Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel
1. November 2017
Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.
Das übergeordnete Ziel dieser Lebendzell-Bildgebungstechnik ist es, zelluläre Prozesse wie die Aufnahme und Verteilung von Chemotherapeutika zu verfolgen, ohne dass eine Fixierung erforderlich ist. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Krebsbereich zu beantworten, wie z.B. wie Chemotherapeutika entweder in freier Form oder in Nanopartikeln verkapselt von Tumorzellen aufgenommen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir lebende Zellen abbilden, wodurch Fixierungsartefakte verhindert und eine dynamische Auswertung in Echtzeit ermöglicht wird.
Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir beobachteten, dass Nanopartikel während der Fixierung zerfielen, was zu einer Fehlinterpretation der Wirkstoffabgabe führte. Um die Bildgebungskammer zusammenzubauen, platzieren Sie ein 25 Millimeter großes Deckglas am unteren Teil der Kammer und schrauben Sie den oberen Teil in den unteren Teil ein. Ziehen Sie das Glas nicht zu fest an, da das Glas zerbrechen kann.
Autoklavieren Sie die gesamte Kammer. Um die Zellen zu plattieren, entfernen Sie die Bildgebungskammer aus dem Sterilisationsbeutel in einem Laminar-Flow-Schrank. Ziehen Sie die Kammer vorsichtig fest und legen Sie sie in eine Petrischale.
Beschichten Sie das Glas der Bildgebungskammer 20 Minuten lang mit einem Milliliter 0,1 Prozent steriler Gelatine bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Nach der Entnahme des Mediums aus den Zellkulturkolben waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und lösen die Zellen mit 0,25 Prozent Trypsin. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedium.
Sammeln Sie dann die Zellen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 1.100 G. Suspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Millilitern Zellkulturmedium. Nachdem Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben gezählt haben, aspirieren Sie die Gelatine und plattieren Sie die Zellen in einer Verdünnung, die eine maximale Abdeckung von 70 Prozent innerhalb von 24 Stunden ermöglicht.
Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang bei fünf Prozent Kohlendioxid und 37 Grad Celsius haften. Führen Sie eine Bewertung der Zellen unter einem Mikroskop auf Konfluenz, zelluläre Morphologie und Kontamination durch. Schalten Sie dann das Konfokalmikroskop, das Leuchtstofflicht und den Computer ein.
Schließen Sie die Linsenheizung an das Objektiv an und stellen Sie sie auf 35 Grad ein. Bereiten Sie die Inkubationseinheit vor, wie im Textprotokoll gezeigt. Stellen Sie die Inkubationseinheit auf den Mikroskoptisch und schließen Sie die ein- und ausströmende Kohlendioxidröhre an.
Öffnen Sie das Kohlendioxid-Hauptventil und schalten Sie den Kohlendioxid-Regler ein. Vergewissern Sie sich, dass der Controller auf fünf Prozent Kohlendioxid eingestellt ist. Die richtigen Zellkultivierungsbedingungen wie Temperatur, CO2, pH-Wert, Luftfeuchtigkeit und Sterilität sind entscheidend für die Langzeitbildgebung von Zellen.
Das muss also für jeden Inkubator richtig getestet werden. Stellen Sie die Tischtemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Lassen Sie die Inkubationseinheit die gewählte Temperatur und den gewählten Kohlendioxidanteil erreichen.
Nehmen Sie die Bildgebungskammer aus dem Kohlendioxid-Hauptinkubator und transportieren Sie die Kammer in einer Petrischale in den Mikroskopieraum. Platzieren Sie die Bildgebungskammer in einer speziell angefertigten Tischhalterung mit 35 Millimetern Durchmesser und verschließen Sie die Kammer mit einem speziell angefertigten Verschlussdeckel. Öffnen Sie die Inkubationseinheit und arbeiten Sie so schnell wie möglich, um ein Abkühlen der Zellen zu verhindern. Ersetzen Sie den roten Fleck durch die Bildgebungskammer und schließen Sie dann das Gerät.
Stellen Sie sicher, dass keine Kabel zwischen Tisch und Mikroskop eingeklemmt sind. Lassen Sie das Gerät 30 Minuten lang akklimatisieren. Öffnen Sie anschließend die Software und schalten Sie den Laser ein.
Erstellen Sie eine neue Datenbank, indem Sie auf der Registerkarte "Datei" auf "Neu" klicken. Benennen und speichern Sie die Datenbank. Legen Sie die Konfiguration fest, indem Sie auf der Registerkarte "Erfassen" auf "Konfigurieren" klicken.
