Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein lineares B-Zell-Epitop, das von einem monoklonalen Antikörper erkannt wird, mithilfe seriell verkürzter rekombinanter Proteine und einer Peptid-Scanning-Methode mittels Dot-Blot-Hybridisierung zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Molekülinteraktion zwischen Antigen und Antikörper zu beantworten. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Einfachheit und Effizienz.

Das identifizierende Epitop kann anschließend in umfassenderen Untersuchungen verwendet werden, beispielsweise in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Die Demonstration des Verfahrens wird Chien-Wen Chen, ein Postdoktorand aus meinem Labor, durchführen. Beginnen Sie damit, RGM56-mausmonoklonale Hybridomzellen in einem hybriden, serumfreien Medium zu kultivieren.

Zellkulturen in 175-T-Flaschen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid pflegen. Nach fünf Tagen Inkubation das Kulturmedium sammeln, sobald es gelb geworden ist, und das Überstand nach einer Zentrifugation bei 4.500 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius gewinnen. Anschließend den pelletierten Zelltrümmer verwerfen, um den Antikörper in Lösung zu erhalten.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter einer 50 %igen Protein G-Agarose-Suspension einer Fünf-Milliliter-Säule hinzu und equilibrieren Sie das Harz mit 10 Milliliter eiskalter PBS, was dem 10-fachen Volumen des vorgeladenen Harzes entspricht. Geben Sie 200 Milliliter der zuvor hergestellten Antikörperlösung auf die equilibrierte Säule und verwerfen Sie die durch die Säule fließende Fraktion. Spülen Sie die Säule zweimal mit 10 Milliliter eiskalter PBS.

Schließlich, um den Antikörper von der Harzmatrix zu eluieren, 10 Milliliter millimolare Glyzerinlösung mit pH 2,7 auf die Säule geben. 900-Mikroliter-Fraktionen in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln, die zuvor mit 100 Mikrolitern 10× Neutralisierungspuffer gefüllt wurden. Den gereinigten Antikörper in 50 %iger Glyzerinlösung, ergänzt mit Natriumazid, bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Bereiten Sie die Konstrukte vor und transformieren Sie E. coli BL21-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Überführen Sie dann eine einzelne Kolonie in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter LB-Brühe mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält, und verschließen Sie das Röhrchen locker. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min.

Überwachen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn sie etwa 0,6 erreicht hat, kühlen Sie die Kultur auf 25 Grad Celsius ab. Fügen Sie dann IPTG mit einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar hinzu, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren.

Inkubieren Sie die Kultur weitere vier Stunden bei 25 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Nach der Inkubation überführen Sie ein Milliliter der bakteriellen Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 12.000 × g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand.

Pipettieren Sie mit einer Mikropipette auf und ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Denaturierungspuffer. Mischen Sie die resultierende Suspension durch kräftiges Vortexen, um eine gebrauchsfertige Probe rekombinantem Proteins zu erhalten. Um mit der Dot-Blot-Hybridisierung fortzufahren, lösen Sie jedes synthetische Peptid in DMSO auf, um Lösungen mit 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten.

Dann aktivieren Sie die PVDF-Membran zwei Minuten lang in Methanol und equilibrieren sie weitere zwei Minuten mit modifiziertem Towbin-Puffer. Spülen Sie ein Stück Chromatographiepapier mit modifiziertem Towbin-Puffer ab und legen Sie die equilibrierte PVDF-Membran darauf. Lassen Sie die Membran so lange ruhen, bis der Puffer von ihrer Oberfläche verschwunden ist.

Unter Verwendung einer 10-Mikroliter-Spitze zwei Mikroliter jeder Peptid- oder rekombinanten Proteinstichprobe auf die Membran geben und 10 Minuten lufttrocknen lassen. Das Aufbringen eines Symbols auf die Membran ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Das Beladen einer exakten Menge einer Probe auf einen kleinen Bereich der PVDF-Membran erfordert besondere Sorgfalt.

Als Nächstes blockieren Sie die Membran in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch ergänzt wurde, für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verdünnen Sie den RGM56 monoklonalen Antikörper in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch ergänzt wurde, und geben Sie die Antikörperlösung zur Membran hinzu.

Die Membran eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Antikörperlösung entfernen und die Membran zweimal für jeweils fünf Minuten mit TBST-Puffer unter leichtem Schütteln waschen.

Dann die Lösung des sekundären Antikörpers, verdünnt in TBST-Puffer mit 5 % fettfreier Milch, auf die Membran geben. Die Membran eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Antikörperlösung entfernen und die Membran zweimal für jeweils fünf Minuten im TBST-Puffer unter leichtem Schütteln waschen.

Entwickeln Sie anschließend die Membran mit der Substratlösung 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sobald das Signal erscheint, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Membran mit zweifach destilliertem Wasser waschen. Nach dem Lufttrocknen der Membran erfassen Sie das Dot-Blot-Bild mithilfe eines Imaging-Systems.

Schließlich wird mithilfe einer Bildanalyse-Software die Intensität jedes Dot-Blots gemessen. Dargestellt ist hier das vollständige Code-Protein des Nervous Necrosis Virus, das die Aminosäuren eins bis 338 umfasst, zusammen mit seinen seriell verkürzten Varianten. Um die Expression der Proteine in den transformierten Bakterienzellen zu bestätigen, wurde eine Dot-Blot-Analyse mit einem Anti-6XHis-Antikörper durchgeführt, die das Vorhandensein aller untersuchten Proteine zeigt.

Anschließend wurden die rekombinanten Proteine mittels Dot-Blot-Hybridisierung analysiert, bei der der RG-M56 monoklonale Antikörper verwendet wurde. Die Analyse ergab, dass das von dem Antikörper erkannte Proteinepitop im Peptid 195 bis 338 liegt. Schließlich wurde durch Peptid-Scanning ein Epitop identifiziert, das aus 20 oder acht Aminosäureresten besteht.

Das Alanin-Scanning zeigte, dass Substitutionen von Valinresten an den Positionen 197 und 199 sowie einer Cystinreststelle bei 201 die Bindungsfähigkeit des Epitops und die Dot-Blot-Hybridisierung aufhoben. Ebenso wurde in der Analyse der Bindungsintensität eine verminderte Bindungsaffinität beobachtet, was bestätigt, dass die identifizierten Reste für die Bindung des Epitops an den monoklonalen RGM56-Antikörper essentiell sind. Diese Peptid-Identifizierungstechnik kann zur Entwicklung therapeutischer Peptidarzneimittel oder Peptidmedikamente verwendet werden.