Name: Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung linearer B-Zell-Epitope durch Peptid-Scanning und Dot-Blot-Hybridisierung. Diese einfache Methode ermöglicht die Kartierung von Antikörper-Epitopen für therapeutische und diagnostische Anwendungen.

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Die Autoren danken Miss Ching-Chun Lin und Miss Diana Lin von der Core Facility des Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) der Academia Sinica für ihre Expertise zur Peptidsynthese bzw. DNA-Sequenzierung. Diese Studie wurde von der Academia Sinica unterstützt.

1. Herstellung des monoklonalen Antikörpers <ol><li> Kultur die RG-M56 monoklonalen Maus - Hybridomzellen 2 in Serum-freiem Medium in 175T - Kolben bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu ergänzen. Die überstehende Flüssigkeit, wenn die Farbe des Mediums nach fünf Tagen Inkubation gelb wird. HINWEIS: Hybridoma-Zellen wurden in serumfreiem Medium Antikörper Kontamination aus fötalem Rinderserum zu vermeiden. </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand bei 4.500 × g für 30 min bei 4 ° C und entsorgen die Zelltrümmer Pellet. </li><li> In 2 ml Protein G-Agarose (geliefert als eine 50% ige Aufschlämmung) auf eine 5-ml-Säule und ins Gleichgewicht mit 10 Harzvolumina (10 ml) eiskaltem PBS. </li><li> Legen Sie 200 ml des Antikörpers Überstand (Schritt 1.2) auf die Säule und entsorgen Sie die Pass-Through. </li><li> 10 ml eiskaltem PBS auf die Säule zu waschen. Zweimal wiederholen. </li><li> 10 ml 50 mM Glycin, pH 2,7 auf die Säule, die das Protein G-assoziierten Antikörper zu eluieren. ColLect 900 ul-Fraktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 ul 10fach Neutralisationspuffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl und 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Lagern Sie das gereinigte Antikörper in 50% Glycerin mit 0,03% NaN 3 bei -20 ºC. </li></ol> 2. Konstruktion und Expression von Abwechselnd Verkürzte rekombinanten Proteine <ol><li> Bereiten Sie eine PCR - Reaktionsgemisch: 5 ul 10x Pfu - Puffer, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,2 &amp; mgr; M Vorwärtsprimer 3, 0,2 uM Reverse - Primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng pET20b-1A59 3 Plasmid - DNA und 2,5 U ( Einheit) von Pfu DNA - Polymerase; ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 &amp; mgr; l hinzuzufügen. <ol><li> Führen Proben in einem automatischen Thermocycler mit folgenden Parametern: Zyklus 1 (94 ° C für 5 min); 2-36 Zyklen (94 ° C für 30 s, 63 ºC für 30 s und 72 ° C für 60 s); und Zyklus 37 (72 ºC für 7 min). </li></ol></li><li> Extrahieren der Polymerasekettenreaktion (PCR) Produkte durch eine PCR - Reinigungskits 5 unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzym - Verdau zu ermöglichen. </li><li> Digest die PCR-amplifizierten DNA - Fragmente mit Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen und Ligation jedes dieser DNA - Fragmente in Nde I und Xho I gespalten enzym pET-20b (+) Vektor. Verwandeln Sie die Konstrukte in Escherichia coli DH-5α kompetenten Zellen 6. <ol><li> Bereiten Sie die Aufschlussmischung in Verdauungspuffer (20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg (CH 3 COO) 2, 50 mM KCH 3 COO und 1 mM DTT, pH 7,9) mit 1 ug PCR-amplifizierte DNA oder pET-20b (+) Vektor - DNA und 2 U von Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen in einem Endvolumen von 20 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie die Verdauung Mischung sanft und schnell drehen nach unten. bei 37 ºC inkubieren für 2 h in einem trockenen Bad die komplette Schneiden der Einschränkung, um sicherzustellen, sitzenes. </li><li> Extrahieren Sie die Restriktionsenzym-verdauten DNA - Fragmente unter Verwendung eines PCR - Reinigungs - Kit 5 , um die folgenden Plasmidkonstruktion