Name: Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Lernen Sie die Messung tonischer und phasischer Glutamatänderungen in vivo mit enzymbasierten Mikroelektrodenarrays. Diese Methode ermöglicht präzise, minimal-invasive Überwachung neurochemischer Dynamik im Hippocampus eines Alzheimer-Mausmodells.

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(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR; R15AG045812), Alzheimer-Gesellschaft Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences unterstützt (MNR; NIRG-12-242187), WVU Fakultät Forschungs Senat Grant (MNR) und WVU PSCOR Grants (MNR).

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GG ist der alleinige Inhaber von Quanteon, LLC, die das FAST-16-Aufzeichnungssystem für die Glutamat-Messungen in dieser Studie verwendete machen. JEQ ist ein bezahlter Berater für Quanteon.

Die MEA - Technik ermöglicht die Messung von schnellen Kinetik der Freisetzung von Neurotransmittern und die Aufnahme in vitro und in vivo. Daher erzeugt die Technologie, um eine Vielzahl von Datenausgabe einschließlich tonisch Neurotransmitter Ebenen, evozierte Freisetzung von Neurotransmittern und Neurotransmitter-Clearance. Da jedoch die Verwendung von MEAs ein relativ komplexer Vorgang ist, gibt es zahlreiche Faktoren, die für den erfolgreichen Einsatz optimiert müssen werden. Beispielsweise währen...

