen/mL in der Zelle-Kultur-Kolben und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO 2 zu verzichten.</li>
	</ol></li> <li>Zellzählung. 
	Hinweis: Siehe Referenz 10.
	<ol><li>Mit der Lösung von Schritt 2.1.6, 0,05 mL auf eine Hemocytometer übertragen und bestimmen die Zelldichte unter dem Mikroskop verwenden Trypan blau Ausgrenzung.</li>
		<li>Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen zu quantifizieren.</li>
		<li>Einstellen der Zellsuspensionen 0,5 x 10 6 Zellen/mL. 
		Formel 1 
		V Kulturmedium (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V Kulturmedium (mL) = (5 mL - V Zellsuspension) V Kulturmedium (mL) = angepasste Lautstärke des WEHI 164 Zell-Aussetzung NVC = Anzahl der lebensfähigen WEHI 164 Zellen/mL V Kulturmedium (mL) = Assay Kulturmedium Volumen hinzugefügt, um die Zellsuspension zu 0,5 x 10 6 Zellen/mL 0,5 x 10 6 = Ziel Zelldichte</li>
	</ol></li> <li>Zell-Distanz und der zweiten und dritten Subkultur. 
	Hinweis: Ein Vakuumsystem kann verwendet werden, um die Lösungen aus den Kolben zu entfernen. Einweg- oder Glas sterile Pipetten können verwendet werden. Wenn die Pipette eine Baumwolle Verstopfung hat an der Spitze, sie muss vor dem Gebrauch entfernt werden.
	<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Zellkultur T-Kolben mit einer 1 mL sterilen Pipette und ein Vakuum.</li>
		<li>Zelle waschen verzichten 5 mL Lösung in die Kultur T-Kolben, vorsichtig mischen und die Lösung zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. 
		Hinweis: Die vollständige Entfernung des Kulturmediums ist entscheidend für effiziente Zelle Loslösung.</li>
		<li>T-Kolben 15 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzu und lassen Sie stehen für 3 min in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
		<li>Stellen Sie sicher das Fehlen der angeschlossenen Zellen in die Innenwand der Flasche unter die Lupe genommen. Entfernen Sie die Zellen aus der Kultur T-Kolben mit einer sterilen 20 mL-Pipette und verzichten sie in ein steriles Röhrchen 50 mL.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 125 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und das Pellet mit einem anderen 5 mL Kulturmedium Aufschwemmen.</li>
		<li>Der Zellen zu zählen und fügen Sie genug Nährmedium zur Erreichung der gewünschten Zellkonzentration nach Gleichung 1.</li>
		<li>72 cm 2 T Kolben dieser Suspension hinzu und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
		<li>Subkultur assay die Zellen mindestens zwei Mal vor der Verwendung in der Neutralisation. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1-2.3.8 für die nächsten zwei Tage.</li>
	</ol></li> <li>Assay Zellsuspension.
	<ol><li>Wählen Sie eine WEHI-164-Subkultur, die mindestens drei Pässe hat. Siehe Schritt 2.1.</li>
		<li>Trennen und die Zellen entsprechend Schritte 2.2 und 2.3 dieses Protokolls zählen.</li>
		<li>Verdünnen die Zellsuspension nach Gleichung 1 0,5 x 10 6 Zellen/mL.</li>
		<li>Verwenden diese Zellsuspension für die Neutralisation Assay. Mischen Sie alle Zellsuspensionen von Vortex Mixer vor dem Gebrauch.</li>
	</ol></li></ol> 3. Antikörper-Vorbereitung und Verdünnungen <ol><li>Quantifizierung der mAbs.
	<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration der Referenzstoff Kontrollprobe und analytische Probe durch UV-Absorption bei 280 nm mit ihren Massensterben Koeffizient (1,39) 11. 
		Hinweis: Original Konzentrationen könnten Drogen Produktetiketten entnommen werden. Allerdings muss dies durch UV-Absorption überprüft.</li>
	</ol></li> <li>mAb Verdünnungen.
	<ol><li>Verdünnt alle Proben unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung, mit DPBS Mg und Ca-frei in 2 mL Mikroröhrchen bis 2 mg/mL Lösung. Bestätigen Sie diese Konzentration durch UV-Absorption in dreifacher Ausfertigung, mit DPBS Mg und Ca-freie Lösung als Rohling.</li>
		<li>Mischen die Lager Proteinlösungen für 5 s mit einem Vortex-Mixer.</li>
		<li>Verdünnen 100 µL jeder 2 mg/mL-mAb-Lösung mit 0,9 mL Kulturmedium Assay.</li>
		<li>Mix für 5 s von Vortex Mixer. 
