Name: Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten mittels intraperitonealer Injektion einer transduzierten Stromzelllinie. Diese Technik ermöglicht flexible Zytokin-Gabe für Krebsforschung und Hämatopoese-Studien.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, einem Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant Grant, dem Department of Pathology and Human Anatomy, dem Department of Basic Sciences und dem Center for Health Disparities and Molecular Medicine an der Loma Linda University School of Medicine und durch ein Stipendium zur Förderung kollaborativer und translationaler Forschung von der Loma Linda University (KJP). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von PDX, um exogenes menschliches Zytokin auszudrücken. Die hier beschriebene Strategie basiert auf wöchentlichen intraperitonealen Injektionen einer Stromazelle, die transduziert wurden, um das menschliche Cytokin, TSLP, zu exprimieren. Vor der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren wurden Stroma entwickelt, um hohe Konzentrationen des Cytokins von Interesse (TSLP) und ähnlich entwickelten Kontrollstroma zu ex...

Patient-abgeleitete Xenotransplantate (PDX) sind ein leistungsfähiges In-vivo- Modell für das Studium der Produktion von normalen und malignen hämatopoetischen Zellen in einer &quot;nativen&quot; Säugetierumgebung. Am häufigsten werden PDX durch Injektion oder Verpflanzung menschlicher Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Die Produktion von PDX mit normalen menschlichen hämatopoetischen Stammzellen ermöglicht in vivo Studien über normales menschliches Blut und Immunzellenentwicklung. PDX, hergestellt aus Leukämie oder anderen Krebszellen, ermöglicht es, onkogene Mechanismen zu untersuchen und wirksame Therapien im Kontext der genetischen Landschaften und Mutationen, die in der menschlichen Bevölkerung vorhanden sind, zu identifizieren. 1 Infolgedessen sind PDX der gegenwärtige Goldstandard für die Translationsbiomedizinforschung, um wirkungsvolle Therapien zu identifizieren und ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen des Krebsfortschritts zu sein. PDX-Modelle sind ein wichtiges Instrument zur Unterstützung der Erforschung von gesundheitlichen Disparitäten Krankheiten aufgrund spezifischer<html> Genetische Läsionen oder jede Krankheit, bei der die Variationen der genetischen Landschaft eines Patienten wesentlich zum Onkogenese- und Behandlungsergebnis beitragen können. Maus-menschliche PDX-Modelle sind möglich, weil viele Maus-Zytokine adäquat ihre menschlichen Analoga bei der Aktivierung der Zytokin-Rezeptoren von menschlichen Zellen imitieren, während sie in der Maus sind. Beispielsweise liefert Interleukin-7 (IL-7) ein kritisches Signal für die menschliche B-Zell-Entwicklung. 2 In diesem Fall hat Maus IL-7 eine ausreichende Homologie mit humanem IL-7, dass das Maus-Zytokin Signalwege in menschlichen B-Zell-Vorläufern stimuliert. 2 , 3 , 4 Allerdings ist dies bei Thymus-Stromaz-Lymphopoetin (TSLP), 5 , 6 nicht der Fall , der unter anderen Zytokinen (IL-3, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 ist wichtig für die Produktion von normalen und bösartigen menschlichen hämatopoetischen Zellen.Wenn Maus und menschliche Zytokine zeigen eine niedrige Homologie die Maus-Zytokine nicht aktivieren ihre jeweiligen Rezeptoren auf menschlichen Zellen.Um dieses Hindernis zu überwinden, wurden eine Reihe von Strategien verwendet Um die Expression von humanen Zytokinen in PDX-Mäusen zu entwickeln, darunter die Injektion von rekombinanten humanen Zytokinen, die hydrodynamische Injektion von DNA, die lentivirale Expression, die transgene Expression und den Knockin-Gen-Ersatz. 7 Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX zur Herstellung von menschlichem Cytokin über Stroma-vermittelte Zytokinabgabe ( Abbildung 1 ). In der hier vorgestellten Methode werden PDX-Mäuse entwickelt, um das menschliche Zytokin, TSLP, zu exprimieren oder als Zytokin-Negativkontrollen zu dienen. TSLP-exprimierende PDX werden durch wöchentliche intraperitoneale Injektionen von Stromazellen erreicht, die transduziert wurden, um ein hohes Maß an menschlichem TSLP zu exprimieren.Cytokin-negative PDX-Kontroll-Mäuse sind ähnlich konstruiert; Obwohl Kontrollstroma mit einem Kontrollvektor transduziert werden. Diese Methode erreicht normale physiologische Werte von humanem TSLP in PDX-Mäusen, die mit dem TSLP + Stroma injiziert wurden. Bei PDX-Mäusen, die das Cytokin-negative Stroma erhalten, wird kein nachweisbares TSLP beobachtet. Wir haben die menschliche Stromzelllinie HS-27A für unsere Studien ausgewählt, weil sie in der Kultur robust wächst und eine sehr geringe Zytokinproduktion zeigt, die die Proliferation von isolierten Vorläuferzellen in Kokulturen nicht unterstützt. 