Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das dendrische Routing von adulten Drosophila medulla-Neuronen in Säulen und Schichten zu analysieren, um dendrische Muster zu charakterisieren, Zelltypen basierend auf der Morphologie zu bestimmen und Mutanten zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, einschließlich der Kartierung der Schaltkreise im Gehirn und des Verständnisses des Verdrahtungsmechanismus des Dendriten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die dendritischen Eigenschaften im dreidimensionalen Raum weitergibt und so das Verständnis der dendritischen Verdrahtungslogik und -funktionen verbessert.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei Bildstapel der interessierenden Neuronen in zwei orthogonalen, horizontalen und frontalen Ausrichtungen zu erfassen. Unter Verwendung der Standardtechniken färben Sie präparierte Fliegengehirne mit Kaninchen-Anti-GFP und einem Antikörper, der Photorezeptoraxone als Primärantikörper markiert. Dann markieren Sie die primären Antikörper mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern und reinigen Sie das Gehirn mit 70% Glycerin und 1X PBS.

Um das Gehirn in horizontaler Ausrichtung zu montieren, übertragen Sie ein mit Glycerin gereinigtes Gehirn in einen 20-Mikroliter-Tropfen Antifading-Eindeckmedium, das mittig auf dem Objektträger abgeschieden wird. Befestigen Sie dann an einem Deckglas kleine Tonflecken an den vier Ecken, um zu verhindern, dass das Deckglas das Gehirn zerquetscht. Positionieren Sie nun unter einem Präpariermikroskop das Gehirn in der ventralen Position nach oben.

Verwenden Sie die konvexe dorsale Oberfläche des Gehirns als Orientierungspunkt, um die Ausrichtung der Gehirnprobe zu identifizieren. Dies bietet eine horizontale Ansicht des Neurons. Bringen Sie dann das Deckglas an.

Mit einem konfokalen Mikroskop, das idealerweise mit GaAsP-Detektoren ausgestattet ist, erhalten Sie den Bildstapel mit horizontaler Sicht mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur und einem digitalen Zoom von 2,5. Erfassen Sie mindestens 180 optische Abschnitte mit 512 quadratischen Pixeln und einer Schrittweite von 2 Mikrometern. Nachdem Sie den ersten Bildstapel aufgenommen haben, entfernen Sie das Deckglas von der Folie und positionieren Sie das Gehirn wieder in die vordere Position, die eine Frontalansicht ermöglicht.

Erstellen Sie dann mit der gleichen Technik einen neuen Bildstapel der Frontalansicht derselben Neuronen, die in der horizontalen Ansicht abgebildet sind. Achten Sie darauf, auch die Position des interessierenden Neurons in Bezug auf das Medulla-Neuropal aufzuzeichnen. Die Identifizierung der gleichen Neuronen ist bei geringerer Vergrößerung möglich.

Wenn jedoch das Signal verloren geht, weil das Gewebe tief ist, stellen Sie sich einfach die ventrale Hälfte Ihres Gehirns vor. Überprüfen Sie auch, ob sich das Beispiel während der Bildaufnahme bewegt hat, indem Sie die Bildstapel untersuchen. Die Bildentfaltung und die Bildkombination sind im Textprotokoll detailliert beschrieben.

Ziel dieses Verfahrens ist es, Neuriten aufzuspüren und Referenzpunkte für die Registrierung zuzuweisen. Öffnen Sie zunächst die rekombinierte Bilddatei. Gehen Sie dann zu Bearbeiten.

Zeigen Sie dann die Anzeigeeinstellung an und schalten Sie den Fotorezeptorkanal aus, der rot ist. Visualisieren Sie als Nächstes das Bild im Surpass-Modus. Wenn der Computer mit einem Stereografiesystem ausgestattet ist, schalten Sie Stereo ein und verwenden Sie den Quad-Puffermodus, um 3D-Bilder zu visualisieren.

Fügen Sie neue Filamente hinzu, gehen Sie zu "Übertreffen", dann zu "Filamente" und klicken Sie auf die Registerkarte "Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten". Klicken Sie dann auf die Registerkarte Zeichnen und wählen Sie AutoDepth. Wählen Sie anschließend Einstellungen.

Schalten Sie die Linienoption um und geben Sie die entsprechende Pixelzahl für eine bessere Visualisierung ein. Schalten Sie dann die Option Dendriten anzeigen, Anfangspunkt und Verzweigungspunkt um und legen Sie die Renderqualität auf 100 % fest. Wählen Sie nun die Registerkarte Zeichnen aus, und beginnen Sie mit der Verfolgung von Neuriten. Beginnen Sie mit dem Axon und gehen Sie dann zu den Dendriten über.

