Name: Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie neuronales Gewebe über 24 Stunden für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung vital halten. Diese Methode mit dem Braincubator reduziert Tierzahlen und maximiert die Datenerfassung.

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Wir danken Colin Symons und James Wright für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch einen Seed Funding Grant (WSU) an Y.B. und das Innovationsbüro der Western Sydney University unterstützt. M.C. wird durch das ARC-Stipendium (DECRA) unterstützt.

Das Protokoll unten beschreibt die Herstellung von C57BL / 6 und C3H / He (retinally degeneriert) Maus neuronalem Gewebe, aber ähnliche Techniken können auf andere Arten angewendet werden. Alle Tiere gesund und Umgang mit Standardbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, den freien Zugang zu Futter und Wasser waren, und ohne beabsichtigte Stressreize. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den westlichen Sydney University Animal Care und Ethikkommission und nach der Nutzung von Tieren und Pflegerichtlinien (Animal Research Authority # A9452, # A10396 und # A8967) genehmigt und durchgeführt. 1. Gehirn Scheibe Vorbereitung <ol><li> Anesthetize das Tier durch Inhalation von Isofluran (5%) und enthaupten ein Nagetier Guillotine verwenden. Entfernen Sie schnell das Gehirn, wie zuvor 9 beschrieben und legen Sie sie in eiskalter physiologischer Lösung (aCSF) enthält (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 Dextrose und gesättigt mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; 310 mOsm, pH 7,4). </li><li> Schneiden Sie Hirnschnitten, in der Region von Interesse, 300 &amp; mgr; m dick mit einem vibrierenden Mikrotom. </li><li> Übertragen Scheiben zu einem speziell angefertigten Inkubationssystems , die eng überwacht und steuert pH - Werte (pH 7,2 bis 7,4), Carbogen Strömung und Temperatur wie zuvor 10 beschrieben, 11. </li><li> Eingestellten Anfangskammertemperatur auf 35 ° C für 15 - 30 min, und dann reduzieren langsam auf 15 - 16 ° C , wie in 1C gezeigt. Dann inkubieren Scheiben in Inkubationssystems bis sie benötigt werden, entweder für die Elektrophysiologie oder Bildgebung. HINWEIS: Wenn Scheiben werden für Calcium-Bildgebung verwendet werden, unter Schritte folgen, bevor Gewebe unterhalb RT abgekühlt wird. </li></ol> 2. Retinal Wholemount Vorbereitung und Membrana limitans Removal <ol><li> Bereiten Sie retinalen wholemounts entweder unter normalenLaborlichtverhältnissen oder schwach rot / Infrarot-Licht. </li><li> Euthanize Tier durch Genickbruch und sofort enucleate Augen. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und Ort entweder in Ames Medien oder aCSF enthält (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 Glucose, 0,5 L-Glutamin und sättigen mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; ~ 300 mOsm, pH 7,4) bei RT. </li><li> Entfernen Sie unverzüglich die Hornhaut, Linse und Glaskörper durch entlang der Ora serrata mit einer kleinen Schere schneiden und die Linse und Glaskörper mit einer Pinzette entfernen. Platzieren Gewebe im Inkubationssystem bei RT. HINWEIS: Retinal Gewebe kann in der Augenbecher, nach langsamer Temperaturabsenkung bis 15 gehalten werden - 16 ° C, für&gt; 24 h in Inkubationssystems bis benötigt. </li><li> Um die ILM entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel die Netzhaut zu einem kleinen Glas mit 30 U / ml Papain, 1 mM L-Cystin, 0,5 mM EDTA und 