Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, tonische und phasische extrazelluläre Glutamatveränderungen in vivo mit Hilfe von enzymgekoppelten Mikroelektroden-Arrays zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. ob der Spiegel extrazellulärer Neurotransmitter und die schnelle Dynamik der Freisetzung und Beseitigung von Neurotransmittern in Krankheitszuständen verändert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Mikroelektroden-Arrays spezifische Neurotransmitterveränderungen in diskreten Hirnregionen messen können, was sie zu einem räumlich und zeitlich präzisen Ansatz macht, der gleichzeitig minimalinvasiv ist.

Das Verfahren wird von Holly Hunsberger und Ryan Heslin aus meinem Labor vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, beschichten Sie ein Paar Aufzeichnungsstellen auf einem MEA mit dem gewünschten Enzym und ein anderes Paar von Aufzeichnungsstellen mit der inaktiven Proteinmatrix. Ziehen Sie dann die Glutamatoxidase oder Proteinmatrix mit einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze auf.

Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um eine kleine Kugel der Lösung an der Spritzenspitze abzugeben. Um die MEA-Aufnahmestellen unter einem Präpariermikroskop zu erreichen, tragen Sie die Lösung auf die entsprechenden Aufnahmestellen auf, indem Sie die Aufnahmestellen kurz mit dem Lösungströpfchen in Kontakt bringen, das eine Schicht darstellt. Stellen Sie einen Timer auf eine Minute zwischen dem Auftragen der Beschichtung auf die Aufnahmeorte ein.

Platzieren Sie nun die Referenzelektrode durch die Öffnung im Kunststoffarm. Senken Sie die Referenzelektrode in ein PBS-haltiges Becherglas ab und stellen Sie sicher, dass sie nicht mit dem Boden des Becherglases in Berührung kommt. Verbinden Sie als Nächstes die Referenzelektrode mit dem Kopftisch und verbinden Sie die MEA mit der mPD-Beschichtung mit dem Kopftisch.

Senken Sie das MEA in das Becherglas mit der Lösung, so dass nur die MEA-Spitze in die Lösung getaucht wird. Tauchen Sie die MEA-Spitze nicht über die schwarze Blase hinaus in Flüssigkeit. Andernfalls kann die MEA beschädigt werden.

Wählen Sie dann das Galvaniksymbol auf dem Desktop aus. Überprüfen Sie im Menü des Galvanikwerkzeugs, ob die richtigen Einstellungen eingegeben wurden. Wählen Sie anschließend Software beenden, um die Galvanisierung abzuschließen.

Spülen Sie die mPD-beschichteten Elektrodenspitzen mit DI-Wasser ab und lagern Sie sie 24 Stunden lang, bevor Sie sie kalibrieren. Schalten Sie bei diesem Vorgang ein Heizkissen bei 37 Grad Celsius ein und verbinden Sie die Kopfstufe mit dem Aufnahmesteuerungssystem. Führen Sie dann die MEA-Spitze in 40 Milliliter gerührtes 0,5 molare PBS ein.

Verbinden Sie als Nächstes die Referenzelektrode mit dem Kopftisch. Bewegen Sie die Spitze der Referenzelektrode, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Öffnen Sie danach das Aufnahmeprogramm, stellen Sie sicher, dass die Einstellungen korrekt sind, wählen Sie die MEA-Nummer, klicken Sie auf Kalibrierung und drücken Sie Start.

Warten Sie fünf bis 10 Minuten für die Äquilibrierung und beginnen Sie mit der Kalibrierung, sobald sich die Basislinie stabilisiert hat. Wählen Sie als Nächstes Baseline und fügen Sie 500 Mikroliter Ascorbinsäure hinzu. Wählen Sie dann Interferent, sobald die Strömung ein neues stabiles Plateau erreicht hat.

Wenn die MEA ordnungsgemäß galvanisiert ist, sollte keine Veränderung festgestellt werden. Fügen Sie als nächstes 40 Mikroliter 20 millimolare L-Glutamat hinzu. Sobald die Strömung ein neues stabiles Plateau erreicht hat, markieren Sie die erste Zugabe als Analyt.

Wiederholen Sie dies dreimal für insgesamt drei Glutamat-Zusätze. Fügen Sie dann 40 Mikroliter Dopamin hinzu. Wählen Sie Testsubstanz aus.

Fügen Sie anschließend 40 Mikroliter Peroxid hinzu. Wählen Sie Prüfsubstanz aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist. Platzieren Sie in diesem Schritt die Mikropipette mittig zwischen allen vier Platin-Aufnahmestellen und montieren Sie sie 50 bis 100 Mikrometer über dem MEA mit Klebewachs und Modelliermasse

Klemmen Sie mit einem Gleichstromadapter den roten Plusdraht an den vorbereiteten Silberdraht auf der Goldstiftseite und den schwarzen Minusdraht an die Platinbadkathode. Schließen Sie als Nächstes den Gleichstromadapter an und suchen Sie nach dem richtigen Beschichtungsprozess. An der Badelektrode sollten Blasen erscheinen, und die Referenzelektrode sollte eine silbergraue Farbe annehmen.