erleichtern. </li><li> Bereiten Sie die Ligierungsmischung in Ligationspuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP und 5 mM DTT, pH 7,5) mit 100 ng predigested, PCR-amplifizierte DNA, 10 ng vorverdaut pET-20b (+) Vektor-DNA und 5 U des T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 10 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie das Ligierungsgemisch schonend und schnell Spin-Down. bei 16 ºC inkubieren für 18 Stunden in einem Wasserbad. </li><li> Setzen Sie 10 ul der Ligationsproben in 100 &amp; mgr; l der DH-5α kompetenten Zellen und vorsichtig mischen, bevor das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 30 min platzieren. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen in einem trockenen Bad bei 42 ° C für 90 s Hitzeschock 7 zu induzieren. Unmittelbar übertragen das Rohr auf Eis für 2 min. </li><li> Hinzufügen 900 uL Luria-Bertani (LB) Medium (1% Bacto Trypton, 0,5% Bacto Hefe extract, und 0,5% NaCl, pH 7,0) in das Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 45 Minuten schütteln. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 x g für 10 Minuten und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren des Pellets mit 50 &amp; mgr; l LB-Brühe und verteilt jede Transformation auf vorgewärmte LB-Platten, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Die Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden. </li><li> Pick-up eine einzelne Kolonie mit einer 200 ul Spitze und legen Sie sie in 3 ml LB-Brühe, die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose verschlossen 15 ml-Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 12 h unter Schütteln. </li><li> Extrahieren Sie die Plasmid - DNA 8 aus jeder Kultur und sequenzieren es T7 - Promotor und T7 - Terminator - Primer unter Verwendung der Sequenz 9 zu bestätigen. </li></ol></li><li> Nach Sequenzbestätigung, 10 ng DNA aus diesen mit verschiedenen Längen von YGNNV Hüllprotein - Gen in den BL-21 (DE3) -Stamm von E. coli durch uns pET-20b (+) Plasmide transformierening die Hitzeschock - Methode 7. Führen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 die Transformation durchzuführen. </li><li> Übertragen einer einzelnen Kolonie aus jeder transformierten E. coli BL-21 - Zellen in 3 ml LB - Brühe , die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose capped 15 ml - Röhrchen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C mit 150 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Man kühlt die Kultur auf 25 ºC , wenn die OD 600 der Kultur etwa 0,6 ist und fügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM , die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Inkubieren Sie die Kultur für eine zusätzliche 4 h bei 25 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 1 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 100 ul Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat und 0,5 M NaCl, pH 7,4) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mikropipette. Mischen durch kräftiges Vortexen. HINWEIS: Die Probe solutions sollte nun semi-transparent, ein wenig klebrig, und bereit für die Dot-Blot-Hybridisierungstest ist. </li></ol> 3. Entwurf und Synthese von überlappenden Peptiden <ol><li> Design und Synthese von 3 serielle 20-mer Peptide , die jeder mit seinem Nachfolger überlappen um 10 AS - Reste aus dem 195-338 aa Bereich des YGNNV Hüllprotein des Epitopbereichs von RG-M56 mAb durch Dot - Blot zu verengen. </li><li> Design und Synthese von 3 drei 8-mer - Peptide (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 und 199 VLCRWSVR 206) mit einer Überlappung von 6 AS - Reste auf die nächste synthetisches Peptid , das das Epitop Region von 195-206 aa durch Dot - Blot zu verengen. </li><li> Design und Synthese von 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 und 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 