Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine zuverlässige präeinbettende Immunfärbung von nicht-primatem Gehirngewebe für die Elektronenmikroskopie zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroanatomie zu beantworten, beispielsweise die synaptische Häufigkeit einer bestimmten Innervation in einer genau definierten Hirnstruktur. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und kostengünstige Methode zur Markierung spezifischer Innervationen darstellt, die für die Elektronenmikroskopie geeignet sind.

Beginnen Sie damit, 50 µm dicke Schnitte aus mit Acrolein fixiertem nichtmenschlichem Primatengehirn, die den Bereich von Interesse enthalten, in eine 12-Loch-Platte mit PBS zu überführen. Waschen Sie die frei schwimmenden Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS, anschließend inkubieren Sie die Schnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter Natriumborhydrid-Lösung. Schütteln Sie vorsichtig, ohne Abdeckung.

Nach Ablauf der 30 Minuten das Natriumborhydrid abpipettieren und PBS in jede Vertiefung geben. Die Platte auf einen Schüttler stellen und 10 Minuten kräftig schütteln. Den Waschschritt zwei weitere Male wiederholen oder solange, bis kein Reaktionsgas mehr vorhanden ist.

Blocken Sie die Schnitte, indem Sie diese eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken in einer Lösung aus 2 % normalem Serum und 0,5 % kaltem Fischgelatine, die in PBS verdünnt ist, inkubieren. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken in der Primärantikörperlösung. Am nächsten Tag, nachdem die Schnitte wie zuvor gewaschen wurden, inkubieren Sie die Schnitte eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken in der Sekundärantikörperlösung.

Nach dem erneuten Waschen der Schnitte inkubieren Sie diese eine Stunde unter Schütteln in Avidin-Biotin-Peroxidase- oder ABC-Lösung. Bereiten Sie anschließend eine frische Lösung aus 0,05 % 3,3'-Diaminobenzidin und 0,005 % Wasserstoffperoxid, verdünnt in TBS, frisch zu. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Schnitte drei bis sieben Minuten unter sanftem Schütteln in der DAB-Lösung.

Sobald sich das braune Präzipitat in der gewünschten Farbe entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Probe zweimal schnell mit kaltem TBS waschen, gefolgt von einer Reihe zeitlich gesteuerter TBS- und PB-Waschungen. Überführen Sie die Platte mit den mit DAB gefärbten Schnitten in die Abzugshaube. Überführen Sie die Schnitte in eine 6-Well-Platte, die mit PB gefüllt ist, und glätten Sie die Schnitte vollständig, indem Sie das PB vorsichtig abpipettieren. Geben Sie dann die Osmiumtetroxidlösung tropfenweise hinzu, um die ebenen Schnitte nicht zu stören.

Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um die Schnitte vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Während der Osmierung bereiten Sie einen wasserabweisenden Epoxidharz durch Zugabe geeigneter Mengen jeder Komponente der Epoxidharzmischung zu einem großen Plastikbecher vor. Rühren Sie mit einem Holzstäbchen oder einer Plastikpipette, bis eine homogene braune Farbe erreicht ist, dann geben Sie gleiche Mengen Harz in Aluminiumbecher passender Größe für die Anzahl der zu verarbeitenden Schnitte und lassen Sie es ruhen.

Nach Ablauf der Osmierung waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in PB mit langsamer Schüttelbewegung. Nach dem Waschen dehydrieren Sie die Schnitte in der folgenden Reihe von gestaffeltem Ethanol jeweils zwei Minuten lang. Danach überführen Sie die Schnitte in Glasgefäße, die mit Propylenoxid gefüllt sind, und inkubieren sie dreimal für jeweils zwei Minuten in Propylenoxid, um den Dehydrierungsprozess abzuschließen.

Überführen Sie die Schnitte anschließend vorsichtig einzeln in die Aluminiumtäfelchen und vermeiden Sie dabei möglichst jeden Kontakt mit Luft. Betten Sie die Schnitte flach in zuvor gemischtes wasserabweisendes Epoxidharz ein und inkubieren Sie sie über Nacht unter der Abzugshaube bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag beschichten Sie Glasobjektträger und Plastikdeckgläser mit Mineralöl und erweichen Sie das Harz, indem Sie die Aluminiumtäfelchen maximal 12 bis 15 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren.

Glätten Sie die Schnitte vorsichtig auf der gefetteten Seite des Objektträgers. Legen Sie den gefetteten Deckglaser auf und drücken Sie vorsichtig die restliche Luft heraus. Inkubieren Sie die Objektträger 48 Stunden bei 60 Grad Celsius.

Nach 48 Stunden entfernen Sie die Plastikabdeckung, sodass der Schnitt in Harz eingeschlossen bleibt. Suchen Sie mithilfe eines Binokulars zunächst den Bereich von Interesse und schneiden Sie dann mit einem Skalpell ein kleines, etwa ein Quadratmillimeter großes, viereckiges Gewebestück heraus. Danach schleifen Sie die Spitze eines Harzblocks an und kleben das viereckige Gewebestück darauf fest.

