Name: Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Einzelzell-TCR-Isolierung und retrovirale Vektorgenerierung für In-vitro- und In-vivo-Expression menschlicher TCRs. Diese Methode ermöglicht effiziente PCR-Amplifikation und funktionelle Immunologie-Studien.

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Diese Studie wurde von JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30-DK079638-05-PILOT PJ, and The Robert und Janice McNair Foundation finanziert.
Wir danken Sandra Pena und Andrene McDonald für Rekrutierung von Patienten, Samuel Blum für technische Hilfe, Dr. George Makedonas für die Gabe von Antikörpern und Kontrolle DNA für die PCR Optimierung verwendet.

1. Identifizierung der T-Zell-Population von Interesse.
 Hinweis: Antigen spezifischen Verbreitung in Kombination mit Zellteilung Farbstoff (z. B. Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, CFSE-) verwendet werden, kann um T-Zellen zu isolieren basierend auf ihre Verbreitung in Reaktion auf Antigene Stimulation. Wenn von PBMCs beginnen, eine 7-Tage in Vitro Expansion sollte ausreichen, um ein Antigen spezifische CFSE-geringe Bevölkerungsdichte 12 identifizieren.
<ol><li>Mix PBMCs 1:1 mit MHC abgestimmt Feeder-Zellen und Aufkleber mit 5 µM CFSE-Zellteilung Farbstoff.</li>
	<li>Platte 2-2,5 x 10 5 Zellen pro Bohrloch in einer 96-Well Rundboden Kultur Platte in 200 µL 10 % FCS komplette RPMI Medien. 
	Hinweis: Enthält komplette RPMI, 2 mM l-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 µM MEM nichtessentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES, 5,5 × 10 &#8722; 5 Einheiten von 2-Mercaptoethanol, 100 mL U &#8722; 1 Penicillin und 100 µg mL &#8722; 1 Streptomycin.</li>
	<li>Stimulieren Zellen mit 25 µM-Peptid-Antigen.</li>
	<li>Am vierten Tag der Kultur sorgfältig entfernen und ersetzen Sie 100 µL Medien. 
	Hinweis: Ein optimaler Ansatz für Antigen-spezifische T-Zell-Erkennung ist die Verwendung von Peptid-HLA Tetramers 13. Tetramer Färbung ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der Antigen-Spezifität sowie HLA-Beschränkung.</li>
</ol> 2. Richten Sie die einzelne Zelle Art.
<ol><li>Perform kostenlos alle Verfahren in eine Kapuze oder einen bestimmten Bereich verstärkte Vorlage. Aliquoten Reagenzien zur Vermeidung von Kontaminationen, reinigen alle Arbeitsflächen und wenn möglich, Geräte mit 10 % Bleichmittel vor PCR Setup. Verwenden Sie Filter-Tips, RNAse und DNAse frei Reagenzien und Kunststoffe in der PCR und Vektor klonen Schritte. Wichtige Reagenzien finden Sie in der Tabelle der Materialien. 
	Hinweis: Die Multiplex-PCR-Reaktion ist sehr empfindlich, und geringe Mengen an Verunreinigungen verstärkten Produkt führen können.</li>
	<li>Generieren der reversen Transkription-master-Mix durch die Kombination 10 x Funktelegrafie-Reaktion-Puffer, 25 X DNTPs, 9 U RT Enzym, 0,01 % Triton-X, 0,7 U RNAse-Inhibitor und 383 nM jeden RT TCR Grundierung (siehe Tabelle 1) in einem sterilen Pipettieren Reservoir. Machen Sie für jede 96-Well-Platte genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), zum Ausgleich von Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren. Siehe Tabelle 2 für Reaktionskomponenten und Mengen pro Bohrloch.</li>
	<li>Vorbereitung einer 96-Well-PCR-Sammlung Platte für Zelle Sortierung nach 6 µL der reversen Transkription-master-Mix pro Bohrloch mit einer Mehrkanal-Pipette pipettieren. Halten Sie die Platte auf Eis oder in einem kalten Block.</li>
	<li>Zellen mit Antikörpern gegen Oberflächenmarker (wie CD3, und CD4 oder CD8 und CD3, jeweils 2 µg/mL, in Kombination mit Zellteilung Farbstoff oder Tetramer Färbung) Zelle beschriften.</li>
	<li>Art T-Zellen in einer Zelle pro Bohrloch, überspringen der zwölften Reihe, die als Negativkontrolle dienen wird. 
	Hinweis: Die Effizienz der Art präzise Erfassung Platte Ausrichtung innerhalb der Kennzeichenhalter, sowie die Aufrechterhaltung der Zellen und die Platten bei niedriger Temperatur vor der cDNA Reaktion abhängig. Sammlung Platten sollte auf dem Eis zu allen Zeiten, außer gehalten werden beim Sortieren, wenn sie innerhalb der Kühlplatte behoben werden. Nicht alle Sortiermaschinen verfügen über eine Temperatur geregelte Kennzeichenhalter; Allerdings ist die Verwendung eines dringend empfohlen. Da die Art in der Regel ca. 10-15 min pro Platte dauert, gibt es ein erhöhtes Potenzial für RNA-Abbau, wenn die Platte nicht bei einer niedrigen Temperatur beibehalten wird.</li>
	<li>Als Positivkontrolle, eine größere Anzahl von Zellen (100) manuell hinzufügen mit einer Pipette zu einem der Brunnen in diesem Stadium. Alternativ zuvor isolierten RNA aus gepoolten Zellen kann verwendet werden als Positivkontrolle bei 10 ng pro Bohrloch. 
