Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs
10. September 2017
Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.
Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. das TCR-Alpha- und Beta-Repertoire der spezifischen Population eines Antigens sowie die In-vivo-Funktionalität menschlicher TCRs. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die relativ hohe Effizienz der PCR-Reaktion sowie ihre Kompatibilität mit der anschließenden TCR-Klonierung. Dieses Protokoll verwendet eine zweistufige PCR, um die TCR-Alpha- und -Beta-Ketten aus einer einzelnen Zelle ohne vorherige Kenntnis der TCR-Sequenz zu amplifizieren.
Die erste PCR ist eine Multiplex-Reaktion unter Verwendung eines Pools von Alpha- oder Beta-Primern mit variabler Region in Verbindung mit einem Primer, der für die konstante Region spezifisch ist. Die zweite PCR ist eine verschachtelte Reaktion, die von der Adaptersequenz ausgeht, die am fünf Primzahlen des PCR-Produkts eingebaut ist, sowie von einer internen Sequenz im konstanten Bereich. Diese Primer enthalten auch einzigartige Restriktionsstellen in die fünf Prime- und drei Prime-Enden des PCR-Produkts, um die anschließende Klonierung zu erleichtern.
Nach dem Klonen in den Template-Vektor ist die kodierte TCR-Sequenz chimerisch und besteht aus menschlichen variablen Regionen mit spiegelnden konstanten Regionen. Das chimäre TCR-Konstrukt ermöglicht die Interaktion zwischen dem TCR und dem spiegelnden CD3-Signalkomplex, wodurch dieses TCR-Klonierungsprotokoll mit nachfolgenden funktionellen Studien in spiegelnden Zelllinien und in humanisierten Mausmodellen kompatibel ist. Richten Sie sich für die Einzelzellsortierung ein, indem Sie die Reagenzien für die reverse Transkription in einem sauberen, vorlagenfreien Bereich vorbereiten.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Einzelzell-PCR-Methode sind, aufgrund der geringen Matrizenmengen Schwierigkeiten haben. Auf der anderen Seite ist die Sensitivität der Multiplex-Nested-PCR empfindlich gegenüber einem geringen Grad an Template-Kontamination. Daher ist es notwendig, die Bereiche, in denen Sie die PCR-Reaktionen einrichten werden, gründlich zu reinigen.
Bei dieser Reaktion wird eine Mischung aus drei Reverse-Primern verwendet, die spezifisch für den konstanten Bereich der Alpha- und Beta-Kette sind. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix vor, indem Sie die Reagenzien in einem Pipettierreservoir kombinieren. Um Pipettierfehler zu vermeiden, stellen Sie genügend Reaktionsmischung für zehn zusätzliche Vertiefungen her.
Verwenden Sie einen Mehrkanal, um sechs Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Well-PCR-Platte zu pipettieren. Decken Sie die Platte locker mit einem Siegel ab und halten Sie die Platte auf Eis. Bereiten Sie T-Zellen für die Einzelzellsortierung vor, indem Sie die Zellen mit Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker anfärben.
Sortieren Sie T-Zellen auf einmal Zelle pro Well, während Sie die zwölf Reihen leer lassen, die als Negativkontrolle dienen. Verschließe die Platte mit Klebefolie und schleudere sie bei 1000g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Führen Sie sofort die reverse Transkriptionsreaktion aus.
Wenn möglich, führen Sie die erste PCR-Reaktion noch am selben Tag durch. Um die Multiplex-Reaktion durchzuführen, mischen Sie die V-alpha- und V-beta-PCR-Mastermixe separat in Pipettierreservoirs. Bewahren Sie die Platte mit der cDNA auf Eis oder auf einem kalten Block auf.
Übertragen Sie 22,5 Mikroliter der TCR-Beta-Reaktion in eine neue 96-Well-PCR-Platte. Verwenden Sie dann einen Mehrkanal, um 2,5 Mikroliter cDNA in die PCR-Platte zu übertragen. Verwenden Sie einen Mehrkanal, um 22,5 Mikroliter der TCR-Alpha-Reaktion direkt in die Platte zu pipettieren, die den Rest der cDNA enthält.
Die Platten mit Klebstoff verschließen, vorsichtig vortexen und kurz herunterschleudern. Führen Sie die erste PCR-Reaktion durch. Die Platten können bei 20 Grad Celsius gelagert werden.
Bereiten Sie am nächsten Tag die zweiten verschachtelten PCR-Reaktionen vor. Pipettieren Sie die Mastermixe für die TCR-alpha- und TCR-beta-Reaktionen mit 22,5 Mikrolitern pro Vertiefung mit einem Mehrkanalverfahren in zwei neue 96-Well-PCR-Platten. Geben Sie die Multiplex-PCR-Reaktionsvorlage mit 2,5 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu.
