Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs
September 10th, 2017
Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.
Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. das TCR-Alpha- und Beta-Repertoire der spezifischen Population eines Antigens sowie die In-vivo-Funktionalität menschlicher TCRs. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die relativ hohe Effizienz der PCR-Reaktion sowie ihre Kompatibilität mit der anschließenden TCR-Klonierung. Dieses Protokoll verwendet eine zweistufige PCR, um die TCR-Alpha- und -Beta-Ketten aus einer einzelnen Zelle ohne vorherige Kenntnis der TCR-Sequenz zu amplifizieren.
Die erste PCR ist eine Multiplex-Reaktion unter Verwendung eines Pools von Alpha- oder Beta-Primern mit variabler Region in Verbindung mit einem Primer, der für die konstante Region spezifisch ist. Die zweite PCR ist eine verschachtelte Reaktion, die von der Adaptersequenz ausgeht, die am fünf Primzahlen des PCR-Produkts eingebaut ist, sowie von einer internen Sequenz im konstanten Bereich. Diese Primer enthalten auch einzigartige Restriktionsstellen in die fünf Prime- und drei Prime-Enden des PCR-Produkts, um die anschließende Klonierung zu erleichtern.
Nach dem Klonen in den Template-Vektor ist die kodierte TCR-Sequenz chimerisch und besteht aus menschlichen variablen Regionen mit spiegelnden konstanten Regionen. Das chimäre TCR-Konstrukt ermöglicht die Interaktion zwischen dem TCR und dem spiegelnden CD3-Signalkomplex, wodurch dieses TCR-Klonierungsprotokoll mit nachfolgenden funktionellen Studien in spiegelnden Zelllinien und in humanisierten Mausmodellen kompatibel ist. Richten Sie sich für die Einzelzellsortierung ein, indem Sie die Reagenzien für die reverse Transkription in einem sauberen, vorlagenfreien Bereich vorbereiten.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Einzelzell-PCR-Methode sind, aufgrund der geringen Matrizenmengen Schwierigkeiten haben. Auf der anderen Seite ist die Sensitivität der Multiplex-Nested-PCR empfindlich gegenüber einem geringen Grad an Template-Kontamination. Daher ist es notwendig, die Bereiche, in denen Sie die PCR-Reaktionen einrichten werden, gründlich zu reinigen.
Bei dieser Reaktion wird eine Mischung aus drei Reverse-Primern verwendet, die spezifisch für den konstanten Bereich der Alpha- und Beta-Kette sind. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix vor, indem Sie die Reagenzien in einem Pipettierreservoir kombinieren. Um Pipettierfehler zu vermeiden, stellen Sie genügend Reaktionsmischung für zehn zusätzliche Vertiefungen her.
Verwenden Sie einen Mehrkanal, um sechs Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Well-PCR-Platte zu pipettieren. Decken Sie die Platte locker mit einem Siegel ab und halten Sie die Platte auf Eis. Bereiten Sie T-Zellen für die Einzelzellsortierung vor, indem Sie die Zellen mit Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker anfärben.
Sortieren Sie T-Zellen auf einmal Zelle pro Well, während Sie die zwölf Reihen leer lassen, die als Negativkontrolle dienen. Verschließe die Platte mit Klebefolie und schleudere sie bei 1000g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Führen Sie sofort die reverse Transkriptionsreaktion aus.
Wenn möglich, führen Sie die erste PCR-Reaktion noch am selben Tag durch. Um die Multiplex-Reaktion durchzuführen, mischen Sie die V-alpha- und V-beta-PCR-Mastermixe separat in Pipettierreservoirs. Bewahren Sie die Platte mit der cDNA auf Eis oder auf einem kalten Block auf.
Übertragen Sie 22,5 Mikroliter der TCR-Beta-Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte. Verwenden Sie dann einen Mehrkanal, um 2,5 Mikroliter cDNA in die PCR-Platte zu übertragen. Verwenden Sie einen Mehrkanal, um 22,5 Mikroliter der TCR-Alpha-Reaktion direkt in die Platte zu pipettieren, die den Rest der cDNA enthält.