		Hinweis: Diese Lösungen haben eine Konzentration von 200 µg/mL. Verdünnungen erfolgen für jedes dreifacher.</li>
		<li>Zu verdünnen, 10 & #181; L jede 200 µg/mL-mAb-Lösung mit 0,99 mL Kulturmedium Assay. Mix für 5 s mit einem Vortex-Mixer. Diese Lösungen haben eine Konzentration von 2 µg/mL. Verdünnungsreihen für jedes dreifacher durchführen, vor der Verwendung in der Neutralisation Test.</li>
		<li>Anti-TNF mAb Verdünnungen in drei unabhängige Mikroplatten machen. Machen Sie ein Duplikat jedes unabhängige dreifacher Ausfertigung zu und verzichten sie in einer Mikrotestplatte zu, wie in Tabelle 1 angegeben. Bezug Stoff < tabelle Fo:keep-together.within-seite = "1" Fo:keep-mit-next.within-seite = "immer" Fo:text-ausrichten = "center" > <tbody><tr><td colspan="2"> Platte 1</td> <td colspan="2"> Platte 2</td>
					<td colspan="2"> Platte 3</td></tr>
				<tr><td>Wells</td> <td>Probe</td> <td>Wells</td> <td>Probe</td> <td>Wells</td> <td>Probe</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> Kontrollprobe</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> analytische Probe</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> analytische Probe</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> Kontrollprobe</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Beispiel für ein Steuerelement</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Analyseprobe</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> Referenzstoff</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> Tabelle 1: Mikrotestplatte Probe Arrays. Ein vollständige Neutralisation Assay muss in drei Mikrotiterplatten in Koordinaten B2 G11 ausgeführt werden. Gelegentliche Abgabe von Verweis, analytische, und Kontrollproben erlauben Forschern, jede Bias in der Probe zu überprüfen.</li>
		<li>Perform mAb Verdünnungen von jeder Referenz probieren oder zu steuern, wie in Tabelle 2 dargestellt. 
		Hinweis: Die Anti-TNF-mAb-Konzentrationen in dieser Tabelle beschriebenen sind nicht die Endkonzentrationen in der Neutralisation Assay.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Platte Spalte</td> <td>Volumen der Assay-Nährmedium (μL)</td> <td>Volumen Referenzstoff, analytische Probe oder Kontrolle Probe (uL)</td> <td>Konzentration in der Probe-Platte (ng/mL)</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>150 von Linie 2</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 von Zeile 3</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>50 von Zeile 3</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 4</td> < td > 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 5</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 6</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 her m-Linie 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 von Linie 9</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>75 von Zeile 10</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T Möglichkeit 2: Anti-TNF mAb Verdünnungen. Serielle Verdünnungen von Anti-TNF mAbs sind in dieser Tabelle gezeigt. In dieser Tabelle beschriebenen Endkonzentrationen sind nicht die Konzentration in der Probe wo Anti-TNF mAbs wurden um den Faktor 3 (Kulturmedium, mAb Verdünnung + Zellen Aussetzung) verdünnt. Linien in Fettdruck stellen Verdünnungen aus Linien 3, 5, 7, 9 und 10; nicht fett gedruckten Linien stehen für Verdünnung von Linien 3, 4 und 6. Diese serielle Verdünnungen werden kurz vor Durchführung der Neutralisierung-Assay durchgeführt. Muss darauf geachtet werden, zu mischen, durch Pipettieren rauf und runter dreimal vor der Abgabe der Verdünnungen.</li>
		<li>Halten die Platten bei 25 ± 5 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol></li></ol> 4. Neutralisation Assay mit WEHI 164 Zellen <ol><li>Mix durch alle Suspensionen (0,5 x 10 6 Zellen/mL) Zelle vor Abgabe bei jedem Schritt dieses Protokolls vortexen. 