und 197 VSVLCR 202) und 5-mer - Peptide (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 und 198 SVLCR 202) mit einer Überlappung von 6, 5 und 4 aa - Reste jeweils an ihren benachbarten Peptide die zur Minimierung Epitopbereichs durch dot-Blot. </li></ol> 4. Dot-Blot-Hybridisierung <ol><li> Auflösen jedes synthetisierte Peptid in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 10 mg / mL. HINWEIS: Um die vielfältigen Löslichkeit von synthetischen Peptiden zu überwinden, alle synthetischen Peptide sollten in DMSO gelöst werden. DMSO ist ein gutes Lösungsmittel vollständig hydrophob oder hydrophile Peptide lösen. </li><li> Genießen Sie die Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran mit Methanol für 2 min. HINWEIS: PVDF-Membran ist bis zu 100% beständig DMSO; andere können nicht so sein. </li><li> Äquilibrieren die PVDF-Membran mit modifizierten Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% SDS, pH 8,3) für2 Minuten. HINWEIS: 10-20% (v / v) Methanol kann modifiziert Towbin Puffer hinzugefügt werden die Übertragungsergebnisse zu verbessern. </li><li> Spülen Sie ein Stück Papier Chromatographie mit dem modifizierten Towbin-Puffer. Legen Sie die PVDF-Membran auf die Chromatographie-Papier. Warten, bis der modifizierte Towbin Puffer aus der PVDF Membranoberfläche verschwunden ist, bevor mit dem nächsten Schritt fort. </li><li> Fügen Sie 2 ul jeder Peptidprobe an die Membran mit einer 10 &amp; mgr; l Spitze. Der Luft trocknen die PVDF-Membran auf der Chromatographie-Papier für 10 min. Fügen Sie jede Peptidprobe langsam und allmählich auf die Membran zu viel Diffusion zu vermeiden. </li><li> Blockieren die Membran in TBST-Puffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris und 150 mM NaCl, pH 7,4) mit 5% Magermilch 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. </li><li> Hinzufügen RG-M56 mAb bei einer Endverdünnung von 1: 1000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Antikörper solution. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Zweimal wiederholen. </li><li> Fügen der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus IgG, Fc, konjugiert mit alkalischer Phosphatase) in einer Endverdünnung von 1: 5000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln. </li><li> Entsorgen Sie die Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. </li><li> Entwickeln der Membran mit BCIP / NBT-Substratlösung während 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Entwicklung durch die Membran mit ddH 2 O gewaschen , wenn das Signal erscheint. </li><li> Der Luft trocknen die Membran und erfassen die Dot-Blot-Bild ein Bild System. </li><li> Messen der Intensität jedes Dot - Blot unter Verwendung von Bildanalysesoftware 3. </li></ol> 5. Alaninscanning und Substitution <ol><li> Entwerfen und zu synthetisieren 3 Alanin und methionine Substitutionspeptide. Ersetzen Sie jede aa Rückstand mit Alanin für die 8-mer Peptid 195 VNVSVLCR 202 und synthetisieren Peptide 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 und 195 VNVSVLCA 202 . Ersetzen aa Rest Leucin 200 zu Methionin das SJNNV Genotyp - Epitop - Peptid 195 VNVSVMCR 202 zu schaffen. </li><li> Folgen Sie Abschnitt 4 zu Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese durchführen Dotblotting. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und einfache Technik, um ein mAb anerkannte lineares Epitop zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der Kosten für die Peptidsynthese und die Produktionseffizienz der Synthese von Peptiden wurde die antigene Region des Virus-Hüllproteins reduziert durch serielles trunkierten rekombinanten Proteinen vor Peptid-Scanning-Analyse exprimieren. Als solche wurde die zuverlässig und effizient E. coli pET Expressionssystem diese seriell trunkierten rekombinanten Proteine als rekom...

