Name: Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten mittels intraperitonealer Injektion einer transduzierten Stromzelllinie. Diese Technik ermöglicht flexible Zytokin-Gabe für Krebsforschung und Hämatopoese-Studien.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, einem Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant Grant, dem Department of Pathology and Human Anatomy, dem Department of Basic Sciences und dem Center for Health Disparities and Molecular Medicine an der Loma Linda University School of Medicine und durch ein Stipendium zur Förderung kollaborativer und translationaler Forschung von der Loma Linda University (KJP). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von PDX, um exogenes menschliches Zytokin auszudrücken. Die hier beschriebene Strategie basiert auf wöchentlichen intraperitonealen Injektionen einer Stromazelle, die transduziert wurden, um das menschliche Cytokin, TSLP, zu exprimieren. Vor der Durchführung der hier beschriebenen Verfahren wurden Stroma entwickelt, um hohe Konzentrationen des Cytokins von Interesse (TSLP) und ähnlich entwickelten Kontrollstroma zu ex...

Patient-abgeleitete Xenotransplantate (PDX) sind ein leistungsfähiges In-vivo- Modell für das Studium der Produktion von normalen und malignen hämatopoetischen Zellen in einer &quot;nativen&quot; Säugetierumgebung. Am häufigsten werden PDX durch Injektion oder Verpflanzung menschlicher Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Die Produktion von PDX mit normalen menschlichen hämatopoetischen Stammzellen ermöglicht in vivo Studien über normales menschliches Blut und Immunzellenentwicklung. PDX, hergestellt aus Leukämie oder anderen Krebszellen, ermöglicht es, onkogene Mechanismen zu untersuchen und wirksame Therapien im Kontext der genetischen Landschaften und Mutationen, die in der menschlichen Bevölkerung vorhanden sind, zu identifizieren. 1 Infolgedessen sind PDX der gegenwärtige Goldstandard für die Translationsbiomedizinforschung, um wirkungsvolle Therapien zu identifizieren und ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen des Krebsfortschritts zu sein. PDX-Modelle sind ein wichtiges Instrument zur Unterstützung der Erforschung von gesundheitlichen Disparitäten Krankheiten aufgrund spezifischer<html> Genetische Läsionen oder jede Krankheit, bei der die Variationen der genetischen Landschaft eines Patienten wesentlich zum Onkogenese- und Behandlungsergebnis beitragen können. Maus-menschliche PDX-Modelle sind möglich, weil viele Maus-Zytokine adäquat ihre menschlichen Analoga bei der Aktivierung der Zytokin-Rezeptoren von menschlichen Zellen imitieren, während sie in der Maus sind. Beispielsweise liefert Interleukin-7 (IL-7) ein kritisches Signal für die menschliche B-Zell-Entwicklung. 2 In diesem Fall hat Maus IL-7 eine ausreichende Homologie mit humanem IL-7, dass das Maus-Zytokin Signalwege in menschlichen B-Zell-Vorläufern stimuliert. 2 , 3 , 4 Allerdings ist dies bei Thymus-Stromaz-Lymphopoetin (TSLP), 5 , 6 nicht der Fall , der unter anderen Zytokinen (IL-3, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 ist wichtig für die Produktion von normalen und bösartigen menschlichen hämatopoetischen Zellen.Wenn Maus und menschliche Zytokine zeigen eine niedrige Homologie die Maus-Zytokine nicht aktivieren ihre jeweiligen Rezeptoren auf menschlichen Zellen.Um dieses Hindernis zu überwinden, wurden eine Reihe von Strategien verwendet Um die Expression von humanen Zytokinen in PDX-Mäusen zu entwickeln, darunter die Injektion von rekombinanten humanen Zytokinen, die hydrodynamische Injektion von DNA, die lentivirale Expression, die transgene Expression und den Knockin-Gen-Ersatz. 7 Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX zur Herstellung von menschlichem Cytokin über Stroma-vermittelte Zytokinabgabe ( Abbildung 1 ). In der hier vorgestellten Methode werden PDX-Mäuse entwickelt, um das menschliche Zytokin, TSLP, zu exprimieren oder als Zytokin-Negativkontrollen zu dienen. TSLP-exprimierende PDX werden durch wöchentliche intraperitoneale Injektionen von Stromazellen erreicht, die transduziert wurden, um ein hohes Maß an menschlichem TSLP zu exprimieren.Cytokin-negative PDX-Kontroll-Mäuse sind ähnlich konstruiert; Obwohl Kontrollstroma mit einem Kontrollvektor transduziert werden. Diese Methode erreicht normale physiologische Werte von humanem TSLP in PDX-Mäusen, die mit dem TSLP + Stroma injiziert wurden. Bei PDX-Mäusen, die das Cytokin-negative Stroma erhalten, wird kein nachweisbares TSLP beobachtet. Wir haben die menschliche Stromzelllinie HS-27A für unsere Studien ausgewählt, weil sie in der Kultur robust wächst und eine sehr geringe Zytokinproduktion zeigt, die die Proliferation von isolierten Vorläuferzellen in Kokulturen nicht unterstützt. 