Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Das übergeordnete Ziel dieses einfachen, aber effektiven Verfahrens ist die Isolierung und Anreicherung von seltenen antigenbindenden B-Zellen aus dem menschlichen peripheren Blut unter Verwendung magnetischer Nanopartikel für ihre phänotypische und funktionelle Analyse. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie bezüglich des Phänotyps und der Biologie seltener antigenbindender B-Zellen sowohl vor als auch nach der in-vivo-Antigenbegegnung zu beantworten. Der große Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Probleme im Zusammenhang mit der Geometrie vermeidet, insbesondere wenn eine Styrolplatte oder eine große Raupe verwendet wird.

Und es vermeidet Probleme, die mit der Flussrate verbunden sind, wenn man Zellen durch Durchflusszytometrie isoliert, um seltene Zellen in ziemlich großen Ausgangszellpopulationen zu isolieren. Unmittelbar nach der Entnahme von 30 bis 50 Millilitern Vollblut in heparinisierte Blutentnahmeröhrchen mischen Sie das Blut im Verhältnis 1:1 mit sterilem Magnesium bei Raumtemperatur und kalziumfreiem PBS. Als nächstes schichten Sie das Blutgemisch auf 10 Milliliter Raumtemperatur-Dichtegradientenlösung in einem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen unter Verwendung eines langsamen, gleichmäßigen Pipettenauslösedrucks.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die plasma- und plättchenhaltige obere Schicht und überführen Sie den mononukleären Zellbehälter Buffy Coat mit einer sterilen Pipette in ein neues steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit bis zu 50 Millilitern PBS zum Waschen der mononukleären Zellen durch Zentrifugation.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem PBS zum Zählen und resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1x10^7 Zellen pro Milliliter in frischem PBS auf Eis. Um die Zellen für die magnetische Bead-Bindung zu färben, übertragen Sie zunächst 1-2x10^6 Zellaliquoten in fünf Milliliter Polystyrolröhrchen für jede Fluoreszenzkompensation und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle, je nach Bedarf. Als nächstes entnehmen Sie den Rest der Zellprobe durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet auf eine Konzentration von 3-6x10^7 Zellen pro Milliliter in steril filtriertem kaltem FACS-Puffer.

Die Zelllösung wird zu gleichen Teilen in vier FACS-Röhrchen auf Eis aufgeteilt und diesen vier experimentellen Probenfraktionen humanes Fcgamma-Rezeptor-Blockierungsmittel zugesetzt. Am Ende der unspezifisch bindenden Blockierungsinkubation geben Sie die entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Antikörper zur Zelloberflächenfärbung zu den Zellen in allen vier Probenfraktionen. Dann wird das entsprechende biotinylierte Antigen zu den Fraktionen A und D hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe eines ausreichenden Volumens an unmarkiertem Antigen zu der Fraktion B, so dass die Mehrzahl der Rezeptoren mit einer Affinität von mindestens 1x10^6 molaren blockiert wird.

Alle Proben werden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation der Fraktion B mit dem entsprechenden biotinylierten Antigen. Am Ende der Inkubationen waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter eiskaltem FACS-Puffer pro 5x10^7 Zellen. Und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter 2%Formaldehyd pro 5x10^7 Zellen für fünf Minuten im Dunkeln auf Eis.

Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung noch zwei weitere Male, wie gerade gezeigt. Und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter frischem eiskaltem FACS-Puffer pro 5x10^7 Zellen. Anschließend markieren Sie die Zellen mit ein bis zwei Mikrogramm des entsprechenden sekundären Streptavidin-Konjugierten Antikörpers für 20 Minuten im Dunkeln auf Eis und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male.