	Hinweis: Pipette gereinigten Kontrolle RNA mit Präzision und Pflege zur Vermeidung von Kreuzkontamination anderer Brunnen und falsch-positive Ergebnisse.</li>
	<li>Dichtplatte mit Klebefolie und spin-down bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Sofort zu transkribieren RNA in cDNA durch Inkubation der Platte bei 25 ° C für 10 min, 37 ° C für 45 min und 85 ° C für 10 min. 
	Hinweis: Um effiziente PCR-Reaktion zu gewährleisten, wird empfohlen, dass die erste PCR-Reaktion am selben Tag durchgeführt werden. Alternativ können die transkribierten Platten im-80 ° C bis zu 2 Monate gehalten werden.</li>
</ol> 3. Multiplex-nested PCR durchführen Hinweis: bereiten Sie alle Meister Mixe in eine saubere Vorlage-freien Zone zur Vermeidung von Kontaminationen.
<ol><li>Stellen jede Variable Region Grundierung bis 100 µM mit DNAse und RNAse frei H 2 O. Als nächstes kombinieren Sie 20 µL jedes der 44 Primer, den V-Alpha-Grundierung-Pool zu generieren. Um die V-Beta zu generieren Grundierung Pool kombinieren 20 µL jeder der 40 V-Beta-Primer plus 80 µL DNAse und RNAse frei H 2 O. Primer Sequenzen in Tabelle 1 aufgeführt sind. Sobald gebündelt, die Konzentration des jedes Primers in der Mischung ist 2,3 µM.</li>
	<li>Rekonstruieren die konstante Region Primer zu 100 µM-Stammlösung mit DNAse und RNAse frei H 2 O. verdünnt die konstante Region Primer 10 µM Arbeitslösung und aliquoten einsetzbar.</li>
	<li>Zwei separate master Mischungen vorbereiten TCR-Alpha und TCR-Beta-Verstärkung. Die master-Mixes zu erzeugen, durch die Kombination von 5 X buffer, 80 µM dNTPs, 3 % DMSO, 2 µM Grundierung Pool (Endkonzentration von 46 nM für jede Grundierung), 200 nM TCR-konstante Region rückwärts-Primer, 1 U DNA-Polymerase und DNAse und RNAse frei H 2 O (Tabelle 2 < / starke >). Für jede 96-Well-Platte machen genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), Ausgleich für den Verlust von Flüssigkeit beim Pipettieren. 
	Hinweis: Die Berechnungen basieren auf der PCR Endvolumen von 25 µL pro Bohrloch, wo 22,5 µL master PCR-Mix mit 2,5 µL cDNA-Vorlage kombiniert wird.</li>
	<li>Halten die Platte mit cDNA auf Eis oder in einem kalten Block. Mithilfe einer Mehrkanal TCR-Beta-Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte 22,5 µL pipette. Verwenden Sie dann ein Multichannel 2,5 µL cDNA in die PCR-Platte übertragen.</li>
	<li>Verwenden, eine Mehrkanal um 22,5 µL der TCR-Alpha Reaktion direkt in die Platte mit dem Rest der cDNA pipette.</li>
	<li>Dichtung die Platten mit Klebstoff, sanft Wirbel und Spin nach unten bei 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Die Multiplex-PCR-Reaktion mit den folgenden Zyklen laufen: 5 min bei 95 ° C gefolgt von 34 Zyklen von 20 s bei 95 ° C, 30 s bei 54 ° C und 1 min bei 72 ° C, gefolgt von 7 min bei 72 ° c</li>
	<li>Tragen, die verschachtelten PCR-Reaktion in einem Endvolumen von 25 µL, 2,5 µL der Multiplex-PCR Mischung als Vorlage verwenden.
	<ol><li>Rekonstruieren die internen und Adapter Primer bis 100 µM mit DNAse und RNAse frei H 2 O. machen 10 µM Aliquote für den arbeitenden bestand.</li>
		<li>Zwei separate master Mischungen vorbereiten TCR-Alpha und TCR-Beta amplifizierung. Mix 5 X Puffer, 25 X DNTP, 3 % DMSO, 200 nM vorwärts Adapter Grundierung, 200 nM rückwärts verschachtelte-Primer, 1 U DNA-Polymerase und DNA-Polymerase und Nuklease-freie H 2 O für ein Endvolumen von 22,5 µL (Tabelle 2). Für jede 96-Well-Platte machen genügend master-Mix für 10 zusätzliche Reaktionen (insgesamt 106), zum Ausgleich von Flüssigkeitsverlust beim Pipettieren. 
