Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine zuverlässige Immunfärbung vor der Einbettung von Nicht-Primaten-Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie zu erhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroanatomie zu beantworten, wie z.B. die synaptische Inzidenz einer gegebenen Innervation in einer präzisen Gehirnstruktur. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es eine einfache und kostengünstige Methode ist, spezifische Innervationen zu markieren, die für die Elektronenmikroskopie geeignet sind.

Beginnen Sie mit der Übertragung von 50 Mikrometer dicken Abschnitten des Acrolein-fixierten Gehirns nicht-menschlicher Primaten, die die interessierende Region enthalten, auf eine 12-Well-Platte, die PBS enthält. Waschen Sie die frei schwimmenden Abschnitte dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS und inkubieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter Natriumborhydridlösung. Sanft schaukeln ohne Abdeckung.

Sobald die 30 Minuten abgelaufen sind, aspirieren Sie das Natriumborhydrid und fügen Sie PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Den Teller auf eine Wippe legen und 10 Minuten kräftig schütteln. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal oder bis kein Reaktionsgas mehr übrig ist.

Blockieren Sie die Schnitte, indem Sie in einer Lösung aus 2 % normalem Serum und 0,5 % kalter Fischgelatine, verdünnt in PBS, eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Abschnitte in Primärantikörperlösung unter leichtem Schaukeln über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag, nachdem Sie die Schnitte wie zuvor gewaschen haben, inkubieren Sie die Schnitte in Sekundärantikörperlösung für eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln.

Nach dem Waschen der Schnitte wie zuvor eine Stunde lang in Avidin-Biotin-Peroxidase oder ABC-Lösung unter Schaukeln inkubieren. Bereiten Sie anschließend eine frische Lösung aus 0,05 %3, 3'Diaminobenzidin mit 0,005 % Wasserstoffperoxid in TBS verdünnt vor. Nach dem Waschen die Abschnitte drei bis sieben Minuten lang in der DAB-Lösung unter leichtem Schaukeln inkubieren.

Sobald sich der braune Niederschlag zu der gewünschten Farbe entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie ihn schnell zweimal in kalter TBS waschen und dann eine Reihe von zeitgesteuerten TBS- und PB-Wäschen durchführen. Übertragen Sie die Platte mit den DAB-fleckigen Abschnitten in die Dunstabzugshaube. Übertragen Sie die Schnitte in eine mit PB gefüllte Sechs-Well-Platte und glätten Sie die Schnitte vollständig, indem Sie das PB vorsichtig aus der Platte pipettieren, und fügen Sie dann Tropfen für Tropfen Osmiumtetroxidlösung hinzu, um eine Störung der abgeflachten Abschnitte zu vermeiden.

Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um die Abschnitte vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Bereiten Sie während der Osmifizierung wasserabweisendes Epoxidharz vor, indem Sie von jeder Komponente der Epoxidharzmischung entsprechende Mengen in einen großen Plastikbecher geben. Rühren Sie mit einem Holzstäbchen oder einer Plastikpipette um, bis eine homogene braune Farbe erreicht ist, geben Sie dann die gleichen Mengen Harz in Aluminiumbecher, die für die Anzahl der zu verarbeitenden Abschnitte geeignet sind, und lassen Sie es ruhen.

Nach Ablauf der Osmifikationszeit die Abschnitte dreimal 10 Minuten lang in PB mit langsamem Schaukeln waschen. Nach dem Waschen dehydrieren Sie die Abschnitte in der folgenden Serie von sortiertem Ethanol jeweils zwei Minuten lang. Übertragen Sie anschließend die Abschnitte in mit Propylenoxid gefüllte Glasfläschchen und inkubieren Sie dreimal für jeweils zwei Minuten in Propylenoxid, um den Dehydratisierungsprozess abzuschließen.

Übertragen Sie dann die Abschnitte vorsichtig nacheinander in die Aluminiumbecher und vermeiden Sie den Kontakt mit Luft so weit wie möglich. Betten Sie die Abschnitte flach in zuvor angemischtes wasserabweisendes Epoxidharz ein und brüten Sie sie über Nacht unter der Entlüftungshaube bei Raumtemperatur aus. Am nächsten Tag beschichten Sie Objektträger und Deckgläser aus Kunststoff mit Mineralöl und erweichen das Harz, indem Sie die Aluminiumbecher bei 60 Grad Celsius für maximal 12 bis 15 Minuten inkubieren.

Drücke die Teile auf der gefetteten Seite des Objektträgers vorsichtig flach. Legen Sie den gefetteten Deckslip auf und drücken Sie die restliche Luft vorsichtig heraus. Inkubieren Sie die Objektträger 48 Stunden lang bei 60 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach 48 Stunden den Abdeckschirm aus Kunststoff, und lassen Sie den Bereich mit Harz ummantelt. Beginnen Sie mit einem Fernglas, um den interessierenden Bereich zu lokalisieren, und schneiden Sie dann mit einem Skalpell ein kleines viereckiges Stück Gewebe von etwa einem Milliliter im Quadrat auf. Feilen Sie als Nächstes die Spitze eines Harzblocks und kleben Sie dann das viereckige Gewebestück darauf.