Für die magnetische Anreicherung auf Basis von Nanopartikeln resuspendieren Sie die A-, B- und C-Zellfraktionen in einem Milliliter kaltem Trennpuffer pro 5x10^7 Zellen und filtrieren Sie die Zellen durch einzelne 40-Mikroliter-Siebe, um Klumpen zu entfernen. Als nächstes geben Sie die Fluoreszenzfarbstoff-Nanopartikel in der entsprechenden Konzentration für 10 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius mit Rotation und waschen Sie die Proben zweimal in einem Milliliter kaltem Trennpuffer. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter kaltem Trennpuffer pro 5x10^7 Zellen.

Äquilibrieren Sie dann drei magnetische Säulen auf ihren entsprechend großen Magneten mit jeweils drei Millilitern Trennpuffer, so dass das gesamte Volumen des Trennpuffers durch jede Säule in einen Abfallbehälter fließen kann. Platzieren Sie nun ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen unter jeder Säule und fügen Sie die mit Magnetpartikeln markierten Zellen zu den entsprechenden Säulen hinzu. Wenn das gesamte Volumen jeder Zellfraktion jede Säule durchlaufen hat, geben Sie drei Milliliter frischen eiskalten Trennpuffer auf den oberen Rand jeder Säule und sammeln Sie die Abwässer in den markierten Röhrchen.

Nachdem die zweite Wäsche vollständig durch die Säulen abgeflossen ist, legen Sie die Röhrchen mit den negativ selektierten Zellen jeder Fraktion auf Eis und überführen Sie die Säulen in neue 15-Milliliter-Röhrchen für jede Fraktion. Füllen Sie jede Säule mit etwa sechs Millilitern frischem Separationspuffer und tauchen Sie den Puffer sofort durch die Säulen, um die magnetisch gebundenen Zellen zu sammeln. Anschließend werden sowohl die positiven als auch die negativen Zellfraktionen durch Zentrifugation gesammelt und die Pellets in der entsprechenden Lösung für die geplante Downstream-Analyse resuspendiert.

In diesen Diagrammen zeigt die Häufigkeit von Tetanus-Toxoid-reaktiven B-Zellen von einer Person, die zuletzt vor mehr als einem Jahrzehnt gegen Tetanus geimpft wurde, die Fähigkeit dieser Methode, die Tetanus-Toxoid-bindenden Zellen etwa siebenfach mit einer Reinheit von etwa 4% anzureichernDie Zugabe eines 50-fachen Überschusses an unmarkiertem Tetanus-Toxoid zu den Zellen eines Probanden, der etwa drei Jahre vor der Blutabnahme geimpft wurde. Vor der Zugabe von biotinyliertem Antigen wird die Tetanus-Toxoid-Bindung um 83% verringert, was die Spezifität der Antigenbindung zeigt. Wenn das biotinylierte Antigen aus dem Verfahren ausgeschlossen wird, binden nur noch 0,2 % der B-Zellen, vermutlich was die Bindung eines Nicht-Tetanus-Antigens im Absorptionsmittel widerspiegelt.

Diese Diagramme zeigen, wie die Häufigkeit von Tetanus-Toxoid-spezifischen naiven B-Zellen aus einer Blutprobe, die sieben Tage nach der Auffrischungsimpfung eines gesunden Probanden entnommen wurde, von 84 % auf 64 % nach der Auffrischung abnimmt. Während der Prozentsatz der Gedächtnis- und Plasmablastenpopulationen von 16 % auf 36 % bzw. null auf 40 % steigt. Darüber hinaus veranschaulichen repräsentative ELISPOT-Daten aus einer peripheren Blutprobe, die sieben Tage nach dem Boost von einem gesunden Probanden erhalten wurde, die vierfache Anreicherung der Tetanus-Toxoid-Antikörper-sezernierenden Zellfrequenz, die in den isolierten Tetanus-Toxoid-bindenden B-Zellen beobachtet wurde.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei bis vier Stunden mit der richtigen Steuerung abgeschlossen werden. Die Methode kann mit sekundären Assays kombiniert werden, z. B. dem Transfer von Zellen in adoptierte Empfänger für nachfolgende Studien des Zellschicksals und der Zellfunktion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie seltene antigenbindende B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit den richtigen Kontrollen isolieren und anreichern können.