Nach dem Trocknen das Harzblock in der vertikalen Position auf dem Tisch des Ultramikrotoms platzieren und mit einer scharfen Rasierklinge allmählich jede Seite des Harzblocks abschneiden, um ein Trapez mit glatten Seiten zu formen. Danach den Tisch in die horizontale Position bringen und das Block drehen, bis die längste Seite des Trapezes nach unten zeigt. Ein Diamantschneidwerkzeug oder ein Glasmesser im dafür vorgesehenen Bereich platzieren.

Stellen Sie das Ultramikrotom so ein, dass es 300 Mikrometer dicke Schnitte mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde schneidet. Justieren Sie das Messer, sodass es vertikal parallel zum quadratischen Stück steht und einen sehr kleinen horizontalen Winkel von etwa einem Grad aufweist, und schneiden Sie die Oberfläche des quadratischen Stücks so lange ab, bis das Gewebe sichtbar wird. Wechseln Sie nun zu einem ultra 45-Grad-Diamantmesser, das mit einem Boot, gefüllt mit destilliertem Wasser, ausgestattet ist, um 80 Mikrometer dicke Schnitte anzufertigen.

Glättet die Schnitte, indem Sie sie mit einem in Xylol getränkten Absorptionspapier überstreichen, ohne die Wasseroberfläche zu berühren, und sammeln Sie die Serienschnitte auf unbeschichteten Kupfergittern mit 150 Mesh. Legen Sie die Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox, stellen Sie anschließend eine 1:1-Lösung aus der Zitratblei-Stammlösung und destilliertem Wasser her und filtrieren Sie diese durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Decken Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie ab, um es vor Licht zu schützen.

Platzieren Sie jedes Gitter auf einen Tropfen der verdünnten Zitratlösung, sodass der Schnitt mit der Lösung in Kontakt kommt. Halten Sie das Gitter anschließend mit einer kleinen Pinzette fest und spülen Sie es gründlich in zwei Bechern mit destilliertem Wasser ab. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit absorbierendem Papier und legen Sie die Gitter in eine Gitterbox. Nach 30 Minuten können die Schnitte mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht werden.

Dieses Elektronenmikroskopbild des internen Globus pallidus des Seidenäffchens zeigt gut erhaltene Präparate nach transkardialer Perfusionsfixierung mit Acrolein-Parafomaldehyd im Rahmen der Immunperoxidase-Diaminobenzidin-Technik. Wie dort zu sehen ist, ermöglicht das Verfahren die Darstellung der Myelinscheide eines großen Axons, die durch den Pfeil markiert ist. Dieses Elektronenmikroskopbild des externen Globus pallidus zeigt dendritische Profile, gekennzeichnet durch den Buchstaben d, kleine unmyelinierte Axone, gekennzeichnet durch a, sowie axonale Varikositäten, markiert mit av, die leicht identifiziert werden können.

Die Pfeile zeigen ein Beispiel einer Axonvarikosität, die einen symmetrischen synaptischen Kontakt mit dem dendritischen Profil eingeht. Immunmarkierte Elemente können leicht anhand ihres Zytoplasmas oder Axoplasmas identifiziert werden, das mit elektronendichtem DAB-Präzipitat gefüllt ist. Hier erhält ein dendritisches Element, das im Gpi für Cholinacetyltransferase immungefärbt ist, einen synaptischen Kontakt von einer nicht markierten Axonvarikosität.

Dieses Elektronenmikroskopbild zeigt ein myelinisiertes Axon im GPe mit einer relativ intakten Myelinscheide, deren Axoplasma für Tyrosinhydroxylase immunmarkiert ist. Dieses Beispiel zeigt eine Axonvarikosität im GPi, die für Serotonintransporter immunmarkiert ist und einen symmetrischen synaptischen Kontakt mit einem Dendriten eingeht. In diesem Beispiel begrenzt das DAB-Präzipitat die Plasmamembran und die äußere Oberfläche der Organellen.

Die hier gezeigte Axonvarikosität wurde im GPe beobachtet und für Tyrosinhydroxylase immunmarkiert. Dies stellt ein Beispiel für ein DAB-Präzipitat dar, das das Axoplasma vollständig ausfüllt, wobei synaptische Vesikel sichtbar, aber schwerer abgrenzbar sind. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die vorab-Einbettung durchgeführte doppelte Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Kolokalisation von Proteinen oder Rezeptoren auf synaptischer Ebene.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die präeinbettende Immunhistochemie von nicht-primatem Hirngewebe vorbereitet, die Einbettung in Epoxidharz durchführt und den Bereich von Interesse in 80 Mikrometer dicke Schnitte für die Elektronenmikroskopie ultramikrotomiert.