Die Platten mit Klebstoff verschließen, vorsichtig vortexen und kurz herunterschleudern. Führen Sie die erste PCR-Reaktion durch. Die Platten können bei 20 Grad Celsius gelagert werden.
Bereiten Sie am nächsten Tag die zweiten verschachtelten PCR-Reaktionen vor. Pipettieren Sie die Mastermixe für die TCR-alpha- und TCR-beta-Reaktionen mit 22,5 Mikrolitern pro Vertiefung mit einem Mehrkanalverfahren in zwei neue 96-Well-PCR-Platten. Geben Sie die Multiplex-PCR-Reaktionsvorlage mit 2,5 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu.
Die Platten verschließen, vorsichtig vortexen und kurz nach unten schleudern. Die verbleibende erste PCR-Reaktion sollte versiegelt und bei 20 Grad Celsius gelagert werden, um als Backup-Vorlage zu dienen. Führen Sie die zweite PCR-Reaktion durch.
Nachdem die zweite verschachtelte PCR-Reaktion abgeschlossen ist, lassen Sie fünf Mikroliter der Reaktion auf einem 1%Agarose-Gel laufen. Beziehen Sie die positiven und negativen Kontrollvertiefungen ein. Das erwartete Band sollte eine Größe von etwa 500 Basenpaaren haben.
Reinigen Sie den Rest der zweiten Reaktion, zwanzig Mikroliter, mit einem PCR-Aufreinigungskit im 96-Well-Format und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch. Die erhaltenen TCR-Sequenzen können mit Hilfe einer online verfügbaren immungenetischen Software analysiert werden. Die Sequenzinformationen können verwendet werden, um das Repertoire und die Klonalität der T-Zell-Population zu beurteilen.
Gepaarte TCR-Alpha- und Beta-Sequenzen können in der weiteren Funktionsanalyse verwendet werden. Führen Sie aufeinanderfolgende Ligationen von TCR beta und TCR alpha in den Template-Vektor durch. Die Templates TCR beta und TCR alpha werden durch die PCR-amplifizierten Ketten ersetzt.
In der ersten Ligation wird die Matrize TCR beta durch die PCR-amplifizierte Beta-Kette ersetzt. Nachdem die erfolgreiche Insertion von TCR beta durch Test-Digest-Sequenzierung verifiziert wurde, ersetzen Sie das Template TCR alpha durch die PCR-amplifizierte Alpha-Kette. HEK293T Zellen werden verwendet, um die erfolgreiche Paarung der TCR-Kette und die Expression der Zelloberfläche zu testen.
HEK293T Zellen werden mit dem TCR-Vektor, der durch den Ametrin-Fluoreszenzreporter markiert ist, und einem Vektor, der für den CD3-Komplex kodiert, der durch GFP markiert ist, co-transfiziert. Die Oberflächenexpression des chimären TCR wird durch Durchflusszytometrie verifiziert, indem die Zellen mit Anti-Maus-CD3-Antikörpern gefärbt werden. Das Ausmaß der Oberflächen-CD3-Expression in Zellen, die mit dem chimären TCR-Konstrukt transfiziert wurden, sollte vergleichbar sein mit denen, die mit dem vollständig spiegelnden Kontroll-Template-Vektor transfiziert wurden.
Zusammenfassend haben wir ein effizientes PCR-basiertes Protokoll zur Identifizierung und Klonierung von gepaarten TCR-Ketten aus einzelnen Zellen beschrieben. Wir gehen davon aus, dass dies ein wertvolles Werkzeug sein wird, um die menschlichen T-Zell-Antworten bei der Autoimmunität, Tumorüberwachung und Eliminierung von Krankheitserregern zu untersuchen. Der Hauptvorteil des hier beschriebenen PCR-Protokolls ist seine Kompatibilität mit nachfolgenden in vitro und in vivo Studien.
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Überblick
Dieses Protokoll kombiniert die Sequenzierung gepaarter menschlicher TCR-Alpha- und Beta-Ketten einzelner Zellen mit der optimierten Erzeugung retroviraler Vektoren für die TCR-Expression. Es adressiert Schlüsselfragen in der Immunologie bezüglich des TCR-Repertoires und der Funktionalität.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis von TCR-Alpha- und Beta-Ketten ist entscheidend für die immunologische Forschung.