Die Platten verschließen, vorsichtig vortexen und kurz nach unten schleudern. Die verbleibende erste PCR-Reaktion sollte versiegelt und bei 20 Grad Celsius gelagert werden, um als Backup-Vorlage zu dienen. Führen Sie die zweite PCR-Reaktion durch.
Nachdem die zweite verschachtelte PCR-Reaktion abgeschlossen ist, lassen Sie fünf Mikroliter der Reaktion auf einem 1%Agarose-Gel laufen. Beziehen Sie die positiven und negativen Kontrollvertiefungen ein. Das erwartete Band sollte eine Größe von etwa 500 Basenpaaren haben.
Reinigen Sie den Rest der zweiten Reaktion, zwanzig Mikroliter, mit einem PCR-Aufreinigungskit im 96-Well-Format und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch. Die erhaltenen TCR-Sequenzen können mit Hilfe einer online verfügbaren immungenetischen Software analysiert werden. Die Sequenzinformationen können verwendet werden, um das Repertoire und die Klonalität der T-Zell-Population zu beurteilen.
Gepaarte TCR-Alpha- und Beta-Sequenzen können in der weiteren Funktionsanalyse verwendet werden. Führen Sie aufeinanderfolgende Ligationen von TCR beta und TCR alpha in den Template-Vektor durch. Die Templates TCR beta und TCR alpha werden durch die PCR-amplifizierten Ketten ersetzt.
In der ersten Ligation wird die Matrize TCR beta durch die PCR-amplifizierte Beta-Kette ersetzt. Nachdem die erfolgreiche Insertion von TCR beta durch Test-Digest-Sequenzierung verifiziert wurde, ersetzen Sie das Template TCR alpha durch die PCR-amplifizierte Alpha-Kette. HEK293T Zellen werden verwendet, um die erfolgreiche Paarung der TCR-Kette und die Expression der Zelloberfläche zu testen.
HEK293T Zellen werden mit dem TCR-Vektor, der durch den Ametrin-Fluoreszenzreporter markiert ist, und einem Vektor, der für den CD3-Komplex kodiert, der durch GFP markiert ist, co-transfiziert. Die Oberflächenexpression des chimären TCR wird durch Durchflusszytometrie verifiziert, indem die Zellen mit Anti-Maus-CD3-Antikörpern gefärbt werden. Das Ausmaß der Oberflächen-CD3-Expression in Zellen, die mit dem chimären TCR-Konstrukt transfiziert wurden, sollte vergleichbar sein mit denen, die mit dem vollständig spiegelnden Kontroll-Template-Vektor transfiziert wurden.
Zusammenfassend haben wir ein effizientes PCR-basiertes Protokoll zur Identifizierung und Klonierung von gepaarten TCR-Ketten aus einzelnen Zellen beschrieben. Wir gehen davon aus, dass dies ein wertvolles Werkzeug sein wird, um die menschlichen T-Zell-Antworten bei der Autoimmunität, Tumorüberwachung und Eliminierung von Krankheitserregern zu untersuchen. Der Hauptvorteil des hier beschriebenen PCR-Protokolls ist seine Kompatibilität mit nachfolgenden in vitro und in vivo Studien.
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Übersicht
Dieses Protokoll kombiniert die Sequenzierung einzelner menschlicher T-Zell-Rezeptor-alpha- und -beta-Ketten aus einzelnen Zellen mit einer optimierten Herstellung retroviraler Vektoren für die TCR-Expression. Es befasst sich mit zentralen Fragen der Immunologie bezüglich des TCR-Repertoires und der Funktionalität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis der TCR-alpha- und -beta-Ketten ist entscheidend für die immunologische Forschung.
- Die Einzelzellsequenzierung ermöglicht eine detaillierte Analyse der TCR-Repertoires.
- Retrovirale Vektoren sind unerlässlich für Studien zur TCR-Expression.
- Diese Methode verbessert die Effizienz von PCR-Reaktionen.
Zweck der Studie
- Analyse des TCR-Repertoires spezifischer Antigenpopulationen.
- Beurteilung der In-vivo-Funktionalität menschlicher TCRs.
- Vereinfachung des Klonierungsprozesses von TCRs.
Verwendete Methoden
- Zwei-stufige PCR-Amplifikation der TCR-alpha- und beta-Ketten.
- Multiplex-Reaktion unter Verwendung von primerspezifischen variablen Regionen.
- Nested-PCR zur Verbesserung der Spezifität und Effizienz.
- Einbau eindeutiger Restriktionsstellen für das Klonieren.