Legen Sie den Harzblock nach dem Trocknen in vertikaler Position in das Ultramikrotom-Deck und schneiden Sie mit einer scharfen Rasierklinge nach und nach jede Seite des Harzblocks so ab, dass ein Trapez mit glatten Seiten entsteht. Bringen Sie dann das Deck in seine horizontale Position und drehen Sie den Block, bis die längste Seite des Trapezes nach unten zeigt. Platzieren Sie ein Diamant-Trimmwerkzeug oder ein Glasmesser an einem dafür vorgesehenen Platz.

Stellen Sie das Ultramikrotom so ein, dass es 300-Mikrometer-Abschnitte mit einem Millimeter pro Sekunde schneidet. Stellen Sie das Messer so ein, dass es vertikal parallel zum viereckigen Stück steht und einen sehr kleinen horizontalen Winkel von etwa einem Grad aufweist, und schneiden Sie die Oberfläche des viereckigen Stücks ab, bis das Gewebe zu erscheinen beginnt. Wechseln Sie jetzt zu einem Ultra-45-Grad-Diamantmesser, das mit einem mit destilliertem Wasser gefüllten Boot ausgestattet ist, um 80 Mikrometer dicke Abschnitte zu schneiden.

Glätten Sie die Abschnitte, indem Sie mit einem Stück absorbierendem Papier, das mit Xylol bestückt ist, darüber gehen, ohne die Wasseroberfläche zu berühren, und sammeln Sie serielle Abschnitte auf blanken 150-Mesh-Kupfergittern. Legen Sie die Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox, bereiten Sie dann eine Eins-zu-Eins-Lösung aus Bleicitrat-Stammlösung und destilliertem Wasser vor und filrieren Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Decken Sie das Fläschchen mit Alufolie ab, um es vor Licht zu schützen.

Legen Sie jedes Gitter auf einen Tropfen der verdünnten Bleicitratlösung, wobei der Abschnitt mit der Lösung in Kontakt kommt. Halten Sie dann das Gitter mit einer kleinen Pinzette fest und spülen Sie es gründlich in zwei Bechergläsern mit destilliertem Wasser aus. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit absorbierendem Papier und legen Sie die Gitter in eine Gitterbox. Nach 30 Minuten können die Schnitte mit dem Transmissionselektronenmikroskop untersucht werden.

Diese elektronenmikroskopische Aufnahme des inneren Globus pallidus des Totenkopfaffen zeigt gut erhaltenes Material nach der transkardialen Perfusion von Acrolein-PFA in der Immunperoxidase-Diaminobenzidin-Technik. Wie dort zu sehen ist, ermöglicht das Verfahren den Blick auf die Myelinscheide eines großen Axons, die durch die Pfeilspitze angedeutet wird. Diese elektronenmikroskopische Aufnahme des äußeren Globus pallidus zeigt die dendritischen Profile, die durch den Buchstaben d gekennzeichnet sind, kleine unmyelinisierte Axone, die mit a gekennzeichnet sind, und Axonvarizen, die mit av gekennzeichnet sind, können leicht identifiziert werden.

Die Pfeile zeigen ein Beispiel für eine Axonvarikosität, die einen symmetrischen synaptischen Kontakt mit dem dendritischen Profil herstellt. Immunmarkierte Elemente können leicht anhand ihres Zytoplasmas oder Axoplasmas identifiziert werden, das mit elektronendichtem DAB-Niederschlag gefüllt ist. Hier erhält ein Dendriten, der im GPi gegen Cholinacetyltransferase immungefärbt ist, einen synaptischen Kontakt von einer unmarkierten Axonvarikosität.

Diese elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt ein myelinisiertes Axon in der GPe mit einer relativ intakten Myelinscheide, deren Axoplasma immunmarkiert für Tyrosinhydroxylase ist. Dieses Beispiel zeigt eine Axonvarikosität im GPi, der immunmarkiert ist für den Serotonintransporter, der einen symmetrischen synaptischen Kontakt mit einem Dendriten herstellt. In diesem Beispiel kleidet der DAB-Niederschlag die Plasmamembran und die äußere Oberfläche von Organellen aus.

Die hier gezeigte Axonvarikosität wurde in der GPe beobachtet und immunmarkiert für Tyrosinhydroxylase. Dies ist ein Beispiel dafür, dass DAB-Niederschlag das Axoplasma vollständig ausfüllt, wobei synaptische Vesikel sichtbar, aber schwieriger abzugrenzen sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Pre-Embedding der doppelten Immunhistochemie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Kolokalisationen von Proteinen oder Rezeptoren auf synaptischer Ebene zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Immunhistochemie vor der Einbettung von Nicht-Primaten-Hirngewebe vorbereiten, mit der Einbettung in Epoxidharz fortfahren und den interessierenden Bereich in 80 Mikrometer dicke Abschnitte schneiden, die für die Elektronenmikroskopie geeignet sind.