	Hinweis: In diesem Abschnitt, jede Lösung auf 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch warm.</li>
	<li>Übertragen 50 µL Zellsuspension zu jedem der 60 Brunnen von Mikrotiterplatten, Umzug von Spalte 2 bis 11 und Linie B bis G.</li>
	<li>Transfer 50 µL der mAb-Referenz, Probe und Kontrolle Verdünnungen in Mikrotiterplatten. Folgen Sie den Schritten, die in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung für jedes gut.</li>
	<li>Zellulärer Bedienung von 50 µL des WEHI 164 Zellen, verzichtet in drei Brunnen. Bringen jedes gut zu einem Endvolumen von 150 µL mit Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Zytotoxizität Steuerelement aus einer Mischung von 50 µL WEHI 164 Zellen plus 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung. Bringen jedes gut zu einem Endvolumen von 150 µL mit Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Für TNF-Steuerelement verwenden 50 µL der Apoptose-Induktion-Lösung und bringen es auf 150 µL mit dem Assay Kulturmedium.</li>
	<li>Für den Rohling verwenden 150 µL des Kulturmediums Assay allein.</li>
	<li>Füllen Sie die restlichen Brunnen mit 150 µL Kulturmedium Platte Verdunstung Auswirkungen zu vermeiden.</li>
	Wiederholen Sie die Schritte <li>4.1.1-4.1.9 zweimal in zwei anderen Mikroplatten. 
	Hinweis: Die mAb Endkonzentrationen in die Mikrotestplatte sind: 0.666, 0.333, 0.167 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0,028, 0,014 und 0,004 µg/mL.</li>
	<li>Laden die Proben in Mikrotiterplatten, wie in Abbildung 1 gezeigt. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> Abbildung 1: Disposition der Proben in den Assay Platten. B1 bis G11 sind auch Koordinaten in die Mikrotiterplatten und beschreiben die Positionen, wo die Probe Verdünnungen platziert werden. Fehlende Koordinaten sind Brunnen mit Kontrollen und Assay Kulturmedium (A1-A12 und H1-H12) gefüllt. Diese zufällige Verteilung von Proben (vorwärts- und Verdünnungen der Mikroplatten) hilft, um Verzerrungen in den Ergebnissen aufgrund der Verdunstung des Mediums oder anderen Variablen zu beseitigen. Es wird empfohlen, dass jeder Mikrotestplatte durch ein Analyst zu einem Zeitpunkt erfolgt. R:, S: Referenzprobe, CS: Kontrollprobe, Dil: Verdünnung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a></li>
	<li>Brüten die drei Platten bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 16 ± 2 h.</li>
	<li>Lassen Sie die Caspase 3/7 Glo-Reagenz bei 25 ± 5 ° C für 30 min vor Gebrauch stehen.</li>
	<li>Dieses Reagenz in alle Vertiefungen, einschließlich der Proben und Kontrollen hinzufügen 100 µL.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platten mit einer Mikrotestplatte Vortex Mixer für 3 min bei 25 ± 5 ° C sofort nach der Entnahme in die Vertiefungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten für 2,5 ± 0,5 h bei 25 ± 5 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Legen Sie das MikrofonRoplates in der Luminometer und füllen Sie den nächsten Abschnitt.</li>
</ol> 5. Analyse der Ergebnisse <ol><li>mit einer Software für die Erkennung von Lumineszenz Funktion Lumineszenz-Modus und dem Endpunkt.</li>
	<li>Wählen Sie einen 96-Well Clear-Boden-Platte und seine 80 interne Wells, ausgenommen Spalten 1 und 12.</li>
	<li>Wählen Sie eine Integrationszeit von 1.250 ms und 10 s für das Mischen der Mikrotestplatte vor Lesung.</li>
	<li>Wählen Sie die Brunnen wo Referenzstoff, analytische Substanz und Beispiel für ein Steuerelement platziert werden und identifizieren uns mit ihren entsprechenden Konzentrationen.</li>
	<li>Lesen Sie die Proben in Mikrotiterplatten mit der Luminometer gelegt.</li>
	<li>Verwenden eine vierte Parameter-Gleichung für die Analyse der Ergebnisse. Graph eine Dosis-Wirkungs-Kurve, wie in Abbildung 2 dargestellt. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> Abbildung 2: Dosis-Wirkungs-Kurve. Anti-TNF-mAb-Konzentration im Vergleich zu Lumineszenz (Zellviabilität) wird dargestellt. Eine vierte Parameter-Gleichung beschreibt den Anti-TNF-Schutz der mAbs diente als Vorbild. EC50 ist die Konzentration von mAb, das neutralisieren kann die Menge an TNF, die 50 % Zelltod in jedem Test, beispielhaft in der Grafik als die Veränderung der Neigung verursachen. Bars beschreiben die Standardabweichung der Lumineszenz für jede mAb-Konzentration. X steht für Anti-TNF Ab Konzentration und wird als eine logarithmische Funktion in ng/mL, während y steht für die Lumineszenz-Antwort in willkürlichen Lumineszenz-Einheiten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
	Hinweis: In der vierten Parameter Gleichung, C ist die effektive Konzentration (EC50) 50. Dieser Wert wird verwendet werden, um den Referenzstoff Analyseprobe und Kontrollprobe durch die Effektor-Funktion vergleichen.</li>
	<li>Für die Berechnung der relativen Potenzen, Referenzstoff zu 100 % zu beheben und die Potenzen der Probe zu berechnen und entsprechend zu kontrollieren. 