		Hinweis: Bei der zweiten PCR Reaktion Verwendung der 5 X PCR Puffer mit Beladung Farbstoff Agarosegel beladen zu erleichtern.</li>
		<li>Mit einer Mehrkanal pipette die master Mischungen für die TCR-Alpha und TCR-Beta-Reaktionen auf 22,5 µL pro Bohrloch in zwei neue 96-Well-PCR-Platten.</li>
		<li>Fügen Sie die Multiplex-PCR-Reaktion-Vorlage am 2,5 µL pro Bohrloch. 
		Hinweis: Die verbleibenden erste PCR Reaktion sollten versiegelt und bei-20 ° C dienen als Quelle für zusätzliche Vorlage gespeichert, falls es nötig (siehe Schritt 4.3 Hinweis).</li>
		<li>Dichtung der Platten, sanft Wirbel und Spin down 1000 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
		<li>Die verschachtelte PCR-Reaktion mit den folgenden Zyklen laufen: 5 min bei 95 ° C gefolgt von 34 Zyklen von 20 s bei 95 ° C, 30 s bei 56 ° C und 1 min bei 72 ° C, gefolgt von 7 min bei 72 ° c</li>
		<li>Laufen 5 µL der letzten Reaktion, auf eine 1 % Agarose-gel mit Interkalation Bromid (einschließlich der negativen und positiven Kontroll-Vertiefungen). 
		Hinweis: Die erwartete Band sollte bei rund 500 bp Größe ausgeführt. Eine Beispiel-Reaktion ist in Abbildung 2 gezeigt.</li>
		<li>Reinigen den Rest der zweiten Reaktion (20 µL) mit einem 96-Well-Format PCR Reinigung Kit, Eluieren mit 15 µL von 70 ° C H 2 O pro Bohrloch, und führen Sie Sanger Sequenzierung. Verwenden Sie die entsprechende TCR-Alpha oder TCR-Beta-Adapter vorwärts Primer für die Sequenzierung (Tabelle 1). 
		Hinweis: Sequenzen mit online verfügbaren Immungenetik Software analysiert werden können.</li>
	</ol></li></ol> 4. Alpha- und Beta-PCR-Ketten vor-Klonen.
 Hinweis: der Pool die forward Primer verwendet in der ersten Reaktion und die reverse Primer in der zweiten PCR-Reaktion werden verwendet, um Restriktionsschnittstellen zu integrieren. Daher die erhaltenen Alpha- und Beta-Kette PCR-Produkte sind bereit, sequenziell Sub geklonten in der Vorlage retroviral Vektor ( Abbildung 1).
<ol><li>Digest der gereinigten PCR-Produkte aus der Beta verschachtelt Reaktion mit BstbI und MfeI (Tabelle 3). 
	Hinweis: Nicht mehr als 5 µg einfügen.</li>
	<li>Parallel zu verdauen die Vorlage Vektor mit BstbI und MfeI (Tabelle 3). Verwenden Sie 1-2 µg des Vektors Vorlage pro TCR. Führen des verdauten Vektors auf einem Agarosegel, und die größeren Band (~ 7500 bp) zu isolieren. Reinigen den Vektor mit einem DNA-Reinigung-Kit-Gel. 
	Hinweis: Während das Restriktionsenzym verdauen, die Vorlage murine TCR-Beta-Variable Region entfernt, ermöglicht die Zugabe der menschlichen TCR-Beta-Variable Region.</li>
	<li>Reinigen die verdaute PCR-Produkte mit einem PCR Reinigung Kit. 
	Hinweis: Vergewissern Sie sich die DNA Reinigungskapazität der im Kit enthaltenen Spalten; Verwenden Sie mehrere Spalten, wenn nötig. Der Mindestbetrag für einen gereinigten Einsatz notwendig für eine erfolgreiche Unterbindung Reaktion ist 50 ng auf eine minimale Konzentration von 10 ng/µL. Wenn die gereinigte Insert-Menge für eine erfolgreiche Verbindung nicht ausreicht, kann die zweite PCR Reaktion wiederholt werden.</li>
	<li>Behandlung den Vorlage Vektor mit 10 U CIP-Enzym für 1 h bei 37 ° C zu verhindern selbst Ligation, gefolgt von Hitzeinaktivierung für 10 min bei 75 ° c zu reinigen die DNA mit einem PCR-Reinigung-Kit (Tabelle 3).</li>
	<li>Ligate TCR-Beta einfügen und Vektor-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µL bei 6 Molaren Überschuss des Einsatzes für 30 min bei Raumtemperatur mit. 