8 Für die menschliche TSLP-Expression wurden Stroma mit einem fortgeschrittenen, selbstinaktivierenden lentiviralen Vektor transduziert, der aus einem zuvor beschriebenen Rückgrat 9 gewonnen wurde, und umfasst das cPPT / cts-Element und das Woodchuck-Hepatitis-posttranskriptionelle regulatorische Element (WPRE), um die Transgenexpression zu erhöhen. Das menschliche TSLP-Gen wurde unter der Kontrolle des Elongationsfaktors-1 in diesen Vektor konstruiert(EF-1) alpha-Promotor, um eine robuste, konstitutive und langfristige Expression zu erreichen. Die Technik dieses menschlich-zytokinverstärkten PDX-Modells besteht aus 4 Hauptschritten. Zuerst werden transduziertes Stroma in vitro expandiert und durch enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA) für eine stabile, hochgradige Zytokinproduktion bewertet. Zweitens wird die Aktivität der menschlichen Zytokine, die durch die transduzierten Stromazellen (und der Mangel an Zytokinaktivität aus Kontrollstroma) erzeugt wird, unter Verwendung von Phospho-Flow-Zytometrie verifiziert. Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie auf Cytokin von Interesse (in diesem Fall TSLP) reagieren, werden mit dem stromalen Zellüberstand inkubiert und auf Zytokin-induzierte Phosphorylierung untersucht. Drittens werden Mäuse mit transduziertem menschlichem Stroma injiziert und dann wird das Mausplasma durch den ELISA auf der Ebene des menschlichen Zytokins auf wöchentlicher Basis beurteilt. Viertens werden menschliche hämatopoetische Zellen transplantiert und die in vivo funktionellen Effekte des menschlichen Zytokins werden auf einem bekannten Ziel ( <em&gt; Z.B. Zellpopulation). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Abbildung 1: PDX-Modell entwickelt, um exogenes menschliches Cytokin in Mäusen zu produzieren. ( 1A ) Design-Experiment und erhalten transduzierte menschliche Stromazellen ( 1B ) Erhalten menschliche Zellen (hämatopoetische Stammzellen, Leukämie-Zellen, etc. ), um PDX (Patient-abgeleitete Xenotransplantat) Mäuse zu erzeugen. ( 2A ) Injizieren Sie konstruiertes Stroma und ( 2B ) transplantieren menschliche Zellen in immune defiziente Mäuse nach experimentellen Zeitplan. ( 3A-B ) Überwachen Sie die Zytokinkonzentrationen im Stroma-Überstand und das Maus-Plasma durch ELISA. ( 4 ) Ernten Sie menschliche Zellen und beurteilen Sie die in vivo funktionellen Effekte des im PDX vorhandenen menschlichen Zytokins. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier</a>Um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die Zufuhr von humanem Cytokin über Stromazellen bietet sowohl Vor- als auch Nachteile im Vergleich zu anderen Methoden der Bereitstellung / Herstellung von menschlichen Zytokinen in PDX-Mäusen. 7 Im Vergleich zur Injektion von rekombinantem humanem Cytokin ist die Stroma-vermittelte Verabreichung im Allgemeinen weniger teuer (die Kosten der Stromazinkultur sind weniger als die Kosten des rekombinanten Cytokins) und weniger arbeitsintensiv (eine Injektion pro Woche gegenüber mehreren Injektionen pro Woche). Die Frage der kurzen Zytokin-Halbwertszeit wird ebenfalls gemildert, da Stroma kontinuierlich das exogene Cytokin produziert. Die Verabreichung von Zytokin über die hydrodynamische Injektion von DNA kann weniger teuer sein als die Lieferung über Stroma. Allerdings ist es ähnlich vorübergehend und kann mehr technische Fähigkeiten erfordern als die einfache wöchentliche intraperitoneale Injektion, die für die Stroma-vermittelte Lieferung erforderlich ist. Die lentivirale Genexpression in der Maus kann wenigerNsient Methode der Zytokin-Lieferung; In unseren händen wurden jedoch physiologische TSLP-Werte nicht erreicht. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv und erfordert eine kontinuierliche Produktion von lentiviralen Vektor. Transgene oder knock-in Mäuse bieten eine stabile Langzeit-Expression von Zytokin und können für die gewebespezifische Expression entwickelt werden, was ein Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite erfordert die transgene Expression des menschlichen Zytokin-Gens auf dem immune defizienten Maushintergrund, der für PDX-Mäuse erforderlich ist, eine immense Investition von Ressourcen, bevor der Wert des Modells hergestellt wurde. Darüber hinaus erlauben transgene Modelle im Allgemeinen nicht die Möglichkeit, den Zeitpunkt der Zytokininitiierung oder des Grades der in vivo- Zytokinproduktion zu variieren. Diese können mit der Stroma-vermittelten Verabreichung durch einfaches Ändern des Zeitpunkts für die Initiation der Stromazelleninjektion oder der Dosis der injizierten Stromazellen erreicht werden. Die stromalzellvermittelte Cytokin-Abgabe methOd hier wurde verwendet, um PDX für die Bewertung der Rolle von TSLP in der normalen menschlichen B-Zell-Entwicklung 4 , 6 und hoher Risiko B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie zu entwickeln. 6 Diese Methode stellt eine alternative Cytokin-Verabreichungsmethode zur Verwendung bei der Erzeugung von ähnlichen Modellen mit menschlichen Zytokinen außer TSLP zur Verfügung. Dieses Modell kann auch nützlich sein, um vorläufige Daten zu erzeugen, die helfen können, festzustellen, ob der Wert eines Zytokin-transgenen oder zytokinischen Klopf-in-PDX-Modells der erheblichen Zeit- und Geldinvestition würdig wäre.

<table><tbody><tr><td><stark>Nasslaborreagenzien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Mit Zellkulturen behandelte EasYFlaskas, 7 mL Fassungsvermögen, &nbsp; 25 cm&sup2; Kulturbereich</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL Kapazität, 75 cm&sup2; Kulturbereich & belüftete</td><td>Kappe Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Kolben mit Gewebekultur, 600 mL Fassungsvermögen, 150 cm&sup2; Kulturbereich & belüftete Kappe</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001 10 mL</td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipetten</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL konische Polystyrolröhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>konische Röhrchen aus Polypropylen 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Kryoröhrchen, Außengewinde</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Filtereinheiten mit SFCA-Membran, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calicium und Magnesium, 1-fach;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% Essigsäure mit Methylenblau</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td></td></tr> <tr><td>"Trypsin" 1x 0,25 % Trypsin 2,21 mM EDTA in HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td><stark>" R10" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 565 mL)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88,5% (500 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9% (56 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 0,99% (5,6 mL)</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, 0,50% (2,8 mL)</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 0,10% (560 & Mikro; L)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><stark>" R20" Zellkulturmedium, % des Gesamtvolumens (ergibt 195 ml)</stark></td><td>-</td><td>-</td><td><stark>Laborrezept</stark></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76,84% (150&nbsp; mL)</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20,49% (40 mL)</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2 mM L-Glutamin, 1,02% (2 mL)</td> <td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM Na Pyruvat, 1,02% (2 mL )</td><td>siehe oben</td><td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Penicillin-Streptomycin,&nbsp; 0,51% (1 ml)</td><td>siehe oben</td>, <td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-Mercaptoethanol, 0,10 % (0,1 M),&nbsp; 0,10% (200 &Mikro; L)</td><td>siehe oben</td>, <td>siehe oben</td><td></td></tr><tr><td><stark>" Gefriermedium", % des Gesamtvolumens</td><td></td>-<td>-</td><td>Lab Rezept</td></tr><tr><td>" R10" mittel, 45%</td><td>siehe "R10"</td> <td>Rezept-FBS</td><td></td></tr><tr><td>, 20%</td><td>siehe oben</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Trehalose-Dihydrat, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catolog Number </td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27" HS-27A humane Stromalinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4" MHH-CALL-4 Zelllinie, humane B-Zell-Vorstufe Leukämie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>" NSG-Mäuse" NICKEN. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, männlich oder weiblich, 6 Jahre &ndash; 8 Wochen</td><td>JAX Mäuse&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5-Zelllinie, humane B-Zell-Vorläufer-Leukämie</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TSLP-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow Cytomery Antikörper (Klon)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (alternativer Name ist IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig & Kappa; Leichtmetallkette FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig & Lambda Leichtkette FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; Maus Anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Catolog Number<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Sonstige Materialien & Ausrüstung&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Implantierbarer NanoTransponder mit Kanüle</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLA Lidocain-Anästhesiecreme (durch Rezept über eine Tierpflegeeinrichtung erhalten)</td><td>Verschreibung</td><td>BD</td><td></td></tr><tr><td>&frac12; cc LO-DOSE U-100 Insulinspritze 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer-Röhrchen mit K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Kapillarröhrchen (heparinisiert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Pie-Käfig</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Mausschwanz-Illuminator Halterung</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Pistolengriff Implanter</td><td>Trovan&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&Mikro; Quant&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Durchflusszytometrie-Analysesoftware</td><td>FlowJo, LLC</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>*Alle Antikörper sind, sofern nicht anders angegeben, gegen den Menschen.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression von exogenem cytokin in patient-abgeleiteten xenotransplantaten über injektion mit einer cytokin-transduzierten stromzelllinie

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Patient-abgeleitete Xenotransplantat (PDX) -Mäuse werden durch Transplantation von menschlichen Zellen in immundefiziente Mäuse produziert. Diese Modelle sind ein wichtiges Instrument für das Studium der Mechanismen der normalen und malignen Hämatopoese und sind der Goldstandard für die Identifizierung effektiver Chemotherapien für viele Malignome. PDX-Modelle sind möglich, weil viele der Maus-Zytokine auch auf menschliche Zellen wirken. Allerdings ist dies nicht der Fall für alle Zytokine, darunter viele, die für das Studium der normalen und malignen Hämatopoese in menschlichen Zellen kritisch sind. Techniken, die Mäuse zur Herstellung von menschlichen Zytokinen (transgene und knock-in Modelle) erfordern, erfordern erhebliche Kosten, bevor die Nützlichkeit des Modells nachgewiesen wurde. Andere Techniken sind arbeitsintensiv (Injektion von rekombinantem Cytokin oder Lentivirus) und erfordern in manchen Fällen ein hohes Maß an technischem Fachwissen (hydrodynamische Injektion von DNA). Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode zur Erzeugung von PDX-Mäusen, die exogenes menschliches Cy habenTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) über wöchentliche intraperitoneale Injektion von Stroma, die transduziert wurden, um dieses Zytokin zu überexprimieren. Die Verwendung dieser Methode liefert eine in vivo Quelle der kontinuierlichen Zytokinproduktion, die physiologische Konzentrationen von zirkulierendem menschlichem Zytokin in der Maus erreicht. Die Plasmaspiegel des menschlichen Zytokins können auf der Grundlage der Anzahl der injizierten Stromazellen variiert werden, und die Zytokinproduktion kann an jedem Punkt des Experiments initiiert werden. Diese Methode umfasst auch Cytokin-negative Kontrollmäuse, die in ähnlicher Weise produziert werden, aber durch intraperitoneale Injektion von Stroma, die mit einem Kontrollvektor transduziert wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass Leukämiezellen, die aus TSLP-exprimierendem PDX gewonnen wurden, im Vergleich zu Kontroll-PDX ein Genexpressionsmuster mehr wie die ursprüngliche Patientenprobe aufweisen. Gemeinsam bilden die durch diese Methode hergestellten Cytokin-produzierenden und zytokin-negativen PDX-Mäuse ein Modellsystem, das wir erfolgreich eingesetzt habenRolle der TSLP bei normaler und malignen Hämatopoese.