	Hinweis: Diese Werte sind in Abbildung 3 dargestellt. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> Abbildung 3: mathematische Gleichung zur Berechnung der EC50s und ihre Werte verwendet. EC50-Werte oder C-Parameter haben ihre Unsicherheit als Standardfehler dargestellt. Ein Vergleich der EC50s zwischen der Probe und Referenz Ergebnisse der relative Potenz wird auch dargestellt. Das Konfidenzintervall wird berechnet mit einem α = 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Diese Charakterisierung hilft apriorische das biologische Verhalten eines Moleküls in der Entwicklung um zu bestimmen, bevor teure und zeitaufwendige klinische Studien durchgeführt werden. Es ist auch nützlich für die Freilassung von Charge zu Charge eines Produkts zugelassenes Medikament. Es ist erwähnenswert, dass diese Tests eignen sich zum bestimmen, ob ein Molekül eine ausreichende biologische Wirkung bezüglich sein Wirkungsmechanismus hat. Die Bio-analytische Methode präsentiert in diesem Tutorial ist von ...

Biologische Potenz ist die quantitative Messung der biologischen Aktivität basierend auf den definierten Produkt-Attribute, die die relevanten biologischen Eigenschaften verknüpft sind, während Menge (in Masse) eine physikalisch-chemische Maßnahme der Proteingehalt ist. Potenz-Tests, zusammen mit anderen analytischen Methoden sind im Rahmen der Produktkonformität, Stabilität und Vergleichbarkeit Studien durchgeführt. In diesem Sinne dienen die Potenz Messungen nachweisen, dass Produktchargen der kritischen Qualitätsattribute (CQAs) oder Akzeptanzkriterien in allen Phasen der klinischen Studien und nach Marktzulassung erfüllen.
Apoptose programmierter Zelltod, natürlich vorkommende, wenn Zellen infiziert sind, mit einem Virus oder wenn die Zellen durch einen ökologischen betonte, dass Kompromisse zellulären Lebensfähigkeit und Funktion1,2Faktor. Unter anderem zählt Apoptose-Hemmung oder biologische Neutralisation, die hauptsächlich bekannten therapeutischen Mechanismen der mAbs, insbesondere bei der Behandlung von chronischen Krankheiten, wie immun-vermittelte entzündliche Erkrankungen. Anti-TNF-Moleküle ausüben ihrer therapeutischen Eigenschaften durch die Blockierung der Interaktion von Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) mit dem p55 und p75 Zelle Oberfläche Rezeptoren3, wodurch Signalwege, die schließlich zur zellulären Apoptose führen.
TNF kann Entzündungen in einigen chronischen Krankheiten4produzieren. TNF wird fälschlicherweise in das extrazelluläre Milieu durch Makrophagen, abgesondert die Wachposten des angeborenen Immunsystems und die Hauptakteure in dieser Art von Krankheit5sind. Als ein gemeinsamer Weg ist TNF Deregulierung der Pathogenese dieser Erkrankungen zugeordnet. Ohne Kontrolle und unter ständiger Induktion und Zelle Stress induziert TNF Tod und Gewebe Zelldegeneration, letztlich zu rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und andere pathologische Profile6.