	Hinweis: Insgesamt die Ligatur Reaktion sollte enthalten ca. 150 ng DNA (Tabelle 3).</li>
	<li>Für Transformationen, mix 8 µL der Ligatur Reaktion mit 80 µL chemisch kompetenten e. coli DH5α Zellen (Table of Materials) und inkubieren Sie für 30 min. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 S. hinzufügen 500 µL auf Eis Super Optimale Brühe mit Catabolite Unterdrückung (S.O.C.) Medium und schütteln für 1,5 h bei 37 ° c</li>
	<li>Platte, 250 µL Bakterienkultur auf einem Ampicillin, Lysogeny Brühe (LB) Nährbodenplatte enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag abholen Bakterienkolonien und wachsen sie in 3 mL LB-Medium mit Ampicillin über Nacht. Isolieren die Plasmid-DNA mit DNA Plasmid Reinigung Kit.</li>
	<li>Bestätigen die erfolgreiche Aufnahme der Beta-Kette durch einen kleinen Test-Digest mit Restriktionsenzymen BstbI und MfeI. Kombinieren Sie in einem 12 µL Gesamt Reaktionsvolumen 200-500 µg Plasmid DNA, 0,25 µL jedes Enzym und 10 X Enzym Puffer (Tabelle 3). Führen Sie die Reaktion heraus auf einem 1 % Agarosegel mit Interkalation Bromid um die Größe der Band einfügen zu bestätigen (~ 500 bp).</li>
	<li>Nach der Bestätigung der Anwesenheit des Einsatzes, Reihenfolge den TCR-Beta-Abschnitt des Vektors mit dem IRES-rückwärts-Primer (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach Reihenfolge Bestätigung des TCR-Beta-Einsatzes, ein ähnliches Verfahren zum Einfügen der alpha Variable Region durchführen. Die gereinigten PCR-Produkte von alpha verschachtelte Reaktion und die neu erzeugten TCR-Beta-Einlage mit Vektor, mit SnaBI und SacII verdauen. 
	Hinweis: Während das Restriktionsenzym verdauen, die Vorlage murine TCR-Alpha Variable Region entfernt, ermöglicht die Zugabe der menschlichen TCR-Alpha Variable Region.</li>
	<li>Ligate Alpha fügt in TCR Vektoren Codierung der entsprechenden Beta-Variable Region mit DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µL bei 6 Molaren Überschuss des Einsatzes für 30 min bei Raumtemperatur. 
	Hinweis: Insgesamt die Ligatur Reaktion sollte enthalten ca. 150 ng DNA (Tabelle 3).</li>
	<li>Für Transformationen, mix 8 µL der Ligatur Reaktion mit 80 µL chemisch kompetenten e. coli DH5α Zellen (Table of Materials) und inkubieren Sie für 30 min. Hitzeschock bei 42 ° C für 45 S. hinzufügen 500 µL S.O.C. auf Eis Medium und schütteln für 1,5 h bei 37 ° c</li>
	<li>Platte, 250 µL Bakterienkultur auf einem Ampicillin, Lysogeny Brühe (LB) Nährbodenplatte enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag abholen Bakterienkolonien und wachsen sie in 3 mL LB-Medium mit Ampicillin über Nacht. Isolieren die Plasmid-DNA mit DNA Plasmid Reinigung Kit.</li>
	<li>Bestätigen die erfolgreiche Aufnahme der alpha-Kette von einem kleinen Test-Digest mit Restriktionsenzymen SnaBI und SacII. Kombinieren Sie in einem 12 µL Gesamt Reaktionsvolumen 200-500 µg Plasmid DNA, 0,25 µL jedes Enzym und 10 X Enzym Puffer (Tabelle 3). Führen Sie die Reaktion heraus auf einem 1 % Agarosegel mit Interkalation Bromid um die Größe der Band einfügen zu bestätigen (~ 500 bp).</li>
	<li>Nach der Bestätigung der Anwesenheit des Einsatzes, Reihenfolge den TCR-Alpha-Abschnitt des Vektors mit der MSCV2-Forward Primer (Tabelle 1).</li>
	<li>Nach der Überprüfung der alpha-Kette Reihenfolge überprüfen die komplette TCR einfügen durch Sequenzierung mit TCR-Beta-Reverse und IRES-Reverse Primer (Tabelle 1).</li>
</ol> 5. TCR Zelle Oberflächenexpression und Spezifität zu überprüfen.
 Hinweis: HEK293T Zellen werden verwendet, um erfolgreiche TCR Kette Pari testenNG und Zelle Oberfläche Ausdruck ( Abbildung 3A) 8. Peptid-MHC Tetramer Färbung auf den transfizierten HEK293T Zellen zu testen, für die Aufbewahrung von Antigenen Spezifität Post TCR Genisolierung ( Abb. 3 b) durchgeführt werden.
<ol><li>Platte aus HEK293T Zellen in 12-Well-Zellkultur-Platten auf 1 x 10 5 Zellen pro Bohrloch in 1 mL komplette DMEM Medien enthält 5 % FCS und Kultur über Nacht bei 37 ° c Platte genügend Zellen zu separate Brunnen für jeden neuen TCR benannt haben , Kontrolle Vorlage TCR Vektor, Vektor, CD3 Kontrolle TCR Vektor nur, und ein nicht-transfizierten gut. 
	Hinweis: Transfektion mit einer voll Maus Vorlage TCR Vektor (mTCR-pMIA) in Kombination mit mCD3εγδζ-pMIG Vektor, mTCR-pMIA Vektor allein, und mCD3εγδζ-pMIG Vektor allein dienen als positive und negative Kontrollen. 