8 Für die menschliche TSLP-Expression wurden Stroma mit einem fortgeschrittenen, selbstinaktivierenden lentiviralen Vektor transduziert, der aus einem zuvor beschriebenen Rückgrat 9 gewonnen wurde, und umfasst das cPPT / cts-Element und das Woodchuck-Hepatitis-posttranskriptionelle regulatorische Element (WPRE), um die Transgenexpression zu erhöhen. Das menschliche TSLP-Gen wurde unter der Kontrolle des Elongationsfaktors-1 in diesen Vektor konstruiert(EF-1) alpha-Promotor, um eine robuste, konstitutive und langfristige Expression zu erreichen. Die Technik dieses menschlich-zytokinverstärkten PDX-Modells besteht aus 4 Hauptschritten. Zuerst werden transduziertes Stroma in vitro expandiert und durch enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) für eine stabile, hochgradige Zytokinproduktion bewertet. Zweitens wird die Aktivität der menschlichen Zytokine, die durch die transduzierten Stromazellen (und der Mangel an Zytokinaktivität aus Kontrollstroma) erzeugt wird, unter Verwendung von Phospho-Flow-Zytometrie verifiziert. Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie auf Cytokin von Interesse (in diesem Fall TSLP) reagieren, werden mit dem stromalen Zellüberstand inkubiert und auf Zytokin-induzierte Phosphorylierung untersucht. Drittens werden Mäuse mit transduziertem menschlichem Stroma injiziert und dann wird das Mausplasma durch den ELISA auf der Ebene des menschlichen Zytokins auf wöchentlicher Basis beurteilt. Viertens werden menschliche hämatopoetische Zellen transplantiert und die in vivo funktionellen Effekte des menschlichen Zytokins werden auf einem bekannten Ziel ( <em&gt; Z.B. Zellpopulation). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Abbildung 1: PDX-Modell entwickelt, um exogenes menschliches Cytokin in Mäusen zu produzieren. ( 1A ) Design-Experiment und erhalten transduzierte menschliche Stromazellen ( 1B ) Erhalten menschliche Zellen (hämatopoetische Stammzellen, Leukämie-Zellen, etc. ), um PDX (Patient-abgeleitete Xenotransplantat) Mäuse zu erzeugen. ( 2A ) Injizieren Sie konstruiertes Stroma und ( 2B ) transplantieren menschliche Zellen in immune defiziente Mäuse nach experimentellen Zeitplan. ( 3A-B ) Überwachen Sie die Zytokinkonzentrationen im Stroma-Überstand und das Maus-Plasma durch ELISA. ( 4 ) Ernten Sie menschliche Zellen und beurteilen Sie die in vivo funktionellen Effekte des im PDX vorhandenen menschlichen Zytokins. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier</a>Um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die Zufuhr von humanem Cytokin über Stromazellen bietet sowohl Vor- als auch Nachteile im Vergleich zu anderen Methoden der Bereitstellung / Herstellung von menschlichen Zytokinen in PDX-Mäusen. 7 Im Vergleich zur Injektion von rekombinantem humanem Cytokin ist die Stroma-vermittelte Verabreichung im Allgemeinen weniger teuer (die Kosten der Stromazinkultur sind weniger als die Kosten des rekombinanten Cytokins) und weniger arbeitsintensiv (eine Injektion pro Woche gegenüber mehreren Injektionen pro Woche). Die Frage der kurzen Zytokin-Halbwertszeit wird ebenfalls gemildert, da Stroma kontinuierlich das exogene Cytokin produziert. Die Verabreichung von Zytokin über die hydrodynamische Injektion von DNA kann weniger teuer sein als die Lieferung über Stroma. Allerdings ist es ähnlich vorübergehend und kann mehr technische Fähigkeiten erfordern als die einfache wöchentliche intraperitoneale Injektion, die für die Stroma-vermittelte Lieferung erforderlich ist. Die lentivirale Genexpression in der Maus kann wenigerNsient Methode der Zytokin-Lieferung; In unseren händen wurden jedoch physiologische TSLP-Werte nicht erreicht. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv und erfordert eine kontinuierliche Produktion von lentiviralen Vektor. Transgene oder knock-in Mäuse bieten eine stabile Langzeit-Expression von Zytokin und können für die gewebespezifische Expression entwickelt werden, was ein Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite erfordert die transgene Expression des menschlichen Zytokin-Gens auf dem immune defizienten Maushintergrund, der für PDX-Mäuse erforderlich ist, eine immense Investition von Ressourcen, bevor der Wert des Modells hergestellt wurde. Darüber hinaus erlauben transgene Modelle im Allgemeinen nicht die Möglichkeit, den Zeitpunkt der Zytokininitiierung oder des Grades der in vivo- Zytokinproduktion zu variieren. Diese können mit der Stroma-vermittelten Verabreichung durch einfaches Ändern des Zeitpunkts für die Initiation der Stromazelleninjektion oder der Dosis der injizierten Stromazellen erreicht werden. Die stromalzellvermittelte Cytokin-Abgabe methOd hier wurde verwendet, um PDX für die Bewertung der Rolle von TSLP in der normalen menschlichen B-Zell-Entwicklung 4 , 6 und hoher Risiko B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie zu entwickeln. 6 Diese Methode stellt eine alternative Cytokin-Verabreichungsmethode zur Verwendung bei der Erzeugung von ähnlichen Modellen mit menschlichen Zytokinen außer TSLP zur Verfügung. Dieses Modell kann auch nützlich sein, um vorläufige Daten zu erzeugen, die helfen können, festzustellen, ob der Wert eines Zytokin-transgenen oder zytokinischen Klopf-in-PDX-Modells der erheblichen Zeit- und Geldinvestition würdig wäre.