TNF-Antagonisten, die das Zusammenspiel von TNF und seine Rezeptoren blockieren kamen verstärkt zum Einsatz als eine wirksame Therapie zur Verringerung der Symptomatik und behindern das Fortschreiten dieser Erkrankungen. Heutzutage sind Anti-TNF-Arzneimitteln verbreitet, die systemische Konzentration dieses Zytokin damit Verhinderung weiterer Degeneration der betroffenen Gewebe zu kontrollieren. In diesem Sinne ist es unerlässlich, bietet eine reproduzierbare und robuste Bioassay um zu beschreiben, die spezifische Fähigkeit eines Arzneimittels, seine biologische Wirkung zu erzielen.
In diesem Protokoll, kritischen Schritte bei der Entwicklung eines Neutralisation Assays identifiziert-für die erfolgreiche Messung der biologischen Potenz markiert sind, mit besonderem Schwerpunkt auf die Fähigkeiten, um die Bio-analytische Methode ausgeführt werden. Diese Bio-analytische Methode informiert nützliche Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Chargen oder Anti-TNF Arzneimittel im Vergleich zu einem klinisch getesteten Referenzstoff.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Fibrosarkomzellen aus Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Medium bei 2 &deg; C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Medium bei 2 Grad lagern; C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Medium bei -10 & Grad lagern; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Medium bei 2 > C bis 8 &Grad; C</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-alpha-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Lagern bei -20 > C bis -70 &Grad; C</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (USA), Super Low IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>Lagern bei -10 &de; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (USA), charakterisiert</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>lagern bei -10 &de; C bis -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Lagern Sie das Caspase-Glo. 3/7 Substrat und den Caspase-Glo. 3/7 Puffer bei &ndash; 20 &ordm; C geschützt durchLight</td></tr><tr><td>EDTA, Dinatriumsalz, Dihydrat, Kristall, A.C.S. Reagenz</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>-</td></tr><tr><td>-Probe mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Die endgültigen Konzentrationen in der Mikroplatte betragen: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 und 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Referenz und Kontrolle mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>Die Endkonzentrationen in der Mikroplatte sind: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 und 0,004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 Multi-Mode-Mikroplatten-Reader</td></tr><tr><td>Software&nbsp;</td><td>Molekulare Bauelemente</td> <td>-</td> <td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB CO2-Laminar-Flow-Haube mit Umluft</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Die Bäckerfirma&nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>Baker SG603A-HE | Hoher Wirkungsgrad, Klasse II Typ A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

bestimmung der relativen potenz von einer anti-tnf monoklonaler antikörper (mab) durch neutralisieren tnf mit einer in vitro bioanalytische methode

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Dieses Protokoll zeigt die Messung des apoptotischen Aktivität Neutralisierung TNF in einem Fibroblast Zellen Mausmodell (WEHI 164) mit einem Anti-TNF-mAb. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, andere Anti-TNF-Moleküle, wie zum Beispiel Fusionsproteine zu bewerten. Die zelluläre Modell hier beschäftigt ist empfindlich gegen TNF-vermittelten Apoptose, wenn ein zusätzlicher Stressfaktor in Zelle Kulturbedingungen (z. B. Serum Deprivation) induziert wird. Dieses Verfahren ist ein Beispiel für gewusst wie: Ausführen dieser analytische Assay, Hervorhebung der wichtigsten Vorgänge im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung, Zelle Verdünnung Apoptose-Induktion und photometrische Messungen, die entscheidend für die erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten. Dieses Protokoll zeigt die beste Leistung-Bedingungen zur Apoptose-Induktion und effiziente Signal aufzeichnen, was zu niedrigen Unsicherheit Werte.

Dosis-Wirkungs-Diagramm (mit Steuerung) 
Abbildung 1 stellt die Lumineszenz-Antwort gegen mAb Konzentration. Diese sigmoidale Funktion veranschaulicht Caspase 3 und 7 Release Assay Kulturmediums durch Lyse der Zelle. Zelltod wird durch Serum Hunger plus TNF signalisieren Induktion verbessert. Daher interagiert Anti-TNF-Molekül (mAb) mit Zytokin, Hemmung (durch sterische Behinderung) seine Wechselwirkung mit dem TNF-Zelle-Rezeptor. Dadurc...

Ein Protokoll für die Bestimmung der relativen Anti-apoptotische Aktivität eine Anti-TNF-MAB WEHI 164 Zellen eine Neutralisation Mechanismus mit wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll eignet sich für die Neutralisation Stärke der verschiedenen Moleküle mit der gleichen biologischen Funktionen zu vergleichen.

Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relative Potenz von Anti-TNF-alpha-Molekülen zu bestimmen. In diesem Beispiel vergleichen wir zwei monoklonale Anti-TNF-alpha-Antikörper, um die Neutralisationswirksamkeit eines Referenz-mAb im Vergleich zu einem zu untersuchenden Proben-mAb zu ermitteln. Dieses Tutorial zeigt detaillierte Schritte zur Bestimmung der Neutralisationspotenz von TNF-alpha, die in der Literatur nicht enthalten sind. Zellen können durch verschiedene Umweltfaktoren belastet werden, beispielsweise durch Nahrungsmangel. Jede Zelle verfügt über unterschiedliche Proteine auf ihrer Oberfläche, die als Rezeptoren bezeichnet werden. Einige davon sind spezifisch für das Zytokin TNF-alpha.Wenn dieses Molekül mit seinem Rezeptor interagiert und ein spezifisches Signal ausgelöst wird, durchläuft diese Signalgebung in Kombination mit einem Umweltstressfaktor einen programmierten Zelltod, der als Apoptose bezeichnet wird. Im Vorhandensein eines anti-TNF-alpha-Moleküls, das ein monoklonaler Antikörper sein kann, kann das Zytokin durch den mAb titriert werden, wodurch ein Neutralisierungsprozess erfolgt, der den Zellen das Überleben ermöglicht. Somit kann unter standardisierter Methodik die Neutralisierungsstärke eines Moleküls gemessen werden.Dieses Protokoll wird derzeit über fünf Tage durchgeführt. Am ersten Tag müssen Lösungen für die Zellkultur vorbereitet werden. Zusätzlich werden WEHI 164-Zellen aufgetaut und unterkultiviert.Am zweiten und dritten Tag muss die Konfluenz der Zellen überprüft werden. Danach müssen die Zellen abgelöst, gezählt, die Zelldichte angepasst und schließlich erneut kultiviert werden. Alle diese Schritte müssen täglich durchgeführt werden.Am vierten Tag muss die mAK-Konzentration durch UV-Absorption bestimmt und die Antikörper verdünnt werden. Lösungen zur Apoptoseinduktion werden hergestellt. Schließlich sollte die Zelldichte der WEHI 164-Zellen auf eine halbe Million Zellen pro mL eingestellt werden.Am fünften Tag wird die Substratlösung zur Detektion apoptotischer Zellen hergestellt und die spektrophotometrische Analyse durchgeführt. Abschließend wird die in-silico-Analyse der Ergebnisse besprochen. Alle in diesem Protokoll verwendeten Lösungen sind auf dieser Folie dargestellt.Am ersten Tag muss diese Lösung vor Beginn der Durchführung des Protokolls vorbereitet werden, mit Ausnahme der Apoptoseinduktions- und Substratlösungen, die unmittelbar nach der Rekonstitution verwendet werden müssen. Zu Beginn dieses Protokolls müssen die gefrorenen Zellen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen werden. Das Gefäß mit den gefrorenen WEHI-Zellen muss bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden.Halten Sie Ihren Arbeitsplatz sauber und vor der Durchführung jeglicher Tätigkeiten desinfiziert, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Überführen Sie das Isothermgestell in die laminare Luftstromhaube und geben Sie neun mL vorgewärmtes Kulturmedium in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die WEHI 164-Zellen mit einem mL vorgewärmtem Kulturmedium durch vorsichtiges Auf- und Ab-Pipettieren, bis die gefrorenen Zellen vom Mikroröhrchen abgelöst sind.Mischen Sie durch fünfmaliges Vorsichtiges Umstülpen, bis die gefrorenen Zellen vollständig aufgetaut sind. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 125 g für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Zellpellet auf.Geben Sie fünf mL des vorgewärmten Kulturmediums in das Reagenzglas und mischen Sie die Suspension, bis die Zellen vollständig resuspendiert sind. Überführen Sie die Zellen in einen T-Kulturkolben und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Jeden Tag vor dem Abtrennen und Zählen der kultivierten Zellen ist es zwingend erforderlich, die Kulturgesundheit unter dem Mikroskop zu überprüfen.Der Forscher muss die Zellgesundheit, Vitalität und Zelldichte