0,005% DNase in Earl&#39;s- enthältBalanced Salt Solution (BSS) bei 37 ° C für 20 min. Anwenden 95% O 2/5% CO 2 in die Lösung durch den Deckel , aber nicht Blase. Wenn Gewebe von jungen Tieren (&lt;6 Wochen) verwenden, verdünnen die Lösung auf halber Stärke. <ol><li> Stoppen enzymatischen Verdau, durch das Gewebe in einer Ovomucoid Plazieren (10 mg / ml) und BSA (10 mg / ml) -Lösung für 10 min in Earl BSS. Wash Gewebe gründlich mit aCSF vor dem Transfer zum Inkubationssystems und reduzieren Temperatur auf 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Pflegen Netzhautgewebe im Auge Schale, bis sie benötigt. Für die Übertragung an das Mikroskop, isolieren die Netzhaut aus dem Auge-Tasse und schneiden in 4 Stücke mit einer Rasierklinge. Wenn die gesamte Netzhaut erforderlich ist, machen vier kleine Schnitte in der Peripherie der Netzhaut, es zu ermöglichen, flach zu liegen. HINWEIS: Für die Bildgebung Experimente, Belastung mit Calcium-Farbstoffe vor dem Transfer zum Inkubationssystems, siehe unten. </li></ol> 3. Erhaltung von Gewebe im Inkubator <ol><li&gt; Platz Gewebe in der Hauptkammer Sonden für pH und Temperaturmessungen (1A, B) enthält. </li><li> Zirkulieren aCSF durch eine zweite Kammer (UVC Kammer, aufgebaut wie zuvor 12 beschrieben) , isoliert aus der Hauptkammer und ausgesetzt zu 1,1 W UVC - Licht (254 nm, 5W / 2P Sterilisator UV - Lampe), um Bakterien zu eradiate in der Lösung schwebenden (Abbildung 1A). Steuer UVC Licht Timing über einen programmierbaren Zeitgeber ein zufälliges-Funktion, die zu Zeiten schaltet variierend zwischen 15 und 26 min alle 15 - 30 min eine übermäßige Erwärmung des aCSF zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer UVC bis 12 mL / min , wie zuvor berichtet , 12. Decken Sie die UVC-Kammer mit Aluminiumfolie zu UVC Beleuchtung außerhalb der Kammer zu verhindern, die das neuronale Gewebe schädigen können. HINWEIS: Für die dunkeladaptierten Netzhautgewebe, tragen Sie eine maßgeschneiderte Abdeckung mit der Hauptkammer Licht auszuschließen. </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe zu Circulate die Lösung (aCSF) durch die beiden Kammern und eine Platte thermo kalten Peltier-Kühler entweder kühlen oder die Hauptkammer im Bereich von 0 bis die gewünschten Temperaturen erhitzen - 50 ° C. Für eine optimale Gewebe Inkubation verwenden 15 - 16 ° C für die langfristige Rentabilität. </li></ol> 4. Calcium Farbstoffbeladung <ol><li> Wählen Calcium Farbstoffe basierend auf der Präferenz des einzelnen Forscher. Hier verwenden wir Fura-02.00, Fluo-08.00 Uhr oder Fluo-04.00. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Farbstoffe verwendet werden wie auch: Man löst Calcium Farbstoffe in DMSO auf eine 1 mM - Lösung und 1% Blockcopolymere (beispielsweise Pluronsäure-127) bis zu einem Endvolumen von 50 ul und beschallen für 10 min. </li><li> Hinzufügen Lösung aCSF bis zu einer Endkonzentration von 10 uM, 0,01% Blockcopolymere für Hirnschnitten und 20 uM (Netzhaut), 0,02% Blockcopolymere für die Netzhaut. In Retinae (Papain behandelt) und Hirnschnitten von jungen Tieren, Last auf das Bad für 45 min bei 37 ° C (Fura-2 AM) oder bei RT (Fluo-04.00; Fluo-08.00 Uhr). <ol><li> Für erwachsene Tiere, (&gt; 12 Wochen) pipettieren die Farbstoffe (50 ul) direkt auf die Hirnschnitten und pflegen 75 min eine bessere Durchdringung des Farbstoffs in die tiefen Schichten zu ermöglichen. </li><li> Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des untergetauchten Scheibe während der Farbstoff