Eine Übersicht über das Modell ist in Abbildung 1 dargestellt . Sobald Cytokin-produzierende (TSLP + Stroma) und Kontrollstroma erhalten wurden, werden sie in Kultur expandiert. Vor der Stroma-Injektion in Mäuse wird der stromale Zellüberstand durch ELISA zur Überprüfung der Zytokinproduktion (Abbildung 2 ) und der Phospho-Flow-Zytometrie (Protokoll Nr. 3) beurteilt, um die Aktivität des durch das Stroma erzeugten Zytokins zu verifizieren. Der Überstand ...

Hier beschrieben ist eine Methode zur Herstellung von exogenem Cytokin in Patienten-abgeleiteten Xenotransplantat (PDX) -Mäusen über eine wöchentliche intraperitoneale Injektion einer Cytokin-transduzierten Stromazellenlinie. Diese Methode erweitert den Nutzen von PDX und bietet die Möglichkeit für transiente oder nachhaltige exogene Cytokin-Zustellung in einer Vielzahl von PDX-Modellen.

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Xenotransplantat-Mäuse mit zirkulierenden humanen Zytokinen herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Krebsforschung und der Hämatopoese zu beantworten, beispielsweise: Welche Rolle spielt ein bestimmtes Zytokin bei der normalen und malignen Lymphozytenentwicklung? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Forscher die zirkulierenden Konzentrationen eines exogenen Zytokins in ihren Xenotransplantat-Tieren je nach den Anforderungen ihres Experiments anpassen können.Dies macht es überflüssig, neue und kostspielige transgene Mauslinien zu erzeugen. Diese Technik wird nützlich sein, um neue Krebstherapien zu erforschen, da mit diesem präklinischen Modell Antikrebsmittel getestet werden können, ähnlich wie in der klinischen Anwendung. Obwohl diese Methode Einblicke in die normale Hämatopoese ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung spezifischer Erkrankungen wie der Leukämie eingesetzt werden.Ich entwickelte diese Idee erstmals, als wir ein In-vivo-Modell benötigten, um die Rolle des Zytokins TSLP bei der normalen und malignen humanen B-Zellproduktion zu untersuchen. Beginnen Sie damit, frisch aufgetaute Kontroll-Stroma-Zellen mit leerem Vektor in zytokinproduzierenden Zellen in jeweils fünf Milliliter R-10-Medium in einzelnen T25-Flaschen auszuplatzieren. Kultivieren Sie sie für 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 Prozent CO2.Wenn die Stromazellen konfluent sind, lösen Sie die Zellen mit Trypsin in EDTA ab, um sie für drei bis vier Tage in T150-Kulturflaschen erneut auszuplatzieren. Wenn die Stromazellen in den T150-Flaschen Konfluenz erreicht haben, sammeln Sie die Überstände und frieren Sie diese bei 80 Grad Celsius zur späteren Bestimmung ihrer Zytokinproduktion mittels ELISA ein. Anschließend überführen Sie jede Kultur aus einer T150-Flasche in drei neue T150-Flaschen, um sie bis zur Konfluenz weiterzukultivieren.Um die Zellen nach der geeigneten Anzahl von Passagen zu lagern, überführen Sie die gewonnenen Zellsuspensionen in ein kegelförmiges Reagenzglas zur Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in einem Gefriermittel. Überführen Sie anschließend Aliquots von 1,5E6 Zellen in Langzeitlagerungsgefäße zur Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff. Um das von den modifizierten Stromazellen produzierte Überstandsmaterial zu validieren, tauen Sie die aus der Kontrolle gewonnenen Überstandproben aus cytokinexprimierendem Stroma auf und geben je drei Vertiefungen von Leukämiezelllinien pro Bedingung in Au-20-Medium mit einer Konzentration von 2E5 Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Gewebekulturplatte.Die Zellen zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit die Phosphorylierung aus der vorherigen Kultur verloren geht. Anschließend die Zellen aus jedem Well in einzelne vier Milliliter-Röhrchen überführen und durch Zentrifugation sammeln. Die Pellets je nach experimenteller Bedingung in 600 Mikroliter resuspendieren.Plattieren Sie 200 Mikroliter Zellen pro Bedingung in dreifacher Ausführung pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen entsprechend der Angaben des spezifischen kommerziellen Phosphoassays. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Markieren Sie die Zellen mittels Phospho-Flow-Zytometrie-Färbung gemäß der Herstelleranleitung. Analysieren Sie anschließend die Zellen durchflusszytometrisch unter Verwendung standardmäßiger Protokolle zur Durchflusszytometrie, um zu überprüfen, ob das Zytokin im stromalen Überstand die Leukämiezellen phosphoryliert. Nach mindestens drei Passagen nach dem Auftauen überführen Sie die gewonnenen stromalen Zellsuspensionen in einzelne kegelförmige Röhrchen zur Zellzählung.Die Zellen durch Zentrifugation pelletieren und sie vorsichtig in den geeigneten Volumina steriler PBS für die Injektion resuspendieren. Die Zellen bis unmittelbar vor der Injektion bei vier Grad Celsius lagern, wobei die Suspension zu diesem Zeitpunkt auf mindestens Raumtemperatur erwärmt werden sollte. Wenn die Zellen bereit sind, die erste Probe durch Vorsichtiges Umstülpen mischen und 200 Mikroliter der Zellen in eine Tuberkulinspritze aufziehen.Dann fixieren Sie das erste Tier und injizieren die Zellen unter Verwendung standardmäßiger intraperitonealer Injektionstechniken in die Bauchhöhle. Um eine periphere Blutprobe zu entnehmen, positionieren Sie die Maus zunächst vorsichtig in einem desinfizierten Kleintierfixiergerät und sichern Sie das Röhrchen, um die Bewegungen des Tieres zu minimieren. Anschließend reinigen Sie den Schwanz mit frischem Isopropylalkohol, gefolgt von der Applikation einer topischen Anästhesiesalbe.Unter Verwendung sehr scharfer chirurgischer Scheren etwa 5 bis 1 Millimeter von der Schwanzspitze abschneiden und ungefähr 80 Mikroliter peripheres Blut in heparinisierte Kapillarröhrchen sammeln. Mit einer Birnenspritze die Blutproben in beschriftete Mikrocontainer-Röhrchen mit Kalium-EDTA überführen und das Röhrchen 20-mal vorsichtig umdrehen, um eine Gerinnung zu verhindern. Nach der Zentrifugation der Blutprobenröhrchen gemäß den Herstelleranweisungen die Plasmaschicht vorsichtig abheben, die Aliquots bei 20 Grad Celsius lagern und das Plasma für die Lagerung bei 20 Grad Celsius aliquotieren.Am Tag des ELISA werden die gefrorenen Maus-Plasmaproben aufgetaut und der ELISA-Standard seriell in 120-Mikroliter-Mengen verdünnt. Anschließend werden je 40 Mikroliter jedes Standards im Dreifachansatz in die entsprechenden Vertiefungen der ELISA-Platte pipettiert, gefolgt vom Zusatz von jeweils 40 Mikrolitern jeder Maus-Plasmaprobe in die entsprechenden Vertiefungen. Danach wird die ELISA-Analyse gemäß den Herstelleranweisungen abgeschlossen.24 Stunden nach der Bestrahlung der Mäuse bereiten Sie die humanen hämatopoetischen Zellen für die Xenotransplantation vor. Wenn Sie die hämatopoetischen Zellen in sterilem PBS resuspendieren, ist es ratsam, etwa 15 bis 20 Prozent mehr vorzubereiten, falls es während der Transplantation zu einem Verschütten kommt. Bewahren Sie die Zellen bis zur Transplantation bei vier Grad Celsius auf und überführen Sie das erste Empfängertier mindestens fünf Minuten lang in einen Wärmekäfig, um die Dilatation der Schwanzvene zu erleichtern.Erwärmen Sie die Zellen nun auf Raumtemperatur. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und ziehen Sie 200 Mikroliter in eine Tuberkulinspritze auf. Stellen Sie die Maus in den Halter und desinfizieren Sie den Schwanz mit Isopropylalkohol.Die Zellen in eine seitliche Schwanzvene injizieren. Anschließend die Maus mindestens fünf Minuten lang beobachten, um das Fehlen von unerwünschten Wirkungen im Zusammenhang mit der Transplantation zu bestätigen. Bei Patienten-abgeleiteten xenotransplantierten, oder PDX-Tieren, die mit Kontrollstroma injiziert wurden, liegen die Konzentrationen von menschlichem thymischem stromalen Lymphopoietin, oder TSLP, im Mausplasma durchgängig unterhalb der Nachweisgrenze für ELISA.Die Plasmaspiegel von humanem TSLP in PDX-Mäusen, die mit TSLP-transduzierten Stromazellen injiziert wurden, stehen in Relation zur Menge der injizierten TSLP-Stromazellen während der vorhergehenden ein bis zwei Wochen. Obwohl die Messung einzeln durchgeführt wurde, liefert diese wöchentliche Bestimmung der Plasmaspiegel von TSLP mittels des modifizierten ELISA im Allgemeinen zeitlich konsistente Ergebnisse. Es wurde gezeigt, dass TSLP die Produktion normaler menschlicher B-Zellvorläufer erhöht.Tatsächlich sind B-Linienzellen bei TSLP-plus-Mäusen bereits im Stadium der B-Zellvorläufer im Vergleich zu den Kontroll-PDX-Tieren signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass in TSLP-plus-PDX-Tieren produziertes humanes TSLP die erwarteten in-vivo-funktionellen Effekte auf Zielzellpopulationen ausübt. Sobald die Verfahren optimiert sind, können damit Xenotransplantat-Mäuse erzeugt werden, bei denen nach drei bis vier Wochen nachweisbare Mengen humaner Zytokine vorliegen. Es ist wichtig, die Zytokinkonzentration im Überstand der Stromazellen im Zeitverlauf zu überwachen.Dadurch wird sichergestellt, dass die Zytokinproduktion im zytokinproduzierenden Stroma aufrechterhalten bleibt und im Kontrollstroma fehlt. PDX-Mäuse können für präklinische Studien verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie verändert sich die Wirksamkeit eines bestimmten interessierenden Wirkstoffs durch die Variation der physiologischen Konzentrationen eines experimentellen Zytokins in vivo? Dieses innovative Modell bietet Forschern auf den Gebieten der Hämatologie und Onkologie einen neuen Ansatz, um die Rolle von TSLP bei der Entwicklung und Progression von Leukämie sowie seine Funktion in der normalen Hämatopoese zu untersuchen.Sofern Sie Zugang zu zytokintransduzierten Zelllinien haben, können Sie mithilfe der in diesem Video gezeigten Techniken eine beliebige exogene Zytokinquelle für xenotransplantierte Krankheitsmodelle aus Patientenmaterial unter Verwendung einer Vielzahl immundefizienter Mausstämme bereitstellen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit humanen hämatopoetischen Zellen gefährlich sein kann. Sie sollten stets Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um die Übertragung von blutübertragbaren Krankheitserregern während der Arbeit mit diesen Flüssigkeiten und Zellen zu vermeiden.

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Forschung

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Medizin

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Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie (Video) | JoVE Journal

Expression von exogenem Cytokin in Patient-abgeleiteten Xenotransplantaten über Injektion mit einer Cytokin-transduzierten Stromzelllinie

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