für die Unterpflanzung überprüfen. Diese Überprüfung muss ebenfalls für den biologischen Assay durchgeführt werden. Zunächst muss die Abwesenheit biologischer Kontaminationen, beispielsweise von Bakterien, verifiziert werden.Zweitens kann die Zellgesundheit anhand der Konfluenz überprüft werden. Eine Konfluenz von über 90 % ist ausreichend, um gute Ergebnisse zu erzielen. Falls die Zellen jedoch die gewünschte Zelldichte noch nicht erreicht haben, muss der Kolben in den Inkubator zurückgestellt und so lange gewartet werden, bis die Zellen die gewünschte Zelldichte und Konfluenz erreicht haben.Das alte Kulturmedium muss aus dem T-Kolben entfernt werden. Spülen Sie die anhaftenden Zellen an den Wänden des T-Kolbens mit fünf mL der Zellwaschlösung ab. Achten Sie darauf, die anhaftenden Zellen nicht zu entfernen.Manuell mischen, um Reste des Kulturmediums und Zelltrümmer zu entfernen. Dieser Schritt muss zweimal durchgeführt werden. Restliche Waschlösungen unter Vakuum entfernen und drei mL der Zellablösungslösung hinzufügen.Unter Rühren drei Minuten lang inkubieren. Nach Beendigung der Inkubation vorgewärmtes Kulturmedium dem T-Fläschchen zugeben, um das Enzym zu inaktivieren, und die Zellen gewinnen.Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Röhrchen und zentrifugieren Sie. Identifizieren Sie das Zellpellet und entfernen Sie den Überstand. Das Entfernen des alten Kulturmediums ist entscheidend für die Kultivierung gesunder Zellen.Lösen Sie das Zellpellet auf und resuspendieren Sie die Zellen in fünf mL des vorgewärmten Kulturmediums. Überführen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikroröhrchen. Zählen Sie die Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode.Zählen Sie die Zellen und bestimmen Sie die Zellviabilität. Sobald die Anzahl der vitalen Zellen bekannt ist, stellen Sie mithilfe der folgenden Formel 15 mL des Kulturmediums auf eine Zelldichte von einer halben Million Zellen pro mL ein. Übertragen Sie 15 mL der angepassten Zellsuspension in einen T-Kulturkolben und inkubieren Sie über Nacht.Dieser gesamte Kulturprozess muss mindestens einmal erneut durchgeführt werden, insgesamt also dreimal Zellpassagen, bevor der Neutralisationstest begonnen wird. Am vierten Tag die optische Dichte der Referenzsubstanz, der Analyseprobe und der Kontrollprobe durch UV-Absorption bei 280 Nanometern messen. Für jede Probe eine erste Verdünnung auf zwei Milligramm pro mL mit dem Assay-Kulturmedium in unabhängigen Triplicaten durchführen.Führen Sie eine zweite Verdünnung auf zwei Mikrogramm pro mL für jede mAb-Probe durch. Geben Sie 75 Mikroliter des Assay-Kulturmediums in die 60 Vertiefungen in der Mitte einer Polystyrol-Mikroplatte. Fügen Sie 230 Mikroliter Referenzsubstanz in die Vertiefungen 2B und 2C hinzu.Analyseproben in den Vertiefungen 2D und 2E. Und schließlich die Kontrollprobe in den Vertiefungen 2F und 2G. Eine Kontrollprobe ist ein Molekül mit einer bekannten relativen Potenz. Danach serielle Verdünnungen in der Mikrotiterplatte durchführen. Ein Beispiel ist in den folgenden Folien dargestellt. Denken Sie daran, die Lösungen vor der Zugabe in die Vertiefungen gründlich zu mischen.Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Stellen Sie die Zellsuspension vorab auf eine halbe Million Zellen pro mL ein und geben Sie sie mit einem Dispenser ab. Fügen Sie 50 µL Zellsuspension in die inneren 60 Vertiefungen der Testplatte hinzu, beginnend mit der zweiten Spalte bis zur elften.Vor dem Hinzufügen der Flüssigkeit zur Mikroplatte die Zellsuspension mischen. Sofort 50 Mikroliter der mAb-Verdünnungen in die Testplatte überführen. Bei gepaarten Reihen die Verdünnungen geben, indem der Mikropipettierer gedreht wird.Die mAb-Verdünnungen können in die Vertiefungen in der folgenden Reihenfolge pipettiert werden, wobei die Kontrollen in die umliegenden Vertiefungen gegeben werden. Verdünnen Sie TNF-alpha mit 500 Mikrolitern ultrareinem Wasser. Mischen Sie durch Vortexen bei 2200 U/min.In ein 15-mL-Gefäß überführen und schließlich mit Assay-Kulturmedium auf 40 Nanogramm pro mL verdünnen. 