Wählen Sie Kanalmodus und Einzelspur, um ein einzelnes Fluorophor zu bewerten. Wählen Sie "Multi Track" für mehrere Fluorophore. Wählen Sie dann die geeigneten Band-Past-Filter aus, die zum Fluorophor passen.
Wählen Sie den Hellfeldkanal in einer der Spuren aus. Die Abtastung zwischen dem Fluoreszenzsignal der Verbindungen und der Bildqualität ist beeinträchtigt. Überbelichtung, Photobleaching, Signal-Rausch-Verhältnis, die Qualität der Zellen und die zugesetzten Verbindungen sind alles Faktoren, die die Ergebnisse beeinflussen können und ordnungsgemäß getestet werden müssen.
Legen Sie die Scan-Steuerung fest, indem Sie auf der Registerkarte "Erfassen" auf "Scannen" klicken. Klicken Sie dann auf Modus", um die Bildgröße, die Scangeschwindigkeit, die Scanrichtung und den Scandurchschnitt einzustellen. Klicken Sie auf "Kanäle", um die Lochblende, die Verstärkung und den Offset sowie die Laserleistung einzustellen.
Speichern Sie diese Einstellungen, indem Sie auf der Registerkarte "Konfiguration" auf "Konfiguration" klicken, und speichern Sie sie in der Konfigurationsdatenbank. Stellen Sie den Zeitraffer ein, indem Sie auf der Registerkarte "Makro" auf "Muti TimeX" klicken. Klicken Sie auf "Einzelner Ort".
Wenden Sie die gespeicherte Konfiguration an, indem Sie auf "Single Track" klicken und zur gewünschten Konfiguration in der Konfigurationsdatenbank scrollen. Legen Sie das Zeitintervall und die Anzahl der Scans fest. Laden Sie die Konfiguration, indem Sie auf Load Conf klicken.
Benennen Sie den Zeitraffer in der Basisdatei Name und wählen Sie die Datenbank aus, indem Sie auf "Bilddatenbank" klicken, um den Zeitraffer zu speichern. Legen Sie einen temporären Ordner fest, indem Sie auf Temporärer Bildordner klicken"Öffnen Sie als Nächstes die Inkubationseinheit, heben Sie den Bildring an, geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in das Objektiv und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich. Fokussieren Sie und wählen Sie eine Position in der Bildgebungskammer.
Verdünnen Sie in der Laminar-Flow-Vitrine freies Arzneimittel oder Nanopartikel in einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter Arzneimittel oder 0,05 Mikromol Lipide in Zellkulturmedium. Filtern Sie durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, wenn das Medikament oder die Nanopartikel nicht steril sind. Öffnen Sie die Brutkammer und heben Sie den Deckendeckel an.
Entfernen Sie dann das Medium aus den Zellen, fügen Sie einen Milliliter verdünntes Medikament oder Nanopartikel hinzu und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich. Fokussieren Sie sich auf die Zellen und führen Sie einen schnellen Scan durch, indem Sie auf der Registerkarte "Scan-Steuerung" auf "Einzeln" klicken. Wenn das Hellfeldbild fokussierte Zellen zeigt, starten Sie den Zeitraffer, indem Sie im Multi TimeX-Makro auf "Startzeit" klicken.
Die Anzahl der Wiederholungen und die verbleibende Zeit wird im Makro und in den Bildern angezeigt. Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Zellen noch scharf sind, oder verwenden Sie den Autofokus. Das Programm speichert den Zeitraffer automatisch in der Datenbank.
Schließen Sie die Datenbank nicht, während das Programm ausgeführt wird. Dabei handelt es sich um einen dreistündigen Zeitraffer von Zellen, die freiem Doxorubicin ausgesetzt waren. Beobachten Sie die Aufnahme und unmittelbare Translokation von rot fluoreszierendem Doxorubicin in den Zellkern.
Hier werden die Zellen drei Stunden lang mit verkapseltem Doxorubicin inkubiert. Das Fluoreszenzsignal ist viel geringer und befindet sich im Zytoplasma. Das Signal ist im Zellkern kaum sichtbar.
Beim Transport dieser Zeitrafferfilme zu Bild J kann ein interessanter Bereich um den Kern gezeichnet und die Pixeldichte gemessen werden. Die hier vorgestellte Grafik zeigt den Unterschied in der Kernaufnahme im Laufe der Zeit in Zellen, die entweder mit freiem oder verkapseltem Doxorubicin inkubiert wurden. Hier sind Zellen zu sehen, die mit verkapseltem Doxorubicin inkubiert wurden, dargestellt in rot.