<table><tbody><tr><td><stark>Nasslaborreagenzien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Mit Zellkulturen behandelte EasYFlaskas, 7 mL Fassungsvermögen, &nbsp; 25 cm&sup2; Kulturbereich</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL Kapazität, 75 cm&sup2; Kulturbereich & belüftete</td><td>Kappe Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Kolben mit Gewebekultur, 600 mL Fassungsvermögen, 150 cm&sup2; Kulturbereich & belüftete Kappe</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001 10 mL</td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipetten</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL konische Polystyrolröhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>konische Röhrchen aus Polypropylen 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Kryoröhrchen, Außengewinde</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Filtereinheiten mit SFCA-Membran, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calicium und Magnesium, 1-fach;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% Essigsäure mit Methylenblau</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr> <tr><td>"Trypsin" 1x 0,25 % Trypsin 2,21 mM EDTA in HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td><stark>" R10" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 565 mL)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 0,99% (5,6 mL)</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, 0,50% (2,8 mL)</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 0,10% (560 & Mikro; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><stark>" R20" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 195 ml)</stark></td><td>-</td><td>-</td><td><stark>Laborrezept</stark></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; mL)</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20,49% (40 mL)</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2 mM L-Glutamin, 1,02% (2 mL)</td> <td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM Na Pyruvat, 1,02% (2 mL )</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicillin-Streptomycin,&nbsp; 0,51% (1 ml)</td><td>siehe oben</td>, <td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-Mercaptoethanol, 0,10 % (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &Mikro; L)</td><td>siehe oben</td>, <td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td><stark>" Gefriermedium", % des Gesamtvolumens</td><td></td>-<td>-</td><td>Lab Rezept</td></tr><tr><td>" R10" mittel, 45%</td><td>siehe "R10"</td> <td>Rezept-FBS</td><td></td></tr><tr><td>, 20%</td><td>siehe oben</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trehalose-Dihydrat, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catolog Number </td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27" HS-27A humane Stromalinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 Zelllinie, humane B-Zell-Vorstufe Leukämie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>" NSG-Mäuse" NICKEN. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, männlich oder weiblich, 6 Jahre &ndash; 8 Wochen</td><td>JAX Mäuse&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5-Zelllinie, humane B-Zell-Vorläufer-Leukämie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TSLP-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow Cytomery Antikörper (Klon)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (alternativer Name ist IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig & Kappa; Leichtmetallkette FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig & Lambda Leichtkette FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; Maus Anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Catolog Number<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Sonstige Materialien & Ausrüstung&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Implantierbarer NanoTransponder mit Kanüle</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLA Lidocain-Anästhesiecreme (durch Rezept über eine Tierpflegeeinrichtung erhalten)</td><td>Verschreibung</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>&frac12; cc LO-DOSE U-100 Insulinspritze 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer-Röhrchen mit K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Kapillarröhrchen (heparinisiert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Pie-Käfig</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Mausschwanz-Illuminator Halterung</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Pistolengriff Implanter</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&Mikro; Quant&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Durchflusszytometrie-Analysesoftware</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>*Alle Antikörper sind, sofern nicht anders angegeben, gegen den Menschen.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression von exogenem cytokin in patient-abgeleiteten xenotransplantaten über injektion mit einer cytokin-transduzierten stromzelllinie

