Name: Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf A. fumigatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Lernen Sie die Live-Imaging-Methode zur Untersuchung antifungaler Aktivität humaner primärer Neutrophiler und Monozyten gegenüber Aspergillus fumigatus. Dieses Protokoll ermöglicht Echtzeit-Analysen von Phagozytose und Immunantwort.

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Medizinische Mykologie Pilz Immunologie (SFB, JMB, JK, AW) - Diese Arbeit wurde von der MRC und die University of Aberdeen (MRC Zentrum für Medizinische Mykologie) und vom Wellcome Trust Strategic Auszeichnung unterstützt. Ein ganz besonderer Dank an die Unterstützung der Chloe Fonds gegeben. TMH wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Health (NIH, Code RO1 093.808) und das Memorial Sloan Kettering Cancer Center wird unterstützt von NIH Zuschuss P30 CA008748 unterstützt. Darüber hinaus ist TMH ein Ermittler in der Pathogenese von Infektionskrankheiten durch den Fond Burroughs Wellcome unterstützt. Wir wünschen der Aberdeen Mikroskopie und Histologie Einrichtung für ihre Hilfe und Unterstützung danken.

Das Protokoll für 9 basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden Neutrophilen und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) zu erhalten. Die Verwendung von Blutproben von gesunden Freiwilligen wird durch die menschliche Forschungsethikkommission der Universität von Aberdeen genehmigt. sicherzustellen, dass alle ethischen Genehmigungen sind an Ort und Stelle für die Erstellung Blut von gesunden Probanden und / oder Patienten zum Zweck des beschriebenen Experiments vor dem Start. Halten Sie Zellen auf Eis, wo möglich, um ihr Überleben zu erhöhen. 1. A. fumigatus , Kultur und Bedingungen <ol><li> Bereiten Glukose Minimalagarmedium als 10 beschrieben. <ol><li> Justieren Medien auf pH 6,5 unter Verwendung von 1 M NaOH und Autoklaven bei 120 ° C für 20 min. </li><li> Lassen Sie auf 65 ° C abkühlen lassen. </li><li> Arbeiten in einem Sterilströmungshaube, gieße 30 ml gekühltem Medien in einen T75-Kolben gegeben und ermöglichen, mit dem Hals des Kolbens ruht auf einer 25 ml Pipette C abkühleneine agar Steigung reate. </li></ol></li><li> Streak aus dem dsRed Af293- A. fumigatus - Stamm auf dem Agar und Inkubation für 7 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2. Zwei Kolben werden Ausbeute etwa 10 9 Konidien in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pre-Biotinylierung. </li></ol> 2. A. fumigatus Kennzeichnung und Vorbereitung Hinweis: Wenn dieses Assays zum ersten Mal durchgeführt wird , bereitet den parentalen Af293- A. fumigatus - Stamm. Nehmen Proben beiden Stämme in Mikrozentrifugenröhrchen und Etikett nur eine von jedem Stamm, wie unten beschrieben. Dies ermöglicht eine Kontrolle Konidien ohne Farbe und Konidien mit einer einzigen Farbe zu haben, entweder dsRed oder AF633, die Einrichtung und Ausrüstung zu testen. <ol><li> Ernte A. fumigatus Konidien durch Eintauchen der Kultur mit 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtriere die sich ergebende Suspension durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb in ein 50 ml-Röhrchen Hyphenfragmente zu entfernen. </li><li> Centrifuge bei 805 × g für 10 min, entfernen Sie den Überstand und wasche einmal in 20 ml sterilem PBS. Pool Konidien von zwei Platten des gleichen Stamms während des Waschschrittes. </li><li> Nach dem Waschschritt wird das Pellet in 5 ml PBS und 1 ml Aliquots Übertragung von Konidiensuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der Suspension von jedem Stamm ist in der Regel ausreichend für die Abbildung lebender Zellen. Wickeln der verbleibenden Aliquots in Folie und lagere bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Aliquoten Konidiensuspension bei 9.300 xg für 10 min bei Raumtemperatur und sorgfältig entfernen Überstand. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml 0,05 M NaHCO 3 pH 8,3. </li><li> Herstellung von 10 mg Biotin / 200 &amp; mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) Stammlösung wird durch Rekonstitution 25 mg Biotin in 500 ul DMSO. Zugabe von 10 &amp; mgr; l Biotin / DMSO Stammlösung zu den Mikrozentrifugenröhrchen, Abdeckung in Aluminiumfolie und Inkubation für 2 h auf einem Schüttler bei 4 ° C. <ol><li> Aliquot den Rest des Biotin / DMSO Lager solution und frieren bei -20 ° C für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten. </li></ol></li><li> Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 für 1 h freischwebenden Biotin zu deaktivieren. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 ml sterilem PBS gewaschen und das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert. </li><li> Man löst 1 mg Streptavidin-AF633 in 0,5 ml PBS eine 2 mg / ml Stammlösung herzustellen. Zugabe von 10 ul 2 mg / ml Streptavidin-AF633 pro 1 ml Konidiensuspension und Inkubieren auf einem Schüttler für 40 min bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie abgedeckt. Die verbleibende Streptavidin-AF633 kann für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten in Aliquots eingefroren werden. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 9.300 xg und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Konidien Pellet in 1 ml PBS und die Konidien eines Hämozytometers zählen bei einer 1: 1.000-Verdünnung (1: 100 und 1:10). Stellen Sie die Konidien Konzentration auf 3,6 x 10 6 / ml mit CO 2 unabhängige Medien, wickelt in der Folie und bei 4 ° C. HINWEIS: Die Konidien sind nun mit AF633 markiert und wird als FLARE Konidien bezeichnet werden. </li><li> Optional: Wenn die Stimulation mit geschwollenen Konidien erforderlich ist, nach den Konidien (Schritt 2,9) zu zählen, verdünnte Konidien bis 7,2 x 10 6 / ml in Hefe - Stickstoff - Basis (YNB) Medium und 500 &amp; mgr; l Konidiensuspension auf 4,5 ml YNB - Medium in einem 50 autoklaviert fügt ml Erlenmeyerkolben. Abdecken und der Kolben wird in einem Schüttelinkubator (200 UpM bei 37 ° C) für 6 Stunden. <ol><li> Übertragen, um das Medium in ein 15 ml Röhrchen. Zentrifuge bei 805 × g für 10 min bei Raumtemperatur und einmal in PBS waschen. Zentrifuge wieder und Pellet in 1 ml CO 2 unabhängige Medium, was 3,6 x 10 6 Konidien / ml. Hinweis: Die Konidien oft verklumpen , nachdem sie schwellen an, um genaue Zählen schwierig, es wird empfohlen , mit dem c zu berechnenounted Zahlen von Conidien verwendet ruht. </li></ol></li></ol> 3. Isolierung von Human-Neutrophilen und Monozyten <ol><li> Zeichne 20 ml venöses Blut von gesunden Freiwilligen in zwei 10 ml Blutröhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Für jeden Spender getrennt, gieße 20 ml Blut in ein 50 ml Röhrchen und verdünnt mit 15 ml PBS. </li><li> Unterlags das Blut mit 15 ml einer Lymphozytenisolationslösung (Dichte 1,077 g / ml) mit einer Spritze und Nadel Eisen. Platzieren Sie die Nadel am Boden des Röhrchens und sanft die Lymphozytenisolationslösung herauszudrücken. Zentrifuge bei 630 × g für 20 min ohne Bremse und niedrige Beschleunigung. </li><li> Bereiten PBS, auf Eis gekühlt. Hinweis: Die Schritte 3.4 und 3.5 müssen gleichzeitig verfolgt werden Monozyten (3.4) und Neutrophile (3,5) zu erzeugen. </li><li> Mit Hilfe eines pastette, ernten die PBMC Schicht. Dies ist die Schicht, in der Mitte zwischen dem gelben Serum (oben) und der transparenten Isolationslymphozytenlösung (unterer) Schicht, undTransfer in ein frisches 50-ml-Röhrchen. <ol><li> Füllen des Röhrchens mit der PBMC von bis zu 50 ml mit kaltem PBS und Zentrifugation bei 582 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht zweimal mit kaltem PBS und Resuspendieren in 1 ml PBS pro 20 ml Spenderblut verwendet, zunächst. </li><li> Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 &amp; mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer. </li><li> Vorbereiten einer Pufferlösung durch Zugabe von 26 ml hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und 2,1 ml 0,5 M EDTA auf 500 ml HBSS. Zentrifugieren der Zellen für 10 min bei 515 xg und Resuspendieren in 40 ul Pufferlösung pro 1 x 10 7 Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml - Röhrchen und füge 10 ul CD14 Microbeads pro 1 x 10 7 Zellen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C, um sicherzustellen , die Rohre alle 5 min zu mischen. </li><li> Wasche die Zellen durch Zugabe von 1 ml Pufferlösung pro 1 × 10 7 Zellen und centrifuge bei 515 xg für 10 min. </li><li> Aspirat Überstand vollständig und resuspendieren bis zu 1 x 10 8 Zellen in 500 ul Pufferlösung. </li><li> Platzieren 1 Spalte pro Probe auf einem Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zuerst waschen Sie die Säule einmal mit 