Inkubation sicherzustellen, bereiten eine Glasladeraum mit einem geschlossenen Deckel (Kreis Glas mit einem Durchmesser von 2,5 cm, 3,5 cm Höhe) mit Calcium-Farbstoffe, verdünnt in 2,5 ml aCSF. Oxygenat kontinuierlich mit 95% O 2/5% CO 2. Nicht Blase. </li></ol></li><li> Nach Farbstoffbeladung, waschen Sie die Gewebe mit aCSF und Transfer zum Inkubationssystems, reduzieren die Temperatur langsam auf 15 - 16 ° C bis zum experimentellen Einsatz. </li></ol> 5. Recordings und Imaging Elektrophysiologische <ol><li> Platzieren Gewebe in einem untergetauchten Aufnahmekammer unter einem Mikroskop und perfundieren mit oxygeniertem aCSF mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 - 5 ml / min entweder bei RT (~ 22 ° C) oder physiologischer Temperatur (~ 35 ° C). Hold das Gewebe an Ort und Stelle durch Verwendung eines benutzerdefinierten gemacht &#39;&#39; Harfe &#39;&#39;, aus Nylon oder Goldfäden gestreckt und über ein U-förmiges Stück Gold oder Platindraht geklebt. </li><li> Für die Elektrophysiologie: <ol><li> Bereiten Sie Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilicatglas mit einer Mikro Abzieher mit einem Endwiderstand von 5-6 MOhm zu erreichen. </li><li> Füllen Sie die Pipette mit 3 bis 4 &amp; mgr; l der internen Lösung wie zuvor 13 beschrieben und zu visualisieren Zellen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast (IR-DIC) mit einer CCD - Kamera. Die intrazelluläre Lösung sollte sorgfältig jedem Experiment zugeschnitten werden experimentelle Ergebnisse zu erzielen. </li><li> Position Pipette, während positive Druck aufrechterhalten wird aufgebracht durch eine Ansaugöffnung auf der Pipettenhalter an der Membran einer Zelle eines Mikromanipulators verwenden. Da die ILM von der Netzhaut entfernt wurde, keine vorherige Membran Abschaben erforderlich ist. Sobald die Pipette auf die Zelle ist, gelten sanft negativDruck auf die Pipette eine Gigaohm Dichtung zu erreichen. Dann reißt die Zellmembran mit einer kurzen Menge von Unterdruck. </li><li> Machen Sie mit ganzen Zellen Strom- oder Spannungs-Clamp Messungen mit Standardtechniken als angemessen. </li></ol></li><li> Calcium-Bildgebung: <ol><li> Für ratiometrisch Bildgebung von Fura-2, eine Ultrahochgeschwindigkeits-Wellenlängenumschalter verwenden, um Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm bereitzustellen. Passieren emittierte Licht von einzelnen Zellen durch ein Emissionsfilter von 510 ± 20 nm, und erfassen mit einer hohen Empfindlichkeit, Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera. </li><li> Für einen einzelnen Anregungswellenlänge von Fluo-4, Filteranregungslicht durch einen 460-490 nm Bandpassfilter und emittiert Licht durch eine 515-550 nm Bandpassfilter. Für die schnellste und empfindlichste Aufnahme eine so hohe Geschwindigkeit Digitalkamera verwenden. Erwerben Sie Bilder nach Bedarf. </li><li> Messung der Veränderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit entweder bei einer einzigen Wellenlänge (Fluo-4) oder der Wellenlängen-Verhältnis unter Verwendung vonVerfahren (Fura-2), wie zuvor beschrieben , 8, 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Yossi Buskila und Paul Breen erklären, dass sie Miteigentümer von PAYO Scientific Pty Ltd sind, einem Unternehmen, das sich auf den Bau von Inkubationssystemen für akutes Nervengewebe spezialisiert hat. Alle anderen Autoren berichten von keinen finanziellen Interessen oder potenziellen Interessenkonflikten im Zusammenhang mit der aktuellen Studie.