Mess Neurotransmitter Veränderungen im Gehirn ist ein wichtiges Instrument für Neurowissenschaftler Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die oft gekennzeichnet durch Neurotransmitter Dysregulation studieren. Obwohl die Mikrodialyse in Verbindung mit Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC / EC) die am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Veränderungen in der extrazellulären Neurotransmitter Stufen 1, 2 war, 3, 4, kann die räumliche und zeitliche Auflösung von Mikrodialysesonden nicht ideal für Neurotransmitter , wie Glutamat, die 6 in dem extrazellulären Raum 5, streng reguliert werden. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Genetik und Bildgebung, gibt es weitere Verfahren , die verwendet werden können , Glutamat in vivo abzubilden. Verwendung von genetisch kodierten Glutamat fluoreszierende Reporter (iGluSnFR) eind Zwei-Photonen - Bildgebung, die Forscher in der Lage , Glutamat - Freisetzung sowohl von Neuronen und Astrocyten in vitro zu visualisieren und in vivo 7, 8, 9. Bemerkenswert ist, ermöglicht dies aus einem größeren Sichtfeld der Aufnahme und nicht die inneren Verbindungen des Gehirns stören. Während diese neuen optischen Techniken zur Visualisierung von Glutamat Kinetik und Messung von sensorisch evozierte Reaktionen und neuronale Aktivität ermöglichen, fehlt ihnen die Fähigkeit, die Menge an Glutamat in den extrazellulären Raum in diskreten Gehirnregionen zu quantifizieren. Ein alternatives Verfahren ist die Enzym-gebundenen Mikroelektroden-Anordnung (MEA), die selektiv extrazellulärem Neurotransmitter Ebene, wie Glutamat, durch die Verwendung eines selbst referenzierten Aufzeichnungsschemas messen kann. Die MEA-Technik wird verwendet, um Veränderungen in der extrazellulären Glutamat nach traumatischem Gehirn zu studieren10 Verletzungen, 11, 12, Alterung 13, 14, Stress 15, 16, Epilepsie 17, 18, Alzheimer-Krankheit 19, 20, und die Injektion eines viralen mimic 21 und stellen eine Verbesserung gegenüber den räumlichen und zeitlichen Beschränkungen , die in Mikrodialyse. Während Mikrodialyse die Fähigkeit , in der Nähe der Synapse zu messen einschränkt 22, 23, MEAs hat eine hohe räumliche Auflösung , die in der Nähe zum selektiven Maßnahmen der extrazellulären Glutamat - Spill - over ermöglicht 24 Synapsen, 25. Zweitens ist die geringe zeitliche Auflösung der Mikrodialyse (1 - 20 min) begrenzt die Fähigkeit, die untersuchenschnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Clearance in Millisekunde 26 bis Sekunden - Bereich auftritt. Da Unterschiede in der Freisetzung oder Clearance von Glutamat nicht in Maßnahmen von Tonika, Ruheglutamatwert offensichtlich sein können, kann es wichtig sein, dass die Freisetzung von Glutamat und Clearance direkt gemessen werden. MEAs ermöglichen diese Maßnahmen aufgrund ihrer hohen zeitlichen Auflösung (2 Hz) und niedrigen Nachweisgrenzen (&lt;1 uM). Drittens erlauben MEAs zur Untersuchung der subregionalen Variationen in Neurotransmittern innerhalb einer bestimmten Hirnregion, wie die Ratte oder Maus Hippocampus. Beispielsweise unter Verwendung von MEAs wir Gyrus dentatus separat ausrichten können (DG), Ammonshorn 3 (CA3) und Ammonshorn 1 (CA1) des Hippocampus, die über eine trisynaptic Schaltung 27 verbunden sind, um subregionalen Unterschiede in extrazellulären Glutamat zu untersuchen. Aufgrund der Größe der Mikrodialysesonden (1 - 4 mm Länge) und der durch Implantation verursachten Schadens 28 &lt;/ sup&gt;, 29, sind subregionalen Unterschiede schwer zu adressieren. Außerdem werden nur die optischen Systeme Stimulation durch externe Reize, wie beispielsweise eine whisker Stimulation oder Lichtflimmern, ermöglichen die nicht subregionalen Stimulation 7 zulässt. Ein letzter Vorteil der MEAs gegenüber anderen Methoden ist die Fähigkeit , diese Subregionen in vivo zu studieren , ohne ihre äußeren und inneren Anschlüsse zu stören. Hier beschreiben wir , wie ein Aufzeichnungssystem (beispielsweise FAST16mkIII) in Kombination mit MEAs, bestehend aus einer auf Keramik basierende Multi - Site - Mikroelektrode, kann differentiell auf den Aufzeichnungs Seiten beschichtet wird , um störende Mittel zu ermöglichen , erfaßt und von dem Analyten - Signal entfernt werden. Wir zeigen auch Diese Arrays können für Amperometrie-basierten Untersuchungen der in vivo Glutamat Vorschrift im DG, CA3 und CA1 Hippocampus - Subregionen von betäubtem RTG (TauP301L) 4510 - Mäuse, ein häufig verwendeter m verwendet werden ,ouse Modell der Alzheimer-Krankheit. Darüber hinaus stellen wir die Bestätigung der Empfindlichkeit des MEA - Systems auf der schnelle Dynamik der Glutamatfreisetzung und Freigabe durch die Mäuse , die mit Riluzol Behandlung, ein Medikament in vitro gezeigt Glutamatfreisetzung zu verringern und Glutamataufnahme 30, 31, 32, 33 zu erhöhen, und zeigt diese jeweiligen Veränderungen in vivo im Maus - Modell TauP301L.

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8-Kanal</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektroden-Arrays</td><td>CenMet</td><td>W4 oder 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (verfällt nach 1 Monat)</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (verfällt nach 6 Monaten)</td></tr><tr><td>Glutamatoxidase</td><td>US Biological oder Sigma Aldrich</td><td>G4001-01 oder 100646</td><td>50 UI (läuft nach 6 Monaten ab)</td></tr><tr><td>Hamilton Spritzen</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 Spritzen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>m-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Referenzelektroden (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 Elektroden</td></tr><tr><td>Batteriebetrieben Magnetisch Rührplatte</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten gekauft</td></tr><tr><td>werden Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dopaminhydrochlorid</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Perchlorsäure</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Postassiumchlorid</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Druckabwurfpipetten aus Glas</td><td>CenMet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klebriges Wachs</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>Kann von einem anderen Lieferanten</td></tr> <tr><td>gekauft werdenMikrospritze</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td>WalMart</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten</td></tr><tr><td>gekauft werden Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht</td><td>AM Systeme</td> <td># 786500</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>AM Systems</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>Lötpistole</td><td>Lowes oder Home Depot</td><td></td><td>Kann von einem anderen Lieferanten gekauft</td></tr><tr><td>werden Multimeter</td><td>WalMart</td><td></td><td>Kann von einem anderen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Kann von einem anderen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Kann von einem anderen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Gerät</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten gekauft</td></tr><tr><td>werden Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Meiji EMZ Mikroskop</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>OP-Schere</td><td>VWR</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten gekauft</td></tr><tr><td>werden Sterile Wattestäbchen</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Puralube Vet Salbe</td><td></td><td>Vom Tierarzt beziehen</td></tr><tr><td>Jodtupfer</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>Lokale Drogerie</td><td></td><td>Kann von einem anderen Lieferanten gekauft</td></tr> werden <tr><td>Steriles OP-Tuch</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>Kann von einem anderen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>Kann mit Filtern</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (3%)</td> eigene Lösung herstellen <td>Lokale Drogerie</td><td></td><td>Kann von verschiedenen Lieferanten kaufen</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>WalMart</td><td></td><td>Kann von verschiedenen kaufen Lieferant</td></tr></tbody></table>