Im Immunsystem, die Rekombination von V-, D- und J - Segmente können für Antikörper für die Bindung an verschiedene Antigene enorme Variationen von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) zu erzeugen , die Host von pathogenen Infektion zu schützen. Die neutralisierende Abwehr von Antikörpern gegen Antigene hängt von der räumlichen Komplementarität zwischen den CDRs der Antikörper und die Epitope der Antigene. Daher wird ein Verständnis dieser molekularen Wechselwirkung prophylaktischen Impfstoff-Design und therapeutischen Peptid Arzneimittelentwicklung unterstützen. Jedoch kann diese Neutralisation Wechselwirkung sowohl aus einem einzigen Antigen und durch mehrere CDRs von Antikörpern durch multiple antigene Domänen beeinflußt werden, die somit das Epitop Bestimmungsprozess komplexer machen. Glücklicherweise ist die Entwicklung der Hybridom-Technologie, die einzelnen Antikörper-produzierenden Zellen mit Myelomzellen verschmilzt, ermöglicht eine ständig Dividieren Charge von Zellen secrete einem spezifischen Antikörper, bekannt als ein monoklonaler Antikörper (mAb) 1. Hybridomzellen produzieren diese reine, hochaffine mAb an einem einzigen Antigen-Domäne eines spezifischen Antigens zu binden. Mit der Beziehung des Antigen-Antikörper festgestellt, mehrere Ansätze, einschließlich Peptid-Scanning, verwendet werden, um das Epitop eines Antigens zu bestimmen seinen entsprechenden mAb verwendet. Die jüngsten Entwicklungen in der synthetischen Peptid-Technologie haben die Peptid-Scanning-Technik zugänglicher und bequemer gemacht auszuführen. Kurz gesagt, werden gemäß einer Zielantigensequenz einen Satz von überlappenden synthetischen Peptiden hergestellt und zu einem Feststoff-Trägermembran für mAb Hybridisierung verbunden. Peptid-Scanning bietet nicht nur eine einfache Möglichkeit, die Antikörper-Bindungsregion auf der Karte, sondern erleichtert auch Aminosäure (aa) Mutagenese durch Rückstands Scannen oder Substitution die Bindungswechselwirkung zwischen jedem aa-Rest des Epitop-Peptid und die CDRs des Antikörpers zu bewerten. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschreibt die vorliegende Studie ein Protokoll für die effiziente Identifikation des linearen Epitop des gelben Grouper nervös Nekrose - Virus (YGNNV) Hüllprotein mit einem neutralisierenden mAb 2, 3, 4. Das Protokoll enthält mAb Vorbereitung, Konstruktion und Expression von seriell verkürzten rekombinanten Proteine, synthetische überlappende Peptid Design, Dot-Blot-Hybridisierung, Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese. die hohen Kosten für die Peptidsynthese unter Berücksichtigung, wurde der Schritt des seriell die rekombinanten Proteine ​​eines gewünschten Zielproteins Verkürzen modifiziert und die antigene Region wurde auf etwa 100 bis 200 aa Reste, bevor der synthetische Peptidarray Dot-Blot-Analyse durchgeführt wurde eingeengt.

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM-Medium</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos-Phophat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu-DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>Einschließlich Puffer</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>einschließlich Puffer</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Einschließlich Puffer</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Einschließlich Puffer</td></tr><tr><td>pET-20b(+) Vektor</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; kompetente Zelle</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) kompetente Zelle</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthio-&beta;-D-Thiogalactosid (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen 20 Sorbitan Monolaurat (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG, Fc-Fragment</td><td>Antikörper Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Polyvinylidenfluorid, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast</td><td>Flow Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptid-scanning-gestützte identifizierung eines monoklonalen antikörpers anerkannte linear b-zell-epitop

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Die Identifizierung eines antigenes Epitop von dem Immunsystem ermöglicht das Verständnis des Schutzmechanismus von neutralisierenden Antikörpern, die die Entwicklung von Impfstoffen und Peptid-Medikamente können erleichtern. Peptid-Scanning ist eine einfache und effiziente Methode, die ohne weiteres das lineare Epitop durch einen monoklonalen Antikörper (mAb) erkannt abbildet. Hier präsentieren die Autoren ein Epitop Bestimmung Methodik seriell verkürzten rekombinanten Proteinen, synthetischen Peptid-Design und Dot-Blot-Hybridisierung für die Antigen-Erkennung von Nerven Nekrose-Virus-Hüllprotein mit einem neutralisierenden mAb beteiligt sind. Diese Technik beruht auf dem Dot-Blot-Hybridisierung von synthetischen Peptiden und mAbs auf einem Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran. Die minimale antigen Bereich eines viralen Hüllprotein vom RG-M56 mAb erkannt durch die Schritt-für-Schritt-getrimmten Peptidkartierung auf ein 6-mer-Peptid-Epitops eingegrenzt werden. Zusätzlich Alanin-Scanning-Mutagenese und Rückstands substitution kann die Bindungs ​​Bedeutung jeder Aminosäurerest, aus denen das Epitop charakterisieren, durchgeführt werden. Die Reste, die die Epitop-Website flankieren, wurden gefunden kritische Rollen in Peptidkonformation Regulation zu spielen. Das identifizierte Epitop-Peptid kann verwendet werden, um Kristalle von Epitop-Peptid-Antikörper-Komplexe für eine Röntgenbeugungsuntersuchung zu bilden und funktionellen Wettbewerb oder für Therapeutika.