	Hinweis: Vollständige DMEM enthält 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 µM nicht-essentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES-Puffer, 5.5 x 10 -5 Einheiten von 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Am Folgetag transfizieren Zellen mit 1 µg Chimären h/mTCR-pMIA-Vektor, 1 µg Maus CD3εγδζ-pMSCVII-GLP (pMIG) Vektor und Liposomen-basiertes Transfection Reagens nach Herstellervorschriften.</li>
	<li>Für jeden TCR 6 µL Transfection Reagens zu 100 µL Raumtemperatur serumfreien DMEM hinzufügen. Kurz Wirbel und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>In separate 1,5 mL verbinden Rohre 1 µg der TCR-pMIA-Vektor mit 1 µg Maus CD3εγδζ-pMSCVII-GLP (pMIG) Vektor oder 1 µg jeden Vektor für Steuerelemente getrennt.</li>
	<li>Dropwise, die Transfection Reagens/DMEM Lösung hinzufügen das Röhrchen mit der Vektor-DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Dropwise, fügen Sie die Transfection Reagens/DMEM/DNA-Lösung zu den HEK293T Zellen. Klopfen Sie leicht die Platte zu mischen. Inkubation bei 37 ° C für 24 h</li>
	<li>Nach 24 h ersetzen Sie die Medien, und halten Sie Zellen in Kultur für weitere 24 h.</li>
	<li>Zellen durch kräftig Pipettieren von der Platte zu entfernen, und färben Sie die Zellen mit Anti-Maus-CD3-Antikörper (2,5 µg/mL), Oberflächenexpression von Chimären-TCR durch Durchflusszytometrie zu überzeugen.</li>
	<li>Um CD3 Ausdruck zwischen Zellen vergleichen, die auf einem ähnlichen Niveau transfiziert wurden Tor die Analyse auf Zellen, die ein ähnliches hohes Maß an fluoreszierenden Reporter Moleküle (GFP für CD3 komplex und Ametrin für TCR Expressionsvektor) zum Ausdruck zu bringen. Optimalerweise sollte die Analyse auf GFP + Ametrin + Zellen innerhalb von 10 gated werden 4 bis 10 5 Fluoreszenz Intensität ( Abb. 3A). 
	Hinweis: Die Höhe der CD3 Expression in Zellen mit Chimären Konstrukt transfiziert sollte die Kontrolle Maus (Originalvorlage) Vektor ( Abbildung 3A) vergleichbar sein. Die generierten TCR retroviralen Vektoren sind kompatibel mit in Vivo Expressionssysteme wie zuvor beschrieben 4.</li>
</ol>

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<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für einzelne Zelle TCR Verstärkung und nachfolgende vor-Klonen von gekoppelten TCR-Alpha und Beta-Ketten in eine Vorlage retrovirale Expressionsvektor. Obwohl mehrere einzelne Zelle PCR Protokolle entwickelt wurden, haben keine kompatibel mit sofortiger vor-Klonen in einem Ausdruck Vektor bisher. In den meisten Fällen wird eine Teilsequenz der hochvariablen CDR3 Regionen verstärkt, mit genügend Sequenz, die Variable Region zu extrapolieren. Dieser kleiner PCR-Prod...

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) schreibt T-Zell-Schicksal-Entscheidung während der Entwicklung, Steady-State/Homöostase und Antigenen Stimulation in der Peripherie1,2,3. Jüngste Erweiterung der Deep sequencing Technologien hat eine bisher unterschätzte TCR Vielfalt in Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten aufgedeckt. TCR Vielfalt schlägt ein Potenzial für funktional Breite T-Zell-Reaktionen. Um die Sequenzanalyse Repertoire TCR TCR funktionale Tests zu integrieren, sollten die Sequenzierung Ansätze entworfen werden, kompatibel mit experimentellen Systemen und in Vivo Modelle für nachfolgende Funktionsanalyse der SELECT-Anweisung verwendet werden TCR. Wir haben einen effizienten Ansatz für menschliche TCR Sequenz Isolation entwickelt und gestrafft, vor-Klonen in einen Chimären Mensch/Maus TCR Vorlage Vektor mit TCR Ausdruck in HLA-humanisierten Mäuse4kompatibel. Isolation der entsprechenden Alpha- und Beta-Ketten des heterodimerisierenden TCR verlangt PCR Verstärkung der beiden Ketten aus einer einzigen Zelle. Obwohl einige einzellige TCR Klonen Protokolle entwickelt und genutzt haben, wurden keiner bisher problemlos kompatibel mit Hochdurchsatz-optimierte direkte Klonen unbekannter Vα/Vβ TCRs in retrovirale Vektoren für erneuten Ausdruck in-vivo notwendig 4,5,6,7. Frühere Studien haben zwei Hauptansätze, entweder um einen begrenzten Teil des TCR ausreichend, um die Sequenz zu extrapolieren oder verstärken die gesamte TCR Sequenz4,5,6 selektiv zu verstärken genutzt. , 7. Downstream Funktionsanalyse des TCR Sequenzen erhalten über den ersten Ansatz erfordert kostspielige in Silico Montage und de Novo Bau TCR. Während der zweite Ansatz die komplette TCR-Sequenz bietet, ist die menschliche konstante Region nicht in Vivo Ausdruck der geklonten TCRs in Mausmodellen vereinbar. Unser Ansatz ist speziell mit in Vivo Funktionsanalyse des TCR in Maus-Modellen kompatibel. Wir entwickelten eine effiziente und schlanke einzelligen PCR-Protokoll, das für direkte vor-Klonen der PCR-Fragmente in der Vorlage Expressionsvektor ermöglicht.