Setzen Sie bei diesem Verfahren das Tier in das stereotaktische Gerät und verwenden Sie die Ohrstangen, um seinen Kopf zu stabilisieren. Stellen Sie sicher, dass das Tier gesichert ist und sich der Kopf nicht bewegt. Tragen Sie dann die Augensalbe mit einem sterilen Baumwollapplikator auf.

Rasieren Sie danach den Kopf mit einem Trimmer. Und entfernen Sie das Fell in der Nähe der Ohren mit einer kleinen chirurgischen Schere. Tragen Sie anschließend abwechselnd Jod und dann Alkohol auf die Kopfhaut auf.

Machen Sie anschließend einen Schnitt in der Mitte der Kopfhaut und verteilen Sie die Haut. Saugen Sie das Blut mit einem sterilen Wattestäbchen auf und tragen Sie Wasserstoffperoxid auf, um das Auftreten von Bregma und Lambda zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass der Kopf richtig positioniert ist, indem Sie die dorsal-ventrale und medial-laterale Haltung von Bregma und Lambda messen.

Setzen Sie die Koordinaten bei bregma auf Null und markieren Sie die Zielkoordinaten. Bohren Sie als Nächstes um die Markierung herum. Befestigen Sie anschließend den MEA an der Kopfstufe.

Füllen Sie die Pipette mit der ersten gewünschten Lösung. Achten Sie darauf, einen Spalt in der Pipette ohne Lösung zu lassen, damit die auszustoßende Lösung untersucht werden kann. Befestigen Sie dann den Schlauch an der Glasmikropipette.

Suchen Sie nach Bregma mit angehängter MEA und setzen Sie die Koordinaten auf Null. Bewegen Sie den MEA auf die gewünschten Koordinaten und senken Sie den MEA langsam ab, bis die Spitze das Gehirn berührt. Als nächstes setzen Sie die dorsal-ventrale Koordinate auf Null und senken dann langsam die MEA in das Gehirn ab.

Platzieren Sie die Referenzelektrode an einem vom MEA entfernten Ort, so dass sie noch in flüssigem Kontakt mit dem Gehirn steht, um den Schaltkreis zu schließen. Klicken Sie im Aufnahmeprogramm auf die gewünschte kalibrierte Elektrode und dann auf Experiment durchführen, um die Aufnahme zu starten. Nachdem Sie eine stabile Ausgangslinie erreicht haben, stellen Sie den Druckauswerfer auf 0,6 Sekunden und 0,5 psi ein und drücken Sie den roten Knopf am Druckauswerfer, um ihn auszuwerfen.

Notieren Sie die Zeit und den Druck sowie die auf dem Injektionsbogen bewegten Lautstärkestriche und machen Sie sich bei Bedarf Notizen. Entfernen Sie danach die MEA mit der daran befestigten Mikropipette, spülen Sie sie mit DI-Wasser ab und weichen Sie sie über Nacht in PBS ein, bis das gesamte Blut verschwunden ist. In den CA3- und CA1-Regionen des Hippocampus waren die tonischen Glutamatspiegel bei den mit Vehikel behandelten TauP301L-Mäusen signifikant erhöht, ein Effekt, der durch die Behandlung mit Riluzol abgeschwächt wurde.

Hier zeigten die zu Studienbeginn übereinstimmenden repräsentativen Aufzeichnungen der Kaliumchlorid-evozierten Glutamatfreisetzung im CA3-Virus, dass die Behandlung mit Riluzol den signifikanten Anstieg der Amplitude der Glutamatfreisetzung, der bei Vehicle-TauP301L-Mäusen beobachtet wurde, abschwächte. Die lokale Anwendung von Kaliumchlorid führte zu einem robusten Anstieg des extrazellulären Glutamats, das schnell wieder auf tonische Werte zurückkehrte. Die signifikant erhöhte Kaliumchlorid-induzierte eine Glutamatfreisetzung in den DG-, CA3- und CA1-Mäusen, die bei den mit Vehicle behandelten TauP301L-Mäusen beobachtet wurde, nachdem die lokale Applikation von Kaliumchlorid mit Riluzol-Behandlung abgeschwächt wurde.

Dieser kresylviolett gefärbte Schnitt des Hippocampus bestätigt die Lokalisierung von MEA-Spuren in CA3 und CA1. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich an die Schritte zur Fehlerbehebung zu erinnern, die im Manuskript aufgeführt sind. Um beispielsweise verrauschte Signale zu reduzieren, denken Sie daran, das System zu erden und die Schritte rechtzeitig zu befolgen.