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-abgeleitete Xenotransplantat (PDX) -Mäuse werden durch Transplantation von menschlichen Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Diese Modelle sind ein wichtiges Instrument für das Studium der Mechanismen der normalen und malignen Hämatopoese und sind der Goldstandard für die Identifizierung effektiver Chemotherapien für viele Malignome. PDX-Modelle sind möglich, weil viele der Maus-Zytokine auch auf menschliche Zellen wirken. Allerdings ist dies nicht der Fall für alle Zytokine, darunter viele, die für das Studium der normalen und malignen Hämatopoese in menschlichen Zellen kritisch sind. Techniken, die Mäuse zur Herstellung von menschlichen Zytokinen (transgene und knock-in Modelle) erfordern, erfordern erhebliche Kosten, bevor die Nützlichkeit des Modells nachgewiesen wurde. Andere Techniken sind arbeitsintensiv (Injektion von rekombinantem Cytokin oder Lentivirus) und erfordern in manchen Fällen ein hohes Maß an technischem Fachwissen (hydrodynamische Injektion von DNA). Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode zur Erzeugung von PDX-Mäusen, die exogenes menschliches Cy habenTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) über wöchentliche intraperitoneale Injektion von Stroma, die transduziert wurden, um dieses Zytokin zu überexprimieren. Die Verwendung dieser Methode liefert eine in vivo Quelle der kontinuierlichen Zytokinproduktion, die physiologische Konzentrationen von zirkulierendem menschlichem Zytokin in der Maus erreicht. Die Plasmaspiegel des menschlichen Zytokins können auf der Grundlage der Anzahl der injizierten Stromazellen variiert werden, und die Zytokinproduktion kann an jedem Punkt des Experiments initiiert werden. Diese Methode umfasst auch Cytokin-negative Kontrollmäuse, die in ähnlicher Weise produziert werden, aber durch intraperitoneale Injektion von Stroma, die mit einem Kontrollvektor transduziert wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass Leukämiezellen, die aus TSLP-exprimierendem PDX gewonnen wurden, im Vergleich zu Kontroll-PDX ein Genexpressionsmuster mehr wie die ursprüngliche Patientenprobe aufweisen. Gemeinsam bilden die durch diese Methode hergestellten Cytokin-produzierenden und zytokin-negativen PDX-Mäuse ein Modellsystem, das wir erfolgreich eingesetzt habenRolle der TSLP bei normaler und malignen Hämatopoese.