Das Ziel dieses Experimentes war es ein Epitop durch Dot-Blotting unter Verwendung von mAb zu identifizieren. Um schnell und effizient verengen die antigene Region anerkannt durch mAb, die in voller Länge und seriell abgeschnitten YGNNV rekombinanten Hüllproteine mit einem 6xHis Fusions - Tag am C-Terminus wurden aus einem E. coli - PET - Expressionssystem 10 (1A) ausgedrückt. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​wurden auf die PVD...

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein lineares B-Zell-Epitop, das von einem monoklonalen Antikörper erkannt wird, mithilfe seriell verkürzter rekombinanter Proteine und einer Peptid-Scanning-Methode mittels Dot-Blot-Hybridisierung zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Molekülinteraktion zwischen Antigen und Antikörper zu beantworten. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Einfachheit und Effizienz.Das identifizierende Epitop kann anschließend in umfassenderen Untersuchungen verwendet werden, beispielsweise in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Die Demonstration des Verfahrens wird Chien-Wen Chen, ein Postdoktorand aus meinem Labor, durchführen. Beginnen Sie damit, RGM56-mausmonoklonale Hybridomzellen in einem hybriden, serumfreien Medium zu kultivieren.Zellkulturen in 175-T-Flaschen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid pflegen. Nach fünf Tagen Inkubation das Kulturmedium sammeln, sobald es gelb geworden ist, und das Überstand nach einer Zentrifugation bei 4.500 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius gewinnen. Anschließend den pelletierten Zelltrümmer verwerfen, um den Antikörper in Lösung zu erhalten.Fügen Sie anschließend zwei Milliliter einer 50 %igen Protein G-Agarose-Suspension einer Fünf-Milliliter-Säule hinzu und equilibrieren Sie das Harz mit 10 Milliliter eiskalter PBS, was dem 10-fachen Volumen des vorgeladenen Harzes entspricht. Geben Sie 200 Milliliter der zuvor hergestellten Antikörperlösung auf die equilibrierte Säule und verwerfen Sie die durch die Säule fließende Fraktion. Spülen Sie die Säule zweimal mit 10 Milliliter eiskalter PBS.Schließlich, um den Antikörper von der Harzmatrix zu eluieren, 10 Milliliter millimolare Glyzerinlösung mit pH 2,7 auf die Säule geben. 900-Mikroliter-Fraktionen in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln, die zuvor mit 100 Mikrolitern 10× Neutralisierungspuffer gefüllt wurden. Den gereinigten Antikörper in 50 %iger Glyzerinlösung, ergänzt mit Natriumazid, bei minus 20 Grad Celsius lagern.Bereiten Sie die Konstrukte vor und transformieren Sie E. coli BL21-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Überführen Sie dann eine einzelne Kolonie in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter LB-Brühe mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält, und verschließen Sie das Röhrchen locker. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min.Überwachen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn sie etwa 0,6 erreicht hat, kühlen Sie die Kultur auf 25 Grad Celsius ab. Fügen Sie dann IPTG mit einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar hinzu, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren.Inkubieren Sie die Kultur weitere vier Stunden bei 25 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Nach der Inkubation überführen Sie ein Milliliter der bakteriellen Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 12.000 × g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand.Pipettieren Sie mit einer Mikropipette auf und ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Denaturierungspuffer. Mischen Sie die resultierende Suspension durch kräftiges