- Die Einzelzellsequenzierung ermöglicht eine detaillierte Analyse von TCR-Repertoires.
- Retrovirale Vektoren sind für TCR-Expressionsstudien unerlässlich.
- Diese Methode verbessert die Effizienz von PCR-Reaktionen.
Zweck der Studie
- Analyse des TCR-Repertoires spezifischer Antigenpopulationen.
- Beurteilung der in vivo Funktionalität menschlicher TCRs.
- Optimierung des Prozesses des TCR-Klons.
Verwendete Methoden
- Zweistufige PCR-Amplifikation von TCR-Alpha- und Beta-Ketten.
- Multiplex-Reaktion unter Verwendung von variablen Regions-spezifischen Primern.
- Nested PCR für erhöhte Spezifität und Effizienz.
- Einbau einzigartiger Restriktionsstellen für das Klonen.
Hauptergebnisse
- Hohe Effizienz bei der Amplifikation von TCR-Ketten aus Einzelzellen.
- Kompatibilität mit nachfolgenden TCR-Klonierungsprozessen.
- Fähigkeit, TCR-Repertoires ohne vorherige Sequenzkenntnisse zu analysieren.
- Erfolgreiche in vivo Expression menschlicher TCRs.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen robusten Ansatz für die Untersuchung von TCRs.
- Es erleichtert das Verständnis von Immunantworten.
- Das Protokoll ist für verschiedene immunologische Anwendungen anpassbar.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D to isolate paired human TCR sequences from single cells and rapidly generate functional retroviral vectors for in vitro and in vivo studies. It bridges the gap between TCR repertoire analysis and functional validation, supporting target de-risking in immunotherapy development. The streamlined workflow reduces timelines for TCR-based candidate evaluation, enhancing portfolio decision-making in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking TCR clonality to antigen-specific T-cell populations.
- Operational Value: Provides a reproducible method for paired TCR alpha/beta chain identification without prior sequence knowledge.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through direct assessment of TCR functionality in chimeric constructs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates TCR sequences compatible with sub-cloning into retroviral vectors for standardized expression systems.
- Operational Value: Produces PCR products with incorporated restriction sites, enabling streamlined cloning and reducing technical variability.
- Assay Readiness: Delivers validated TCR constructs suitable for flow cytometry-based surface expression screening in HEK293T cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces chimeric TCRs with mouse intracellular domains functional in mouse cells and in vivo models.
- Preclinical Modeling: Supports evaluation of TCR efficacy and safety in humanized mouse systems prior to IND-enabling studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on TCR signaling compatibility with CD3 complexes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from single-cell TCR identification to lead identification via functional TCR expression, supporting iterative cycles of target validation and preclinical testing.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by revealing TCR repertoires in antigen-specific populations without requiring prior sequence information.
- Screening: Enables assay development through generation of TCR-encoding retroviral vectors compatible with functional readouts in mirroring cell lines.
- Analytics: Provides quantitative TCR sequence data amenable to immunogenetic software analysis for clonality and repertoire assessment.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via chimeric TCR constructs that interact with murine CD3 signaling complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for TCR cloning applicable across autoimmune, oncology, and infectious disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enabling functional testing of human TCRs in relevant model systems.
- Operational Value: Standardizes TCR cloning through restriction site incorporation, reducing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the timeline from single-cell sorting to TCR expression to approximately two weeks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TCR candidates based on demonstrated in vitro and in vivo functionality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell sorting, multiplex nested PCR, and retroviral vector cloning.
- Necessitates contamination-controlled environments due to sensitivity to low-template levels and PCR contamination risks.
- Depends on access to 96-well PCR platforms, purification kits, and Sanger sequencing for TCR sequence validation.
- Requires adaptation of staining panels for T-cell subset isolation based on target disease indications.
- Practical limitation: Efficiency depends on RNA quality and starting cell numbers, necessitating optimization for rare T-cell populations.
