Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop
March 24th, 2017
Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Identifizierung eines monoklonalen Antikörper-erkannten linearen B-Zell-Epitops unter Verwendung von seriell verkürzten rekombinanten Proteinen und Peptid-Scanning durch Dot-Blot-Hybridisierung. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur molekularen Interaktion zwischen Antigen und Antikörper zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre Einfachheit und Effizienz.
Das identifizierende Epitop kann dann in umfassenderen Untersuchungen, wie z. B. in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen, verwendet werden. Das Verfahren wird von Chien-Wen Chen, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Züchten Sie zunächst monoklonale RGM56-Maus-Hybridomzellen in einem freien Hybridserummedium.
Bewahren Sie Zellkulturen in 175-T-Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid auf. Nach fünftägiger Inkubation wird das Kulturmedium aufgefangen, nachdem es gelb geworden ist, und den Überstand 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 4.500 G zentrifugiert. Entsorgen Sie dann die pelletierten Zelltrümmer, um den Antikörper in Lösung zu erhalten.
Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter 50 % Protein G Agro-Gülle in eine Fünf-Milliliter-Säule und äquilibrieren Sie das Harz mit 10 Millilitern eiskaltem PBS, was 10 Volumen vorgeladenem Harz entspricht. Laden Sie 200 Milliliter der zuvor hergestellten Antikörperlösung auf die äquilibrierte Säule und verwerfen Sie die Fraktion, die die Säule passiert. Waschen Sie die Säule mit 10 Millilitern eiskaltem PBS zweimal.
Um den Antikörper aus dem Harz zu entfernen, geben Sie schließlich 10 Milliliter millimolare Glycerinlösung bei einem pH-Wert von 2,7 in die Säule. Sammeln Sie 900 Mikroliterfraktionen in Mikrozentrifugenröhrchen, die zuvor mit 100 Mikrolitern 10X Neutralisationspuffer gefüllt waren. Lagern Sie den gereinigten Antikörper in einer 50%igen Glycerinlösung, die mit Natriumazid bei minus 20 Grad Celsius ergänzt wird.
Bereiten Sie die Konstrukte vor und transformieren Sie E.coli BL21-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie dann eine einzelne Kolonie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern LB-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, und verschließen Sie das Röhrchen locker. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit 150 U/min Schütteln.
Überwachen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn sie etwa 0,6 Grad erreicht, kühlen Sie die Kultur auf 25 Grad Celsius ab. Fügen Sie dann IPTG in einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar hinzu, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren.
Inkubieren Sie die Kultur für weitere vier Stunden bei 25 Grad Celsius und 200 U/min Schütteln. Nach der Inkubation wird ein Milliliter der Bakterienkultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen werden eine Minute lang bei 12.000 G zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Pipettieren Sie das Zellpellet mit einer Mikropipette auf und ab und resuspendieren Sie es in 100 Mikrolitern Denaturierungspuffer. Und mischen Sie die resultierende Suspension durch kräftiges Vortexen, um eine gebrauchsfertige rekombinante Proteinprobe zu erhalten. Um mit der Dot-Blot-Hybridisierung fortzufahren, lösen Sie jedes synthetische Peptid in DMSO auf, um Lösungen von 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten.
Aktivieren Sie dann die PVDF-Membran für zwei Minuten in Methanol und äquilibrieren Sie sie für weitere zwei Minuten mit modifiziertem Towbin-Puffer. Spülen Sie ein Stück Chromatographiepapier mit modifiziertem Towbin-Puffer ab und legen Sie die äquilibrierte PVDF-Membran darauf. Lassen Sie die Membran ruhen, bis der Puffer von ihrer Oberfläche verschwindet.
Geben Sie mit einer 10-Mikroliter-Spitze zwei Mikroliter jeder Peptid- oder rekombinanten Proteinprobe auf die Membran und lassen Sie sie 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Das Aufspüren eines Symbols auf der Membran ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Das Laden einer präzisen Menge einer Probe auf einen kleinen Bereich der PVDF-Membran erfordert besondere Aufmerksamkeit.
Blockieren Sie anschließend die Membran in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch angereichert ist, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verdünnen Sie den monoklonalen Antikörper RGM56 in TBST-Puffer, der mit 5 % fettfreier Milch ergänzt wird. Und fügen Sie die Antikörperlösung zur Membran hinzu.
Inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie nach der Inkubation die Antikörperlösung. Und waschen Sie die Membran zweimal fünf Minuten lang in TBST-Puffer unter leichtem Schütteln.
Geben Sie dann die Lösung des Sekundärantikörpers, verdünnt in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch, zur Membran. Inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Verwerfen Sie nach der Inkubation die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran zweimal fünf Minuten lang unter leichtem Schütteln in TBST-Puffer.
Dann entwickeln Sie die Membran mit der Substratlösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten im Dunkeln. Wenn das Signal erscheint, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Membran mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Nachdem Sie die Membran an der Luft getrocknet haben, nehmen Sie das Dot-Blot-Bild mit einem Bildgebungssystem auf.
Messen Sie schließlich mit Hilfe einer Bildanalysesoftware die Intensität jedes Dot-Blots. Hier wird das Nervennekrosevirus-Code-Protein in voller Länge vorgestellt, das die Aminosäuren eins bis 338 umfasst, zusammen mit seinen seriell verkürzten Varianten. Um die Expression der Proteine in den transformierten Bakterienzellen zu bestätigen, wurde eine Dot-Blot-Analyse mit Anti-6XHis-Antikörpern durchgeführt, die das Vorhandensein aller untersuchten Proteine zeigte.