Vortexen, um eine gebrauchsfertige Probe rekombinantem Proteins zu erhalten. Um mit der Dot-Blot-Hybridisierung fortzufahren, lösen Sie jedes synthetische Peptid in DMSO auf, um Lösungen mit 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten.Dann aktivieren Sie die PVDF-Membran zwei Minuten lang in Methanol und equilibrieren sie weitere zwei Minuten mit modifiziertem Towbin-Puffer. Spülen Sie ein Stück Chromatographiepapier mit modifiziertem Towbin-Puffer ab und legen Sie die equilibrierte PVDF-Membran darauf. Lassen Sie die Membran so lange ruhen, bis der Puffer von ihrer Oberfläche verschwunden ist.Unter Verwendung einer 10-Mikroliter-Spitze zwei Mikroliter jeder Peptid- oder rekombinanten Proteinstichprobe auf die Membran geben und 10 Minuten lufttrocknen lassen. Das Aufbringen eines Symbols auf die Membran ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Das Beladen einer exakten Menge einer Probe auf einen kleinen Bereich der PVDF-Membran erfordert besondere Sorgfalt.Als Nächstes blockieren Sie die Membran in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch ergänzt wurde, für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verdünnen Sie den RGM56 monoklonalen Antikörper in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch ergänzt wurde, und geben Sie die Antikörperlösung zur Membran hinzu.Die Membran eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Antikörperlösung entfernen und die Membran zweimal für jeweils fünf Minuten mit TBST-Puffer unter leichtem Schütteln waschen.Dann die Lösung des sekundären Antikörpers, verdünnt in TBST-Puffer mit 5 % fettfreier Milch, auf die Membran geben. Die Membran eine Stunde bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Antikörperlösung entfernen und die Membran zweimal für jeweils fünf Minuten im TBST-Puffer unter leichtem Schütteln waschen.Entwickeln Sie anschließend die Membran mit der Substratlösung 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sobald das Signal erscheint, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Membran mit zweifach destilliertem Wasser waschen. Nach dem Lufttrocknen der Membran erfassen Sie das Dot-Blot-Bild mithilfe eines Imaging-Systems.Schließlich wird mithilfe einer Bildanalyse-Software die Intensität jedes Dot-Blots gemessen. Dargestellt ist hier das vollständige Code-Protein des Nervous Necrosis Virus, das die Aminosäuren eins bis 338 umfasst, zusammen mit seinen seriell verkürzten Varianten. Um die Expression der Proteine in den transformierten Bakterienzellen zu bestätigen, wurde eine Dot-Blot-Analyse mit einem Anti-6XHis-Antikörper durchgeführt, die das Vorhandensein aller untersuchten Proteine zeigt.Anschließend wurden die rekombinanten Proteine mittels Dot-Blot-Hybridisierung analysiert, bei der der RG-M56 monoklonale Antikörper verwendet wurde. Die Analyse ergab, dass das von dem Antikörper erkannte Proteinepitop im Peptid 195 bis 338 liegt. Schließlich wurde durch Peptid-Scanning ein Epitop identifiziert, das aus 20 oder acht Aminosäureresten besteht.Das Alanin-Scanning zeigte, dass Substitutionen von Valinresten an den Positionen 197 und 199 sowie einer Cystinreststelle bei 201 die Bindungsfähigkeit des Epitops und die Dot-Blot-Hybridisierung aufhoben. Ebenso wurde in der Analyse der Bindungsintensität eine verminderte Bindungsaffinität beobachtet, was bestätigt, dass die identifizierten Reste für die Bindung des Epitops an den monoklonalen RGM56-Antikörper essentiell sind. Diese Peptid-Identifizierungstechnik kann zur Entwicklung therapeutischer Peptidarzneimittel oder Peptidmedikamente verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

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