Unser Ansatz nutzt eine hochsensible Multiplex verschachtelten PCR-Reaktion, die in zwei Schritten durchgeführt wird. In der ersten Multiplex-Reaktion Schritt einen Pool von 40 Primer speziell für die V-Beta-Ketten und einen Pool von 44 Primer speziell für alles, was die V-Alpha-Ketten verwendet werden, um die TCR-Alpha oder TCR-Beta ohne Vorkenntnisse der Sequenz (Tabelle 1) zu verstärken. Der forward Primer hat eine Adapter-Sequenz, die in der 5' des PCR Produktes aufgenommen wird. Die rückwärts-Primer basiert auf die konstante Region der TCR. Wir haben ermittelt, einzigartige Restriktionsschnittstellen, die aus menschlichen Variable oder Kreuzung TCR Regionen fehlen, und integriert diese in neu gestalteten TCRα und TCRβ Primern (Abbildung 1). In der zweiten verschachtelte Reaktion eine Grundierung, die spezifisch für die Adapter-Sequenz und einer verschachtelten rückwärts-Primer in der konstanten Region dienen weiter verstärken die TCR-Ketten mit erhöhte Spezifität (Tabelle 1, Abb. 1). Nach einzelnen Zelle isoliert, zwei Runden der PCR (erste Reaktion mit einem Pool von Vα und Vβ Primern, und zweitens mit Adapter Primern) führen ein PCR-Produkt, das direkt in die Vorlage retroviral Vektor Sub geklont werden kann. Das endgültige TCR-Konstrukt wird in eine einzelne offene Leserahmen (ORF), menschlichen Variablen Regionen kombiniert mit Maus konstante Regionen durch die "Self anhaftenden" Proteinsequenz verbunden kodieren P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. Der P2A-Sequenz wurde in mehreren Systemen eingesetzt und wurde speziell für den Ausdruck von TCR8,9,10,11ausgiebig getestet. Obwohl, nach Übersetzung P2A Sequenz bleibt der Großteil an dem C-Terminus der alpha-Kette durch eine flexible Linker verbunden, während der Beta-Kette Signalsequenz eine zusätzliche Prolin, diese Änderung hat hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die TCR-Funktion. Die konstante Region der Maus wird in das Konstrukt statt Menschen verwendet, um mögliche veränderte Interaktionen mit nachgeschalteten Signalisierung Komponenten zu vermeiden wenn wieder in Mauszellen exprimiert. Die einzige ORF führen stöchiometrische separater Ausdruck von Alpha- und Beta-Ketten9,11. Das aktuelle Protokoll basiert auf Reagenzien und Ansätze, die überall erhältlich sind, und soll in einer schlanken und effizienten Art und Weise durchgeführt werden. Obwohl wir diese Technik speziell zur TCR von selbstzersetzliche T-Zellen in autoimmune Diabetes verwickelt assay verwendet haben, erwarten wir, dass dieses Protokoll allgemein anwendbar zur Identifizierung und funktionelle Beurteilung menschlichen TCRs spezifisch für sind autoimmune Epitope, Krebs Epitope oder Reaktionen auf Krankheitserreger und Impfstoffe.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>eBiowissenschaften&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Rekombinanter RNAse Inhibitor biotech grd 2,5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0,7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems cDNA RT-Kit mit hoher Kapazität</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT-Enzym)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nukleasefreies Wasser 1000 ml</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA-Polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR-Platte</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Klarer Klebefilm&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (Einsatz) 30 U (Vektor)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (Einsatz) 80 U (Vektor)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (Einsatz) 80 U (Vektor)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (Einsatz) 80 U (Vektor</td></tr><tr><td>)Kälberdarmphosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Schnellgase&nbsp;</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Minipreps DNA-Aufreinigungssysteme&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Midipreps DNA-Aufreinigungssysteme&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Reinigungs- und Konzentrator-25-Kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA-Reinigungs- und Konzentrator-5-Kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subklonierungseffizienz DH5a Kompetente Zellen&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Reagenz 1 ml (Transfektionsreagenz)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (Sortierer)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (Durchflusszytometer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimierte einzelzelle tcr isolation und generierung von retroviralen vektoren für in-vitro und in vivo ausdruck menschlichen tcrs

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Obwohl mehrere Methoden für die Sequenzierung von gepaarten T-Zell-Rezeptor (TCR) Alpha- und Beta-Ketten aus einzelnen T-Zellen entwickelt wurden, wurden keine bisher förderlich für nachgeschaltete in Vivo Funktionsanalyse des TCR Heterodimere. Wir haben eine verbesserte Protokoll basiert auf einem zweistufigen Multiplex nested PCR, resultiert in einer PCR-Produkt, das gesamte Variable Regionen eine menschliche TCR-Alpha und Beta-Ketten umfasst entwickelt. Durch die einzigartige Restriktionsschnittstellen Identifizierung und Einbindung in die PCR-Primer, haben wir das PCR-Produkt mit direkten vor-Klonen in der Vorlage retroviral Vektor kompatibel gemacht. Das daraus resultierende retrovirale Konstrukt kodiert eine Chimäre Mensch/Maus TCR mit einer Maus intrazelluläre Domäne in Mauszellen oder in Vivo Maus-Modellen funktioniert. Insgesamt verbindet das Protokoll hier beschriebenen menschlichen Einzelzelle gepaart TCR Alpha- und Beta-Kette Identifikation mit optimierten Generation von retroviralen Vektoren leicht anpassbar für in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck. Das Video und das Begleitmaterial sollen eine sehr detaillierte Beschreibung der einzelnen Zelle PCR, vermitteln, dass die entscheidenden Schritte gefolgt und mögliche Fallstricke vermieden werden können. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Klonen Schritte notwendig, um dem Expressionsvektor erzeugen. Sobald Sie beherrscht, konnte die ganze Prozedur von Einzelzelle Sortierung TCR Ausdruck in einem kurzen Zeitraum von zwei Wochen durchgeführt werden.