Das Axon und die Dendriten der Transmedulla-Neuronen sollten leicht zu unterscheiden sein. Nachdem Sie die Neuriten verfolgt haben, kehren Sie zu den Einstellungen zurück und deaktivieren Sie sowohl den Anfangspunkt als auch den Verzweigungspunkt. Gehen Sie dann zu Übertreffen und dann zu Exportieren.

Wählen Sie ein Objekt aus, und speichern Sie das Filament als Inventor-Datei. Der nächste Schritt ist die Zuweisung von Referenzpunkten. Wählen Sie zunächst Anzeigeanpassung anzeigen und aktivieren Sie beide Bildkanäle.

Gehen Sie dann zu Übertreffen, dann zu Messung. Schalten Sie auf der Registerkarte "Bearbeiten" den spezifischen Kanal um und wählen Sie in diesem Fall den Photorezeptorkanal aus. Weisen Sie nun Referenzpunkte für die oberste Ebene zu.

Wählen Sie "Übertreffen" und dann "Messpunkte" und markieren Sie den Anfang der m1-Ebene als oberste Ebene. Verwenden Sie die Funktion Schnittebene, um die Punktzuweisung zu erleichtern. Die Reihenfolge der Punkte ist äquatorial, anterior äquatorial, anterior, anterior ventral, ventral, posterior ventral, posterior, posterior äquatorial und center.

Um den zentralen Photorezeptor zu finden, ist er derjenige, der mit den meisten dendritischen Prozessen verbunden ist. Weisen Sie als Nächstes die Referenzpunkte für die R8- und R7-Schichten mit der gleichen Technik zu. Nachdem Sie jeden Satz von Referenzpunkten definiert haben, exportieren Sie die Koordinaten.

Wählen Sie Statistiken, dann detaillierte, spezifische Werte und Position aus. Wählen Sie dann Statistik auf dem Tab Anzeige in Datei exportieren und speichern Sie die Koordinaten als CSV-Datei. Öffnen Sie als Nächstes die drei CSV-Dateien in einem Tabellenkalkulationseditor.

Kopieren Sie die Koordinaten der 27 Referenzpunkte, und fügen Sie sie in eine neue Datei ein, und zwar in der Reihenfolge von oben, R8 und R7. Fahren Sie fort, indem Sie das Textprotokoll für die Standardisierung der Starrkörper- und TPS-Registrierung zur rechtsventralen Konfiguration bei der Berechnung der dendritischen Verzweigungs- und Terminationsfrequenzen befolgen. Letztendlich werden die Daten verwendet, um verschiedene informative Diagramme zu erstellen. Mit dem hier vorgestellten Dual-View-Imaging-Verfahren wurde ein Fliegengehirn mit spärlich markierten tm 20-Neuronen in zwei orthogonale Richtungen abgebildet.

Die Bildrekombination verbessert die axiale Auflösung. Das rekombinierte Bild hat eine bessere Auflösung als die Bilder in der horizontalen und frontalen Ansicht. Nach Konsultation von 3D-Modellen wurden dendritische Spuren von 15 tm 20 Neuronen gesammelt und mit dendritischen Spuren von 15 tm 2 Neuronen verglichen.

Die Verzweigungs- und Terminationswahrscheinlichkeiten dieser Neuronen wurden analysiert. Beide Typen waren für Segmente von weniger als 4 Mikrometern ähnlich. Die schichtspezifische Analyse der dendritischen Terminierung zeigte, dass sich die beiden Neuronentypen auf unterschiedliche schichtspezifische Weise verteilen.

Tm 2 Dendriten erhalten Eingaben in m2 und in m5. Während tm 20 Dendriten in der m1 bis m3 Schicht enden. Die planare Analyse zeigt, dass die Dendriten von tm 2 anterior projizieren, während die Dendriten von tm 20 nach posterior projizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie zwei Ihrer konfokalen Bilder aufnehmen können. Lesen Sie Ihre Studienmarkierungen in den Bildgebungsdateien ab und extrahieren Sie die dendritischen Eigenschaften aus diesen Bildern. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Probe vor der konfokalen Bildgebung richtig zu markieren.

Da die Bildgebungskombination fehlschlägt, wenn sich die Probe während der Bildgebung bewegt.