50 Mikroliter der Apoptoseinduktionslösung in die 60 inneren Assay-Vertiefungen pipettieren. 50 Mikroliter der Apoptoseinduktionslösung in die 60 inneren Assay-Vertiefungen pipettieren.Letztendlich 16 Stunden inkubieren. Am fünften Tag das Substrat gemäß den Herstelleranweisungen mit dieser Pufferlösung rekonstituieren. Durch fünfmaliges Umstülpen mischen.Geben Sie die Substratlösung hinzu. Fügen Sie außerdem 50 Mikroliter der Substratlösung in jedes Probenloch der Assayplatte hinzu. Geben Sie ebenfalls Substrat zu den Kontrollen hinzu.Schütteln Sie die Testplatte drei Minuten lang in einem Vortex-Mischer bei 400 U/min. Nehmen Sie die Testplatte aus dem Mixer und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur. Schalten Sie ein Plattenlesegerät-Spektrophotometer ein.Öffnen Sie die SoftMax Pro-Software oder ein gleichwertiges Programm. Laden Sie die Mikroplatte in das Spektrophotometer ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein. Aktivieren Sie die Lumineszenzfunktion und die Messart in der Endpunkt-Funktion.Passen Sie den Lesebereich an, wobei die Spalten eins und 12 ausgeschlossen werden. Wählen Sie den Platten-Typ „96-Well-Standard-Mikroplatte mit klarem Boden“. Ändern Sie die Integrationszeit auf bis zu 1250 Millisekunden. Stellen Sie die Schütteldauer für die Mikrotiterplatte auf 10 Sekunden ein. Wählen Sie die Vertiefung aus, in der die Referenzsubstanz, die Analytsubstanz und die Kontrollprobe platziert werden. Beginnen Sie mit dem Auslesen.Die Ergebnisse in diesem Assay sind die Antwortkurven, die als Lumineszenz im Vergleich zu den Logarithmusskalen der mAb-Konzentration dargestellt werden. Die Wendepunkte dieser Kurven entsprechen den wirksamen Konzentrationen, EC50 für jeden mAb. C oder EC50 wird in Nanogramm pro mL angegeben.Dieser Wert hat jedoch für sich genommen keine Bedeutung, wenn er nicht mit der Referenzprobe verglichen wird. Daher wird die Potenz einer Analyseprobe in Prozent ausgedrückt und als relative Potenz bezeichnet. Die relative Potenz ist der Mittelwert aus drei unabhängigen Mikroplatten-Ergebnissen und ergibt sich entsprechend aus dem EC50-Wert jeder Platte.Der Vergleich zwischen Kontrollproben und Referenzproben hilft dabei, Abweichungen oder systematische Fehler im aktuellen Assay zu erkennen. Der Vergleich der Referenzprobe mit einer Analyseprobe ermöglicht die Bestimmung der relativen Potenz. Diese Tabelle zeigt die relative Potenz der mAK und ihr Konfidenzintervall bei 95 % an. Außerdem wird die relative Standardabweichung jeder Probe in Bezug auf die Potenz der Referenzsubstanz dargestellt.Ein relativer Standardfehler von mehr als 15 % gilt als nicht akzeptabel. Diese Charakterisierung hilft dabei, a priori das biotische Verhalten eines in der Entwicklung befindlichen Moleküls festzustellen, bevor kostspielige und zeitaufwändige klinische Studien durchgeführt werden. Außerdem ist sie nützlich für die Freigabe von Chargen eines zugelassenen Produkts. Es ist unsere Überzeugung, dass diese Assays hilfreich sind, um festzustellen, ob ein Molekül eine ausreichende biologische Wirkung im Hinblick auf seinen Wirkmechanismus aufweist. Als Teil biophysikalischer Methoden kann diese Methodik auf biologischem Weg die Wirksamkeit und Effizienz der Qualität und Eigenschaften eines Arzneimittels bestimmen und somit die vollständige und umfassende Bedeutung seiner Effektorfunktionen aufzeigen.

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Forschung

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Medizin

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Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode

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