Die Effizienz der Multiplex-nested PCR Reaktion in Schritt 3.2.7 (Abbildung 2) Prüfung: 5µL die zweite Reaktion auf einem Agarosegel zur Neige. Im Durchschnitt ist die Effizienz der TCR-Beta-Verstärkung bei etwa 80 %, während die Effizienz der TCR-Alpha Reaktion in der Regel niedriger, bei etwa 50 ist % rechnen4. Nur paarweise TCR-Alpha und TCR-Beta-Ketten können für TCR Ausdruck verwendet werden; jedoch konnten alle PCR Produkte seque...

Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. das TCR-Alpha- und Beta-Repertoire der spezifischen Population eines Antigens sowie die In-vivo-Funktionalität menschlicher TCRs. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die relativ hohe Effizienz der PCR-Reaktion sowie ihre Kompatibilität mit der anschließenden TCR-Klonierung. Dieses Protokoll verwendet eine zweistufige PCR, um die TCR-Alpha- und -Beta-Ketten aus einer einzelnen Zelle ohne vorherige Kenntnis der TCR-Sequenz zu amplifizieren.Die erste PCR ist eine Multiplex-Reaktion unter Verwendung eines Pools von Alpha- oder Beta-Primern mit variabler Region in Verbindung mit einem Primer, der für die konstante Region spezifisch ist. Die zweite PCR ist eine verschachtelte Reaktion, die von der Adaptersequenz ausgeht, die am fünf Primzahlen des PCR-Produkts eingebaut ist, sowie von einer internen Sequenz im konstanten Bereich. Diese Primer enthalten auch einzigartige Restriktionsstellen in die fünf Prime- und drei Prime-Enden des PCR-Produkts, um die anschließende Klonierung zu erleichtern.Nach dem Klonen in den Template-Vektor ist die kodierte TCR-Sequenz chimerisch und besteht aus menschlichen variablen Regionen mit spiegelnden konstanten Regionen. Das chimäre TCR-Konstrukt ermöglicht die Interaktion zwischen dem TCR und dem spiegelnden CD3-Signalkomplex, wodurch dieses TCR-Klonierungsprotokoll mit nachfolgenden funktionellen Studien in spiegelnden Zelllinien und in humanisierten Mausmodellen kompatibel ist. Richten Sie sich für die Einzelzellsortierung ein, indem Sie die Reagenzien für die reverse Transkription in einem sauberen, vorlagenfreien Bereich vorbereiten.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Einzelzell-PCR-Methode sind, aufgrund der geringen Matrizenmengen Schwierigkeiten haben. Auf der anderen Seite ist die Sensitivität der Multiplex-Nested-PCR empfindlich gegenüber einem geringen Grad an Template-Kontamination. Daher ist es notwendig, die Bereiche, in denen Sie die PCR-Reaktionen einrichten werden, gründlich zu reinigen.Bei dieser Reaktion wird eine Mischung aus drei Reverse-Primern verwendet, die spezifisch für den konstanten Bereich der Alpha- und Beta-Kette sind. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix vor, indem Sie die Reagenzien in einem Pipettierreservoir kombinieren. Um Pipettierfehler zu vermeiden, stellen Sie genügend Reaktionsmischung für zehn zusätzliche Vertiefungen her.Verwenden Sie einen Mehrkanal, um sechs Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Well-PCR-Platte zu pipettieren. Decken Sie die Platte locker mit einem Siegel ab und halten Sie die Platte auf Eis. Bereiten Sie T-Zellen für die Einzelzellsortierung vor, indem Sie die Zellen mit Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker anfärben.Sortieren Sie T-Zellen auf einmal Zelle pro Well, während Sie die zwölf Reihen leer lassen, die als Negativkontrolle dienen. Verschließe die Platte mit Klebefolie und schleudere sie bei 1000g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Führen Sie sofort die reverse Transkriptionsreaktion aus.Wenn möglich, führen Sie die erste PCR-Reaktion noch am selben Tag durch. Um die Multiplex-Reaktion durchzuführen, mischen Sie die V-alpha- und V-beta-PCR-Mastermixe separat in Pipettierreservoirs. Bewahren Sie die Platte mit der cDNA auf Eis oder auf einem kalten Block auf.