Hauptergebnisse
- Hohe Effizienz bei der Amplifikation von TCR-Ketten aus Einzelzellen.
- Kompatibilität mit nachfolgenden TCR-Klonierungsverfahren.
- Möglichkeit, TCR-Repertoires ohne vorherige Sequenzkenntnis zu analysieren.
- Erfolgreiche in-vivo-Expression menschlicher TCRs.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung von T-Zell-Rezeptoren (TCRs).
- Sie erleichtert das Verständnis immunologischer Reaktionen.
- Das Protokoll ist für verschiedene immunologische Anwendungen anpassbar.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung, gepaarte humane TCR-Sequenzen aus Einzelzellen zu isolieren und schnell funktionale retrovirale Vektoren für in-vitro- und in-vivo-Studien herzustellen. Es schließt die Lücke zwischen der Analyse des TCR-Repertoires und der funktionellen Validierung und unterstützt die Entschärfung von Zielrisiken bei der Entwicklung von Immuntherapien. Der optimierte Arbeitsablauf verkürzt die Zeitspannen für die Bewertung TCR-basierter Kandidaten und verbessert die Portfolio-Entscheidungen im frühen Entdeckungsstadium.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verknüpfung der TCR-Klonalität mit antigenspezifischen T-Zellpopulationen.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares Verfahren zur identifizierung gepaarter TCR-Alpha/Beta-Ketten ohne vorheriges Sequenzwissen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch direkte Bewertung der TCR-Funktionalität in chimären Konstrukten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt TCR-Sequenzen, die für die Subklonierung in retrovirale Vektoren zur standardisierten Expression geeignet sind.
- Operativer Wert: Erzeugt PCR-Produkte mit eingefügten Restriktionsstellen, was eine vereinfachte Klonierung ermöglicht und die technische Variabilität verringert.
- Bereitschaft für die Analyse: Liefert validierte TCR-Konstrukte, die für die Oberflächenexpression mittels Durchflusszytometrie in HEK293T-Zellen geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erzeugt chimäre T-Zell-Rezeptoren mit maus-spezifischen intrazellulären Domänen, die in Mauszellen und in vivo-Modellen funktional sind.
- Präklinische Modellierung: Ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von T-Zell-Rezeptoren in humanisierten Mausmodellen vor Studien, die für die Zulassung als investigatives Arzneimittel (IND) erforderlich sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch basierend auf der Verträglichkeit der T-Zell-Rezeptor-Signalgebung mit CD3-Komplexen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Einzelzell-TCR-Identifizierung bis hin zur Lead-Identifizierung über funktionelle TCR-Expression und unterstützt iterative Zyklen der Target-Validierung und präklinischen Testung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung, indem TCR-Repertoires in antigenspezifischen Populationen aufgedeckt werden, ohne dass vorherige Sequenzinformationen erforderlich sind.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays durch die Generierung von TCR-kodierenden Retrovirusvektoren, die mit funktionalen Nachweismethoden in Spiegelzelllinien kompatibel sind.
- Analytik: Liefert quantitative TCR-Sequenzdaten, die für immunogenetische Softwareanalysen zur Beurteilung von Klonalität und Repertoire geeignet sind.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung mittels chimärer TCR-Konstrukte, die mit murinen CD3-Signalisierungskomplexen interagieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für das Klonen von TCRs, die in Programmen zu Autoimmunerkrankungen, Onkologie und Infektionskrankheiten anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die funktionelle Testung menschlicher TCRs in relevanten Modellsystemen ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert das Klonen von TCRs durch Einbindung von Restriktionsstelle, wodurch die Variabilität von Charge zu Charge verringert wird.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die Zeitspanne von der Einzelzell-Sortierung bis zur TCR-Expression auf etwa zwei Wochen verkürzt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von TCR-Kandidaten basierend auf nachgewiesener in-vitro- und in-vivo-Funktionalität.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Einzelzell-Sortierung, der multiplex-nestierten PCR und dem Klonen retroviraler Vektoren.
- Benötigt kontaminationskontrollierte Umgebungen aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber geringen Matrizenmengen und der Risiken von PCR-Kontaminationen.
- Hängt von dem Zugang zu PCR-Plattformen mit 96-Loch-Platten, Reinigungskits und Sanger-Sequenzierung zur Validierung der TCR-Sequenzen ab.
- Erfordert die Anpassung von Färbepanels zur Isolierung von T-Zell-Subpopulationen entsprechend den Zielkrankheitsindikationen.
- Praktische Einschränkung: Die Effizienz hängt von der RNA-Qualität und der Anfangszellzahl ab und erfordert eine Optimierung für seltene T-Zell-Populationen.