Dieser Artikel beschreibt eine Inkubation Methode, um die Lebensfähigkeit von akuten neuronalen Gewebe für die Bildgebung und elektrophysiologischen Experimenten zu verlängern, wodurch die Anzahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen. Zwei Hauptprozesse regeln die Verschlechterung der neuronalen Gewebe im Laufe der Zeit: i) erhöhte Keimbelastung und die damit einhergehende Erhöhung der bakterielles Endotoxin freigesetzt, und ii) Exzitotoxizität , die das traumatische Slicing Verfahr...

Elektrophysiologie und funktionelle Bildgebung (Calcium, spannungsempfindliche Farbstoffe) sind zwei der am häufigsten verwendeten experimentellen Techniken in den Neurowissenschaften. Hirnschnittpräparaten und retinale Wholemount, die hier untersucht werden, ein Mittel zur Prüfung der elektrophysiologischen Eigenschaften und synaptischer Verbindungen ohne Kontamination von Anästhetika oder Muskelrelaxantien. Hirnschnitte und Retina - Wholemount ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, im Gegensatz zu Kulturen oder Zellhomogenisate, so dass die Untersuchung spezifischer Schaltungen und Gehirn Netzwerke 1. Aufnahmen von isolierten Gewebe haben Vorteile gegenüber in vivo Aufnahmen als Bewegungen mit dem Herzschlag und Atmung verbunden sind eliminiert. Darüber hinaus ermöglicht die direkte Visualisierung bestimmte Klassen von Zellen 2, 3 gezielte und lokale Anwendung von pharmakologischen Werkzeugen werden. Patch-Clamp-Aufnahmen und Calcium Farbstoffbeladung in retinalen Wholemount wird durch die Existenz der inneren Grenzmembran (ILM), die deckt die retinalen Ganglienzellen (RGC) Schicht kompliziert und direkten Zugang zu den Zellen verhindert. Typischerweise wird diese Membran mit einer Glaspipette abgeschabt direkte Anwendung eines Patch-Pipette und die Bildung eines Gigaohm Dichtung an einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Darüber hinaus Bade angewendet Kalzium Farbstoffe nicht kreuzen die ILM und müssen entweder unter dieser Membran 4, retrograden Transport nach der Injektion an den Sehnerv 5 oder durch Elektroporation durch das Gewebe 6 injiziert werden. Wenn darüber hinaus ein Nagetiermodell von Retinitis pigmentosa verwendet wird , die rd / rd Maus, ist die ILM dicker und undurchdringlich. Hier verwenden wir eine Technik , um die ILM mit enzymatischen Aufschluss 7 zu entfernen , sowohl allgegenwärtige Calcium - Farbstoff-Beladung und den direkten Zugang zu retinalen Ganglionzellen für Patch-Clamp - recordi zu ermöglichenNGS 8. Erfolgreiche Aufnahmen von beiden Hirnschnitten oder retinalen Wholemount hängen von Präparation und Inkubation von lebenden Nervengewebe. Typischerweise wird Gewebe am Morgen des Experiments entnommen und in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) inkubiert, bis sie für die Aufnahmen verwendet wird. Normalerweise bleibt Gewebe lebensfähig für 6 - 8 h, mit signifikanten Abbau nach diesem Zeitfenster. beide Gehirnscheiben und Präparate jedoch in der Regel Wholemount retinae produzieren mehr Gewebe als kann innerhalb dieser kurzen Zeitspanne aufgezeichnet werden. Folglich wird Gewebe oft am Ende des Tages verworfen und die Präparation wird wieder an den nachfolgenden Tagen abgeschlossen. Das bedeutet, ein anderes Tier wird verwendet, und ~ 2 h Setup und Dissektion / Färbung wiederholt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer von neuronalem Gewebe für mehr als 24 h, was bedeutet weniger Tiere verwendet werden, und Versuchszeit zur Verfügung steht. Gewebeviabilität wwie beurteilt durch elektrophysiologischen Eigenschaften der Aufnahme und Kalziumdynamik, und diese Eigenschaften waren nicht zu unterscheiden zwischen &lt;4 h und&gt; 24 h postdissection. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur einzelne Zelleigenschaften intakt und funktionsfähig nach längerer Inkubation, aber Netzwerk-Aktivität, wie durch Calcium-Bildgebung und elektrophysiologischen Ableitungen beurteilt, ist unverändert&gt; 24 h postdissection. Darüber hinaus zeigen wir, dass Calcium Farbstoffe in Zellen über einen längeren Zeitraum, ohne dass irgendwelche nachteiligen Effekte bleiben kann. Anwendung dieses Protokolls veranschaulicht, dass die funktionelle Aktivität von Neuronen in akuten neuronalen Gewebe können für lange Zeiträume aufrechterhalten werden, sobald die äußere Umgebung stark reguliert ist. Außerdem ist, wie die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund unterschiedlicher Inkubationsprotokolle stark zwischen den Labors variiert, stellt dieses Verfahren einen Goldstandard für die idealen Parameter, die Variabilität in der Gesundheit der akuten neu zu reduzieren angewendet werden sollteronal Gewebe.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glukamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissoziationssystem</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimethylsulfoxid wasserfrei</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Geringe UV-Absorption*</td><td>Life Technologies</td><td>P-6867</td><td>20%ige Lösung in DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom mit vibrierender Klinge&nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>mit Leica ausgestattet s Vibrocheck&trade; Messgerät&nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibrationstisch</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Festtischmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektiv</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop Objektiv</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Wellenlängenumschalter</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; System</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td> Flammen-<td>/Brauner Mikropipettenabzieher</td></tr><tr><td>Aufnahme-/Perfusionskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Offene Badkammern mit niedrigem Profil</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelektrischer Kühler</td> TE <td>Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

längerer inkubation von akute neuronales gewebe für elektrophysiologie und calcium-bildgebung