Übertragen Sie 22,5 Mikroliter der TCR-Beta-Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte. Verwenden Sie dann einen Mehrkanal, um 2,5 Mikroliter cDNA in die PCR-Platte zu übertragen. Verwenden Sie einen Mehrkanal, um 22,5 Mikroliter der TCR-Alpha-Reaktion direkt in die Platte zu pipettieren, die den Rest der cDNA enthält.Die Platten mit Klebstoff verschließen, vorsichtig vortexen und kurz herunterschleudern. Führen Sie die erste PCR-Reaktion durch. Die Platten können bei 20 Grad Celsius gelagert werden.Bereiten Sie am nächsten Tag die zweiten verschachtelten PCR-Reaktionen vor. Pipettieren Sie die Mastermixe für die TCR-alpha- und TCR-beta-Reaktionen mit 22,5 Mikrolitern pro Vertiefung mit einem Mehrkanalverfahren in zwei neue 96-Well-PCR-Platten. Geben Sie die Multiplex-PCR-Reaktionsvorlage mit 2,5 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu.Die Platten verschließen, vorsichtig vortexen und kurz nach unten schleudern. Die verbleibende erste PCR-Reaktion sollte versiegelt und bei 20 Grad Celsius gelagert werden, um als Backup-Vorlage zu dienen. Führen Sie die zweite PCR-Reaktion durch.Nachdem die zweite verschachtelte PCR-Reaktion abgeschlossen ist, lassen Sie fünf Mikroliter der Reaktion auf einem 1%Agarose-Gel laufen. Beziehen Sie die positiven und negativen Kontrollvertiefungen ein. Das erwartete Band sollte eine Größe von etwa 500 Basenpaaren haben.Reinigen Sie den Rest der zweiten Reaktion, zwanzig Mikroliter, mit einem PCR-Aufreinigungskit im 96-Well-Format und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch. Die erhaltenen TCR-Sequenzen können mit Hilfe einer online verfügbaren immungenetischen Software analysiert werden. Die Sequenzinformationen können verwendet werden, um das Repertoire und die Klonalität der T-Zell-Population zu beurteilen.Gepaarte TCR-Alpha- und Beta-Sequenzen können in der weiteren Funktionsanalyse verwendet werden. Führen Sie aufeinanderfolgende Ligationen von TCR beta und TCR alpha in den Template-Vektor durch. Die Templates TCR beta und TCR alpha werden durch die PCR-amplifizierten Ketten ersetzt.In der ersten Ligation wird die Matrize TCR beta durch die PCR-amplifizierte Beta-Kette ersetzt. Nachdem die erfolgreiche Insertion von TCR beta durch Test-Digest-Sequenzierung verifiziert wurde, ersetzen Sie das Template TCR alpha durch die PCR-amplifizierte Alpha-Kette. HEK293T Zellen werden verwendet, um die erfolgreiche Paarung der TCR-Kette und die Expression der Zelloberfläche zu testen.HEK293T Zellen werden mit dem TCR-Vektor, der durch den Ametrin-Fluoreszenzreporter markiert ist, und einem Vektor, der für den CD3-Komplex kodiert, der durch GFP markiert ist, co-transfiziert. Die Oberflächenexpression des chimären TCR wird durch Durchflusszytometrie verifiziert, indem die Zellen mit Anti-Maus-CD3-Antikörpern gefärbt werden. Das Ausmaß der Oberflächen-CD3-Expression in Zellen, die mit dem chimären TCR-Konstrukt transfiziert wurden, sollte vergleichbar sein mit denen, die mit dem vollständig spiegelnden Kontroll-Template-Vektor transfiziert wurden.Zusammenfassend haben wir ein effizientes PCR-basiertes Protokoll zur Identifizierung und Klonierung von gepaarten TCR-Ketten aus einzelnen Zellen beschrieben. Wir gehen davon aus, dass dies ein wertvolles Werkzeug sein wird, um die menschlichen T-Zell-Antworten bei der Autoimmunität, Tumorüberwachung und Eliminierung von Krankheitserregern zu untersuchen. Der Hauptvorteil des hier beschriebenen PCR-Protokolls ist seine Kompatibilität mit nachfolgenden in vitro und in vivo Studien.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR).  Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Erfahren Sie die optimierte Einzelzell-TCR-Isolierung und retrovirale Vektorgenerierung für In-vitro- und In-vivo-Expression menschlicher TCRs. Diese Methode ermöglicht effiziente PCR-Amplifikation und funktionelle Immunologie-Studien.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs (Video) | JoVE Journal

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

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