Anschließend wurden die rekombinanten Proteine durch Dot-Blot-Hybridisierung analysiert, bei der der monoklonale Antikörper RG-M56 verwendet wurde. Die Analyse ergab, dass das vom Antikörper erkannte Proteinepitop in den Peptiden 195 bis 338 zu finden ist. Schließlich wurde ein Epitop, das aus 20 oder acht Aminosäureresten besteht, durch Peptid-Scanning identifiziert.
Alanin-Scans zeigten, dass Substitutionen von Valinresten an den Positionen 197 und 199 sowie von einem Cystin an 201 die Bindungsfähigkeit des Epitops und die Dot-Blot-Hybridisierung aufhoben. In ähnlicher Weise wurde die verringerte Bindungsaffinität in der Bindungsintensitätsanalyse beobachtet, was bestätigt, dass die identifizierten Reste für die Bindung des Epitops an den monoklonalen Antikörper RGM56 essentiell sind. Diese Peptididentifizierungstechnik kann zur Entwicklung therapeutischer Peptidmedikamente oder Peptidmedikamente verwendet werden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Identifizierung eines linearen B-Zell-Epitops, das von einem monoklonalen Antikörper durch Peptid-Scanning und Dot-Blot-Hybridisierung erkannt wird. Die Methode zeichnet sich durch ihre Einfachheit und Effizienz aus, was sie für therapeutische und diagnostische Anwendungen geeignet macht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Biochemie
- Diagnostische Techniken
Hintergrund
- Das Verständnis von Antigen-Antikörper-Interaktionen ist entscheidend in der Immunologie.
- Lineare Epitope spielen eine wichtige Rolle in der Impfstoffentwicklung und Diagnostik.
- Monoklonale Antikörper werden häufig in der Forschung und in klinischen Umgebungen eingesetzt.
- Die Dot-Blot-Hybridisierung ist eine zuverlässige Methode für die Epitop-Kartierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines unkomplizierten Protokolls zur Epitop-Identifizierung.
- Verbesserung des Verständnisses der Antikörper-Erkennung von Antigenen.
- Erleichterung der Verwendung identifizierter Epitope in weiteren Forschungen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von seriell truncierten rekombinanter Proteine.
- Peptid-Scanning durch Dot-Blot-Hybridisierung.
- Wachstum von RGM56 Maus-Monoklonal-Hybridoma-Zellen in serumfreiem Medium.
- Analyse der Antikörper-Bindung an identifizierte Epitope.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung eines linearen B-Zell-Epitops.
- Demonstration der Effizienz und Einfachheit der Methode.
- Potenzielle Anwendungen in therapeutischen und diagnostischen Bereichen.
- Beitrag zum Verständnis von Antigen-Antikörper-Interaktionen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen zuverlässigen Ansatz für die Epitop-Kartierung.
- Identifizierte Epitope können in verschiedenen Anwendungen genutzt werden.
- Diese Methode kann die Forschung in der Immunologie und verwandten Bereichen vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Identifying linear B-cell epitopes is critical for de-risking therapeutic antibody development and informing vaccine design. This peptide scanning approach enables rapid epitope mapping with minimal resource investment, supporting early-stage target validation and lead optimization. The method enhances predictive confidence in antigen-antibody interactions, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining the precise antigenic region recognized by a monoclonal antibody.
- Operational Value: Uses serially truncated recombinant proteins and synthetic peptides to rapidly narrow epitope boundaries to a 6-mer core.
- Predictive Value: Alanine scanning mutagenesis identifies critical binding residues, reducing mechanistic ambiguity in lead candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dot-blot hybridization on PVDF membranes provides a standardized, quantitative readout for epitope-antibody binding.
- Reproducibility: Controlled spotting of 2 µL samples and standardized washing steps ensure consistent signal detection across replicates.
- Scalability: The method accommodates high-throughput peptide screening for epitope fine-mapping and mutagenesis studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Identified epitopes can be used to generate peptide-antibody complexes for structural studies, informing rational vaccine and therapeutic design.
- Preclinical De-risking: Epitope characterization supports assessment of functional relevance and potential for immune escape in viral targets.
- Therapeutic Relevance: Mapped linear epitopes enable development of peptide-based therapeutics or diagnostics with defined mechanisms of action.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, bridging target validation to lead identification by providing epitope-level resolution for antibody-antigen interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through precise mapping of linear epitopes, enabling pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready peptide arrays with quantitative binding outputs for reliable compound or variant evaluation.
- Analytics: Generates binding intensity data from dot-blot imaging, allowing statistical comparison of epitope variants and mutants.
- Translational Research: Connects epitope mapping to structural and functional studies via crystallizable peptide-antibody complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epitope-mapping platform applicable across viral, bacterial, or cancer targets in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by defining essential amino acid residues for antibody binding.
- Operational Value: Offers a simple, efficient workflow requiring only standard molecular biology and blotting equipment.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early go/no-go decisions based on epitope conservation and functionality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antibody leads through defined epitope liability and developability assessments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, peptide synthesis, and immunoblotting techniques.
- Dependent on access to PVDF membranes, dot-blot apparatus, and imaging systems for signal detection.
- Necessitates standardization of sample loading volumes and blocking conditions across teams for reproducible results.
- Adaptation to conformational epitopes may require complementary methods, as the technique primarily maps linear antigenic regions.
- Practical limitations include potential false negatives if epitope conformation depends on post-translational modifications not present in bacterial expression systems.