Eine Übersicht über das Modell ist in Abbildung 1 dargestellt . Sobald Cytokin-produzierende (TSLP + Stroma) und Kontrollstroma erhalten wurden, werden sie in Kultur expandiert. Vor der Stroma-Injektion in Mäuse wird der stromale Zellüberstand durch ELISA zur Überprüfung der Zytokinproduktion (Abbildung 2 ) und der Phospho-Flow-Zytometrie (Protokoll Nr. 3) beurteilt, um die Aktivität des durch das Stroma erzeugten Zytokins zu verifizieren. Der Überstand ...

Hier beschrieben ist eine Methode zur Herstellung von exogenem Cytokin in Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX) -Mäusen über eine wöchentliche intraperitoneale Injektion einer Cytokin-transduzierten Stromazellenlinie. Diese Methode erweitert den Nutzen von PDX und bietet die Möglichkeit für transiente oder nachhaltige exogene Cytokin-Zustellung in einer Vielzahl von PDX-Modellen.

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Xenotransplantat-Mäuse mit zirkulierenden humanen Zytokinen herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Krebsforschung und der Hämatopoese zu beantworten, beispielsweise: Welche Rolle spielt ein bestimmtes Zytokin bei der normalen und malignen Lymphozytenentwicklung? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Forscher die zirkulierenden Konzentrationen eines exogenen Zytokins in ihren Xenotransplantat-Tieren je nach den Anforderungen ihres Experiments anpassen können.Dies macht es überflüssig, neue und kostspielige transgene Mauslinien zu erzeugen. Diese Technik wird nützlich sein, um neue Krebstherapien zu erforschen, da mit diesem präklinischen Modell Antikrebsmittel getestet werden können, ähnlich wie in der klinischen Anwendung. Obwohl diese Methode Einblicke in die normale Hämatopoese ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung spezifischer Erkrankungen wie der Leukämie eingesetzt werden.Ich entwickelte diese Idee erstmals, als wir ein In-vivo-Modell benötigten, um die Rolle des Zytokins TSLP bei der normalen und malignen humanen B-Zellproduktion zu untersuchen. Beginnen Sie damit,

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Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Dieser Artikel beschreibt die Technik zur ex vivo T-Zell-Stimulation, um die intrazelluläre Konzentration von Zytokinen wie Interferon-gamma oder IFN-gamma und Tumornekrosefaktor-alpha oder TNF-alpha in der T-Zelle zu erhöhen. Diese Zytokine vermitteln eine wirksame Anti-Tumor-Antwort und können eine therapeutische Rolle im Tumor spielen.

ex vivo T-Zell-Stimulation im Pankreastumor: Eine Methode zur Steigerung der Zytokinproduktion in T-Zellen

Dieses Video zeigt die Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Phosphorylierung von Proteinen in Leukämiezellen. Diese intrazellulären phosphorylierten Proteine werden mit der Phospho-Durchflusszytometrie-Technik quantifiziert.

Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Proteinphosphorylierung mittels Phospho-Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir eine minimalinvasive Phänomen orthotopen Transplantation Modell der Lunge Adenokarzinom Mauszellen als Zeit und kostensenkende Modell, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zu studieren.

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

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Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die immunstimulierende Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren aus embryonalen Stammzellen tragen.

Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Ausdehnung von peripheren mononukleären Blutzellen dar, die von Zytokin-induzierten CD3+CD56+ Killerzellen abgeleitet wurden, und ihre Zytotoxizitätswirkung gegen hämatologische und feste Krebszellen anhand eines in vitro-diagnosebasierten Durchflusszytometriesystems zu veranschaulichen.

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

Erfahren Sie die Methode zur Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten mittels intraperitonealer Injektion einer transduzierten Stromzelllinie. Diese Technik ermöglicht flexible Zytokin-Gabe für Krebsforschung und Hämatopoese-Studien.

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie (Video) | JoVE Journal

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

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