Das violette Signal stellt den Träger dar und die Lysosomen sind mit einem grünen Lebendzellmarker gefärbt. Der Vergleich beider Zelltypen zeigt einen Unterschied in der lysosomalen Verteilung. Lysosomen in B16BL6-Zellen sind im gesamten Zytoplasma verteilt.
Während sich Lysosomen in BLM-Zellen in der Nähe des Zellkerns befinden. Beide Zelllinien zeigen jedoch eine hohe Kolokalisation von rotem und violettem Signal in Lysosomen, was darauf hindeutet, dass Doxorubicin und sein Träger in diesen Organellen gefangen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Aufnahme von Chemotherapeutika und anderen Fluoreszenzmarkern in lebenden Zellen über mehrere Stunden oder sogar Tage hinweg abbilden können.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Live-Cell-Imaging-Technik zur Visualisierung der Aufnahme und Verteilung chemotherapeutischer Wirkstoffe in Echtzeit vor. Durch den Verzicht auf Fixierungsartefakte ermöglicht die Methode eine genaue Beobachtung der Arzneimittelaufnahmevorgänge in lebenden Zellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Krebsforschung
Hintergrund
- Die Live-Cell-Bildgebung liefert dynamische Einblicke in zelluläre Prozesse.
- Die Bildgebung an fixierten Zellen kann zu Fehlinterpretationen von Arzneimittelabgabemechanismen führen.
- Nanopartikel können während der Fixierung abbauen, was die Analyse erschwert.
- Die Echtzeit-Bildgebung ist entscheidend, um Arzneimittelwechselwirkungen in der Krebstherapie zu verstehen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zum Nachweis der Aufnahme von chemotherapeutischen Wirkstoffen in lebende Zellen.
- Beurteilung der Verteilung von Nanopartikeln ohne Fixierungsartefakte.
- Verbesserung des Verständnisses von Wirkstoffabgabemechanismen in Tumorzellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Bildgebungskammer für die Beobachtung lebender Zellen.
- Kultivierung von Zellen unter kontrollierten Bedingungen (Temperatur, CO2, Luftfeuchtigkeit).
- Anwendung der konfokalen Mikroskopie zur Überwachung zellulärer Prozesse.
- Zeitraffer-Bildgebung, um dynamische Veränderungen über die Zeit zu erfassen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Aufnahme und Verteilung von Wirkstoffen in Echtzeit.
- Aufgezeigt, welche Vorteile die Live-Cell-Bildgebung gegenüber Methoden mit fixierten Zellen bietet.
- Erkenntnisse zum Verhalten von Nanopartikeln in lebenden Zellen gewonnen.
- Möglich gemacht, zelluläre Reaktionen auf die Exposition gegenüber Wirkstoffen zu beobachten.
Schlussfolgerungen
- Die Live-Cell-Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Arzneimittelabgabemechanismen.
- Die Methode verringert das Risiko einer Fehlinterpretation, die mit der Fixierung verbunden ist.
- Zukünftige Anwendungen könnten Krebsbehandlungsstrategien verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels Live-Cell-Bildgebung ist die Echtzeitverfolgung der Aufnahme chemotherapeutischer Nanopartikel und ihres intrazellulären Transports möglich, wodurch eine entscheidende Lücke in der onkologischen Arzneimittelentwicklung geschlossen wird, da Fixierungsartefakte dynamische Prozesse wie die Freisetzung von Wirkstoffen und deren Translokation in den Zellkern verschleiern. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er quantitative, zeitlich aufgelöste Daten zu Kinetik der Wirkstofffreisetzung und subzellulärer Lokalisation liefert und somit direkt die Optimierung von Leitverbindungen sowie die Auswahl präklinischer Kandidaten unterstützt. Durch die Visualisierung des Schicksals lipidbasierter Nanotransporter in lebenden Tumorzellen erhöht das Verfahren die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase und verringert die Ausscheidung in späteren Entwicklungsstadien aufgrund unzureichend verstandener Wirkmechanismen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der Freisetzung chemotherapeutischer Wirkstoffe aus Nanoträgern und deren anschließende nukleäre Translokation, wodurch der mechanistische Zusammenhang zwischen Wirkstoffabgabe und biologischer Aktivität geklärt wird.