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8 Stunden nach der Präparation - neuronaler Gewebepräparate Akut, Hirnschnitten und Retina-Wholemount, können in der Regel nur für 6 gehalten werden. Dies begrenzt die Versuchszeit und erhöht die Anzahl der Tiere, die pro Studie verwendet werden. Diese Einschränkung speziell Auswirkungen Protokolle wie Kalzium-Imaging, die verlängerte Vorinkubation erfordern mit Bad aufgetragen Farbstoffe. Exponential Bakterienwachstum in 3 - 4 h nach dem Schneiden ist eng mit einer Abnahme der Gewebegesundheit korreliert. Diese Studie beschreibt ein Verfahren für die Vermehrung von Bakterien in acute Zubereitungen Begrenzung für längere Zeiträume (&gt; 24 h) ohne die Notwendigkeit von Antibiotika, sterile Verfahren oder Gewebekulturmedien, enthaltend Wachstumsfaktoren tragfähige neuronalem Gewebe zu halten. Durch Radfahren Kammer die extrazelluläre Flüssigkeit durch UV-Bestrahlung und halten das Gewebe in einem benutzerdefinierten Halte bei 15 - 16 ° C, zeigt das Gewebe keinen Unterschied in der elektrophysiologischen Eigenschaften, oder Calcium-signaling durch intrazelluläres Calcium Farbstoffe bei&gt; 24 h postdissection. Diese Methoden werden nicht nur verlängern experimentelle Zeit für diejenigen, mit akuten neuronalen Gewebe, sondern die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen, und wird eine Goldstandard für die akute neuronale Gewebe Inkubation gesetzt.

Strenge Regulierung der Bakterienlast und der Temperatur der aCSF während der Inkubation ist wesentlich neuronalem Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. 16 ° C (Abbildung 1) - dies kann mit UVC - Licht und Aufrechterhalten der Temperatur des aCSF bei 15 durch Bestrahlung optimiert werden. Des Weiteren Parameter der aCSF Stempel (APS; 1C) stellt die Experimentator mit einem Rekord von den Umgebungsbedingungen (pH - Wert und Temperatur.), So dass ein Goldsta...