enzym-basierte biosensoren mit tonic und phasic glutamate in der alzheimer-maus-modellen zu messen

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitters Störung ist oft ein wichtiger Bestandteil von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), eine Rolle in der Pathologie spielen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Depression und Angst zu Grunde liegen. Traditionell wurde, Mikrodialyse die häufigste (gelobt) -Technik Neurotransmitter Veränderungen zu untersuchen, die bei diesen Erkrankungen auftreten. Aber weil die Mikrodialyse die Fähigkeit hat, langsam 1-20 Minuten Änderungen über große Bereiche des Gewebes zu messen, hat es den Nachteil, Invasivität, potentiell zerstörte intrinsische Verbindungen im Gehirn und eine langsame Sampling-Fähigkeit. Eine relativ neuere Technik, die Mikroelektroden-Anordnung (MEA), hat zahlreiche Vorteile für die in diskreten Gehirnbereichen spezifische Neurotransmitterveränderungen messen, wie sie auftreten, so dass für eine räumlich und zeitlich präzise Annäherung. Zusätzlich MEAs unter Verwendung minimal - invasiver ist, so dass zur Messung von Veränderungen Neurotransmitter in vivo. In unserem Labor ha wirve speziell interessiert an Veränderungen des Neurotransmitters Glutamat, im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit Pathologie gewesen. Als solches hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um in Glutamat in einem transgenen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit mögliche Hippocampus-Störungen zu beurteilen. Kurz gesagt, verwendet das Verfahren mit einem Enzym, einem Multi-Site-Mikroelektrode beinhaltet das Beschichten sehr selektiv für den Neurotransmitter von Interesse und unter Verwendung von sich selbst verweisende Seiten Hintergrundrauschen und Interferenten zu subtrahieren. Nach der Plattierung und die Kalibrierung kann die MEA mit einer Mikropipette ausgebildet sein und abgesenkt in die Hirnregion von Interesse einer stereotaxische Vorrichtung. Hier beschriebene Verfahren RTG (TauP301L) 4510-Mäuse anästhesiert und beinhaltet eine stereotaxische Vorrichtung unter Verwendung genau Subregionen (DG, CA1 und CA3) des Hippocampus zielen.

Während diese Technologie Änderungen in glutamatergen verwendet werden kann, signalisieren in vielen Arten von Tiermodellen zu messen, wie traumatische Hirnverletzung, Alter, Stress und Epilepsie, hier zeigen wir, wie die MEA-Technologie verwendet werden kann glutamatergen Veränderungen in transgenen Mausmodell zu untersuchen menschlicher Tauopathie 19, 20. Die RTG (TauP301L) 4510 Maus drückt die P301L Mutation in Tau mit frontot...

Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, tonische und phasische extrazelluläre Glutamatveränderungen in vivo mithilfe enzymgekoppelter Mikroelektrodenarrays zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, ob die extrazellulären Neurotransmitterkonzentrationen sowie die schnellen Dynamiken von Neurotransmitterfreisetzung und -eliminierung in Krankheitszuständen verändert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Mikroelektrodenarrays spezifische Neurotransmitterveränderungen in abgegrenzten Hirnregionen erfassen können, wodurch sie ein räumlich und zeitlich präzises, gleichzeitig aber minimalinvasives Verfahren darstellt.Die Durchführung des Verfahrens wird von Holly Hunsberger und Ryan Heslin aus meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie ein Paar Aufzeichnungsstellen auf einer MEA mit dem gewünschten Enzym und ein anderes Paar Aufzeichnungsstellen mit der inaktiven Proteinmatrix beschichten. Anschließend saugen Sie die Glutamat-Oxidase oder die Proteinmatrix mit einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze auf.Drücken Sie den Kolben vorsichtig, um eine kleine Tro

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Transgene (Tg) Mausmodellen der Alzheimer bieten eine ausgezeichnete Gelegenheit, um zu untersuchen, wie und warum Aß oder tau-Spiegeln im Liquor ändern, wenn die Krankheit fortschreitet bei menschlichen Patienten. Hier zeigen wir eine raffinierte Cisterna magna Punktionstechnik für serielle CSF Probenahme aus die Maus.

Eine Technik für Serial Sammlung von Liquor aus der Cisterna Magna in Maus

Einer der pathologischen Merkmale von AD ist die Bildung von Amyloid β Protein positive neuritischen Plaques. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Methoden, um neuritischen Plaques in transgenen AD-Modell-Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit Thioflavin S-Färbung.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

In diesem Video wird ein mit Glutamatoxidase beschichtetes Multielektrodenarray (MEA) in das Hirngewebe einer anästhesierten Maus implantiert. Die Glutamatlösung wird in den extrazellulären Raum injiziert, wo das MEA den Glutamatspiegel detektiert, was eine Echtzeitüberwachung der Glutamataufnahme durch die Astrozyten ermöglicht.

In-vivo-Echtzeit-Überwachung von Glutamat mit einem enzymbeschichteten Mikroelektrodenarray

Hier beschrieben handelt es sich um einen inszenierten, Verhaltens-Screening-Ansatz, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu sehen, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Diese Methoden sind optimiert, um Verbindungen für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicheraufgaben zu screenen.

Assessment of Spontane Alternation, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenverkürzung in transgenen Mausmodellen der Amyloid-β- und Tau-Neuropathologie

Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.

Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung von in vitro Ca2+ Flussflüssen in Midbrain-Neuronen und deren nachgelagerten Auswirkungen auf Caspase-3 unter Verwendung primärer Maus-Midbrain-Kulturen vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormalen Ca2+ Aktivität in Midbrain Neuronen zu studieren, und um neue Therapeutika für anti-apoptotische Eigenschaften zu überprüfen.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Beurteilung von Dosis-Wirkungs-Kurven für extrakranielle Stimulation in Bezug auf elektrische Feldmessungen des Gehirns und einen relevanten Biomarker-zerebralen Blutfluss. Da bei diesem Protokoll eine invasive Elektrode in das Gehirn eingeführt wird, ist eine Vollnarkose erforderlich, wobei die Spontanatmung der kontrollierten Atmung vorgezogen wird.

[Platzierung von extrakraniellen Stimulationselektroden und Messung des zerebralen Blutflusses und intrakranieller elektrischer Felder bei anästhesierten Mäusen

Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der...

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Wir haben festgestellt, Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie (PVL), die vorherrschende Hirn-Trauma bei Frühgeborenen durch periventrikulären Läsionen der weißen Substanz gekennzeichnet. Hypoxie / Ischämie mit / ohne systemische Infektion sind die primären Ursachen der PVL. Einseitige carotis Ligation und Hypoxie Exposition mit / ohne Lipopolysaccharid Injektion schafft PVL-Läsionen in P6 Mäusen.

Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie

Lernen Sie die Messung tonischer und phasischer Glutamatänderungen in vivo mit enzymbasierten Mikroelektrodenarrays. Diese Methode ermöglicht präzise, minimal-invasive Überwachung neurochemischer Dynamik im Hippocampus eines Alzheimer-Mausmodells.

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

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