- Praktischer Wert: Beseitigt durch Fixierung verursachte Artefakte, die die Integrität von Nanopartikeln und die Verteilung des Wirkstoffs verfälschen, und gewährleistet so eine korrekte Interpretation von Aufnahmeprofilen und Freisetzungsverhalten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der Fluoreszenzintensität über die Zeit, wodurch ein Vergleich der Kinetik von freien und verkapselten Wirkstoffen in einem physiologisch relevanten Kontext ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Schafft eine standardisierte, reproduzierbare Plattform zur Bewertung von nanopartikulären Arzneimittelabgabesystemen unter Bedingungen lebender Zellen und unterstützt die Skalierbarkeit von Assays sowie die Wiederverwendung über Projekte hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet den Abbau von Nanotransportern und die Freisetzung von Wirkstoffen mit der lysosomalen Kolokalisation und nukleären Anreicherung und liefert so einen translationalen Biomarker für die intrazelluläre Verfügbarkeit von Wirkstoffen.
- Operationaler Wert: Erleichtert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem visualisiert wird, ob verkapselte Wirkstoffe eine ausreichende nukleäre Zufuhr erreichen, um die erwarteten pharmakologischen Effekte hervorzurufen, und verringert so die mechanistische Unsicherheit in präklinischen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung, wobei die Echtzeit-Visualisierung der Arzneimittelfreisetzung und subzellulären Verteilung die Beziehung zwischen Struktur und Wirkung sowie die Optimierung des Nanotransportsystems vor der präklinischen Wirksamkeitsprüfung informiert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich der Stabilität von Nanotransportern, der Kinetik der Arzneimittelfreisetzung und der intrazellulären Transportwege, indem die direkte Beobachtung der Translokation von Doxorubicin vom Zytoplasma in den Zellkern ermöglicht wird.
- Screening: Liefert messfertige, quantitative Ergebnisse zum Arzneimittelaufnahme- und Kernakkumulationsverlauf über die Zeit und ermöglicht den direkten Vergleich von Formulierungsvariablen unter identischen Bedingungen an lebenden Zellen.
- Analytik: Stellt zeitaufgelöste Fluoreszenzintensitätsdaten aus definierten Interessenbereichen (z. B. Zellkern, Lysosomen) bereit und erlaubt statistische Vergleiche der Arzneimittelabgabeeffizienz zwischen freien und nanopartikelgebundenen Wirkstoffen.
- Translationale Forschung: Verknüpft das Verhalten von Nanotransportern in lebenden Zellen mit nachgeschalteten pharmakologischen Wirkungen, indem lysosomale Transportmuster mit der Verfügbarkeit des Arzneimittels im Zellkern korreliert werden, was Entscheidungen zur biomarkerbasierten Weiterentwicklung unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine modulare Bildgebungsfähigkeit dar, die auf verschiedene Nanopartikelplattformen und zytostatische Wirkstoffe übertragbar ist, wodurch redundante Methodenentwicklung vermieden und ein portfolioübergreifendes mechanistisches Screening ermöglicht wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich des Wirkmechanismus, indem die Freisetzung des Wirkstoffs in Echtzeit sowie die nukleäre Translokation sichtbar gemacht werden, wodurch Unsicherheiten hinsichtlich der Zielstrukturenbindung und Aktivierung von Signalwegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Kammerpräparation, Umweltkontrollen und Bildgebungsparameter und minimiert so die Variabilität in longitudinalen Live-Zell-Studien.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem nicht funktionstüchtige Nanotransporter frühzeitig identifiziert werden, wodurch Investitionen in Wirkstoffabgabesysteme vermieden werden, die am Wirkort keinen aktiven Wirkstoff freisetzen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Nanotransporter-Kandidaten basierend auf nachgewiesener intrazellulärer Wirkstofffreisetzung und nukleärer Abgabe und sorgt so dafür, dass die Weiterentwicklung an der mechanistischen Validität ausgerichtet ist.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung, konfokalen Mikroskopie und Zeitrafferaufnahme, um die Zellviabilität und Signalintegrität über längere Zeiträume aufrechtzuerhalten.
- Setzt spezialisierte Instrumente voraus, darunter Inkubationseinheiten mit Temperatur- und CO2-Steuerung, konfokale Laser und empfindliche Detektoren für die Verfolgung von Nanopartikeln mit schwachem Signal.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Zellpräparation, Dosierung von Wirkstoffen und den Bildgebungsprotokollen, um die Vergleichbarkeit über verschiedene Studien und Standorte hinweg sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungen für unterschiedliche Zelllinien, Nanopartikelgrößen und fluoreszierende Markierungen, da sich die Signal-Rausch-Verhältnisse und Phototoxizitätsschwellen je nach experimentellen Bedingungen unterscheiden.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören das Risiko der Photobleiche bei Langzeitbildgebung sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Optimierung von Laserleistung und Abtastgeschwindigkeit, um Signalqualität und Zellgesundheit in Einklang zu bringen.