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, neuronales Gewebe über längere Zeiträume hinweg ohne nennenswerte Gewebedegeneration zu erhalten. Mithilfe dieser Methode können elektrophysiologische Ableitungen und Calcium-Bildgebung mehr als 24 Stunden nach der Gewebeentnahme durchgeführt werden. Diese Methode wird die Lebensfähigkeit akut entnommenen neuronalen Gewebes erheblich verbessern und deren Vitalität über mehr als 24 Stunden aufrechterhalten, wodurch ein neuer Goldstandard für die Inkubation akuten Gewebes gesetzt wird.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Versuchszeit, in der das Gewebe verwendet werden kann, signifikant verlängert wird. Dies reduziert die Anzahl benötigter Tiere und maximiert die Menge an Daten, die aus jedem Experiment gewonnen werden können. Der Braincubator ist ein automatisiertes System, das die Gewebetemperatur aufrechterhält und die bakterielle Vermehrung in der extrazellulären Flüssigkeit verhindert.Dies bietet ein streng kontrolliertes Umfeld für das Gewebe. Diese Prozedur wird Orsolya Kekesi und Alba Bellot-Saez, Doktoranden aus meinem Labor, demonstrieren. Für die Herstellung von Gehirnschnitten bereiten Sie 300 Mikrometer dicke Gehirnschnitte, die den Bereich von Interesse enthalten, mit einem Vibratom vor.Überführen Sie die Schnitte dann in ein selbstgebautes Inkubationssystem mit kontrolliertem Carbogenfluss, pH-Wert und Temperatur. Stellen Sie die Anfangstemperatur der Kammer auf 35 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten ein und senken Sie sie anschließend langsam auf 15 Grad Celsius ab. Inkubieren Sie die Schnitte danach im Inkubationssystem, bis Aufnahmen mittels Elektrophysiologie oder Bildgebung erfolgen.Entnehmen Sie für die Herstellung von Netzhaut-Präparaten sofort nach der Enukleation die Augen eines euthanasierten Tieres. Führen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata durch und legen Sie die Augen entweder in Ames'-Medium oder aCSF mit Carbogen-Zufuhr bei Raumtemperatur. Entfernen Sie danach umgehend die Hornhaut, Linse und Glaskörper, indem Sie entlang der Ora serrata mit einer kleinen Schere schneiden, und heben Sie diese mit einer Pinzette ab.Platzieren Sie das Gewebe im Inkubationssystem bei Raumtemperatur. Um die innere Begrenzungsmembran zu entfernen, überführen Sie die Augenschale mit der Retina in ein kleines Glasgefäß, das Papain, L-Cystein, EDTA und DNase bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten enthält. Leiten Sie Carbogen über den Deckel in die Lösung, lassen Sie es jedoch nicht aufsteigen.Beenden Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang in eine Ovomukkoïd- und BSA-Lösung in Earle's BSS geben. Anschließend waschen Sie das Gewebe gründlich mit aCSF. Überführen Sie danach das Gewebe in das Inkubationssystem und senken Sie die Temperatur auf etwa 15 bis 16 Grad Celsius. Anschließend das Netzhautgewebe auf das Mikroskop übertragen. Die Netzhaut vom Augenbecher lösen und mit einer Rasierklinge in vier Stücke schneiden. Falls die gesamte Netzhaut benötigt wird, vier kleine Einschnitte am Rand der Netzhaut vornehmen, damit sie flach liegen kann.Dieses Gewebe kann nun zur Elektrophysiologie auf das Mikroskop übertragen oder im Braincubator belassen werden. Das Gewebe wird in der Hauptkammer aufbewahrt, die die Sonden zur Messung von pH und Temperatur enthält. Eine zweite Kammer ist von der Hauptkammer abgetrennt und einer UVC-Strahlung von 1,1 Watt ausgesetzt, um Bakterien, die in der Lösung schweben, zu bestrahlen.Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um aCSF durch die beiden Kammern zu zirkulieren, und eine Peltier-Thermoelektrische-Kühlplatte, um die Hauptkammer zu kühlen oder zu erwärmen. Lösen Sie in diesem Verfahren ein Calcium-Farbstoff in DMSO, um eine einmillimolare Lösung herzustellen. Geben Sie 1 % Pluronic-Säure F-127 zu der Mischung hinzu, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen.Anschließend 10 Minuten lang beschallen. Bereiten Sie eine Glas-Ladekammer mit Calcium-Farbstoff vor, der in 2,5 Milliliter aCSF verdünnt ist, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar für Hirnschnitte und 20 Mikromolar für die Netzhaut zu erreichen. Für Netzhaut- und Hirnschnitte junger Tiere inkubieren Sie die Probe 45 Minuten lang im Bad.Bei erwachsenen Tieren 25 Mikroliter Farbstoff direkt auf das Gehirnschnittpräparat pipettieren und 75 Minuten einwirken lassen, um eine bessere Penetration des Farbstoffs in die tieferen Schichten zu ermöglichen. Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des untergetauchten Gewebes während der Farbstoff-Inkubation sicherzustellen, sollte dieses kontinuierlich über den Deckel mit Carbogen versorgt, jedoch nicht durchgebubbelt werden. Nach der Farbstoffbeladung das Gewebe mit aCSF waschen und in das Inkubationssystem überführen.Verringern Sie die Temperatur langsam auf etwa 15 bis 16 Grad Celsius, bis die Probe verwendet wird. Für die Aufzeichnung bringen Sie das Gewebe in eine untergetauchte Ableitungskammer unter dem Mikroskop und perfundieren es mit mit Sauerstoff angereichertem aCSF mit einer Flussrate von vier bis fünf Millilitern pro Minute. Halten Sie das Gewebe mit einer speziell angefertigten Harke fest.Bereiten Sie anschließend einige Aufnahmepipetten mit einem Mikropipettenzug vor, um einen Endwiderstand von fünf bis sechs Megaohm zu erreichen. Füllen Sie eine Pipette mit drei bis vier Mikrolitern intrazellulärer Lösung und stellen Sie diese anschließend auf Eis. Visualisieren Sie dann die Zellen mit einer CCD-Kamera unter IR-DIC.Positionieren Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator auf der Zellmembran. Halten Sie einen positiven Druck über eine Saugöffnung am Pipettenhalter aufrecht. Sobald sich die Pipette auf der Zelle befindet, leiten Sie einen sanften negativen Druck an die Pipette, um eine Gigaohm-Dichtung zu erzielen.Danach die Zellmembran durch kurzen negativen Druck aufbrechen. Anschließend die Aufzeichnung des Gesamtzellstroms oder die Spannungsclamp-Aufzeichnung beginnen. Für die ratiometrische Abbildung mit Fura-2 einen extrem schnellen Wellenlängenschalter verwenden, um Anregungs-Wellenlängen von 340 Nanometern und 380 Nanometern bereitzustellen.Nehmen Sie dann das emittierte Licht mithilfe eines Emissionsfilters mit einer hochsensitiven, schnellen Digitalkamera auf. Verwenden Sie für eine einzelne Anregewellenlänge von Fluo-4 einen Bandpassfilter von 460 bis 490 Nanometer zur Filterung des Anregungslichts und einen Bandpassfilter von 515 bis 550 Nanometer zur Filterung des emittierten Lichts. Nach der Verdauung können retinale Ganglienzellen und verlagerte amakrine Zellen unter DIC-Beleuchtung deutlich visualisiert und für Patch-Clamp-Aufzeichnungen gezielt angesteuert werden, ohne dass zuvor die innere Begrenzungsmembran abgeschabt werden muss.Hier sind repräsentative Strom-Klemm-Aufnahmen von einer retinalen Ganglienzelle dargestellt. Eine Depolarisation der Zelle über die Patch-Pipette führte zu einer dosisabhängigen Generierung von Aktionspotentialen, was die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Behandlung mit Papain anzeigt. Das Entfernen der inneren Begrenzungsmembran ermöglichte zudem eine ubiquitäre Färbung der Ganglienzellschicht mit Fura-2 AM. Die Zellen reagierten auf die Applikation von 30 Millimolar Kaliumchlorid mit einem starken Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, wie durch einen Anstieg des Verhältnisses von 342 zu 380 Nanometer im Vergleich zu F0 belegt. Nach der Kaliumchlorid-Applikation kehrten die Kalziumspiegel nach der Stimulation wieder auf den Ausgangswert zurück.Und die Zellen konnten anschließend erneut stimuliert werden, um eine Antwort mit ähnlicher Amplitude zu erzeugen. Außerdem waren diese Antworten nicht unterscheidbar zwischen Netzhäuten, die weniger als vier Stunden und mehr als 24 Stunden nach der Dissektion aufgezeichnet wurden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass akutes neuronales Gewebe gegenüber Umwelteinflüssen ungeschützt ist.Daher ist eine strenge Regulierung von aCSF durch eine genaue Überwachung von pH-Wert, Temperatur und Bakteriengehalt entscheidend, um die zelluläre Aktivität und die Netzwerkintegrität aufrechtzuerhalten. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um neuronales Gewebe über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden zu erhalten, ohne dass aseptische Techniken oder Kulturmedien mit Wachstumsfaktoren oder Antibiotika, die die Physiologie beeinflussen könnten, erforderlich sind. Wir hoffen, dass diese Methode den Goldstandard für die idealen Parameter zur Maximierung der Gewebeviabilität setzen wird.Dies verringert die Variabilität im Gesundheitszustand des Gewebes selbst und reduziert anschließend die experimentelle Variabilität. Die Verwendung des Papain-Protokolls zum Verdauen der inneren Begrenzungsmembran der Netzhaut ermöglicht eine ubiquitäre Färbung mit Kalziumfarbstoffen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um multistabile intrazelluläre Ableitungen von Neuronen der Ganglienzellschicht zu erhalten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebensfähiges Gewebe über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden für bildgebende Verfahren und elektrophysiologische Experimente erhalten werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie der Gebrauch von Schutzbrillen sollten stets getroffen werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Neurowissenschaften

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Dieses Video demonstriert eine Technik zur Messung der neuronalen Aktivität in Gehirnschnitten von Mäusen mit Hilfe von Kalzium-Bildgebung und elektrophysiologischen Aufzeichnungen. Durch die Perfusion des Gewebes mit Kaliumionen und die Aufzeichnung intrazellulärer Kalziumveränderungen durch digitale Hochgeschwindigkeitsbildgebung zeigt diese Methode neuronale Reaktionen in Echtzeit.

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Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

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Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

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Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

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Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

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