500 &amp; mgr; l Pufferlösung. </li><li> Pipette, um die 500 &amp; mgr; l der Zellsuspension durch die Säule, warten Sie auf die Säule, um zu trocknen und dann waschen durch Wiederholen dieses dreimal mit Pufferlösung. </li><li> Ein neues 15-ml-Röhrchen unter der Säule und nehmen die Säule aus dem Magnetabscheider. spült dann die Zellen aus der Säule in das Röhrchen mit 1 ml Pufferlösung. </li><li> 4 ml Pufferlösung und Zentrifugieren bei 515 xg für 10 min und dann Resuspendieren in 1 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium. </li><li> Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 &amp; mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zählen der Zellen mit einemHämozytometer. </li><li> Stellen Sie die Zellkonzentration auf 6 x 10 5 / ml mit RPMI und 200 ul auf einem 35 mm Glasbasis Abbildungs dish Samens. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren , mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, vor der Bilderzeugung, entfernen Sie das RPMI und 200 &amp; mgr; l Medium unabhängig CO 2 hinzuzufügen. Hinweis: Diese Monozyten können auch in verschiedene Untergruppen Makrophagen vor der Bildgebung zu unterscheiden. Wenn dies eine Technik erforscht wird, ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt die jüngste Arbeit von Ohradanova-Repic et al. 1 1. </li></ol></li><li> Nach der PBMC Schicht Ernte, entfernen Sie alle aus dem Serum und den größten Teil der Lymphozyten-Isolationslösung, aber darauf achten, nicht die kleinen weißen Band auf dem roten Pellet zu entfernen, wie dies die meisten der Neutrophilen enthalten wird. <ol><li> Vorbereiten eines 10x hypotonen Lysepuffers Lager durch Zugabe von 83 g NH 4 Cl und 10 g KHCO 3 in 1 l sterilem Wasser. Lagerung bei 4 °C. </li><li> Verdünnte dieses Lager 10x mit sterilem Wasser und gibt es an die Rohre. Dann vorsichtig 3 mal umdrehen und 15 min in Eis inkubiert. </li><li> Zentrifuge bei 394 × g für 10 min und resuspendieren in hypotonischen Lysepuffer für 10 min in Eis. </li><li> Zentrifuge bei 394 × g und wäscht zweimal mit kaltem PBS. Resuspendieren in 1 ml CO 2 unabhängigen Medium pro Spender. </li><li> Machen 01.10 Verdünnungen für das Zählen durch Zugabe von 20 &amp; mgr; l der Zellsuspension zu 160 ul PBS und 20 ul Trypanblau. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer. </li><li> Für die Durchflusszytometrie, passen um die Konzentration auf 6 x 10 5 / ml , und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen 400 &amp; mgr; l Zellsuspension hinzu. Für die Mikroskopie, mit 200 ul der gleichen Zellsuspension auf eine 35 mm Glasbasis Abbildungs ​​Schale. Hinweis: Neutrophile Bildgebung oder Durchflusszytometrie sofort eingeleitet werden soll , aufgrund ihrer Neigung , die Apoptose zu unterziehen , wenn nicht stimuliert gelassen. Wenn dies nicht möglich ist, sollte Neutrophilen auf haltenEis und so schnell wie möglich (am selben Tag) verwendet. </li></ol></li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Füge 200 &amp; mgr; l von 1,2 x 10 6 / ml FLARE Konidien zu den Zellen in 24-Well - Platte, und fügen Sie dann 100 ul von 20 ug / ml Voriconazol. Fügen 300 ul RPMI und Inkubation für 16 h bei 37 ° C mit 5% CO 2. HINWEIS: Voriconazol wird hinzugefügt konidiale Keimung zu verhindern. </li><li> Zugabe von 25 &amp; mgr; l einer 1 mM Calcofluor-white - Stammlösung in jede Vertiefung für eine Endkonzentration von 25 &amp; mgr; M und Inkubation für 10 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Zentrifuge bei 582 × g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wasche zweimal mit PBS. </li><li> Zur Ernte adhärente Zellen (Monozyten), 1 ml von PBS mit 3 mM EDTA zu jeder Vertiefung und Inkubation für 10 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. Zellen sanft wasche die Platte durch Abpipettieren und Zellen in ein Röhrchen sammeln. </li><li> Wasche einmal in FACS-Puffer (2% fötalem Kälberserum zu PBS), und dann in FACS-Puffer für die FACS-Analyse resuspendieren. <ol><li> Für die FACS-Analyse zunächst die Kompensationsparameter des Durchflusszytometers justieren und positive Gattern einfarbige Kompensationsrohre verwenden, einschließlich Konidien eingestellt ohne Farbe: dsRed + Konidien, AF633 + Konidien und Calcofluor White + Konidien (erzeugt, wie in 4.2). </li><li> Befreit Konidien Gate basiert auf Vorwärts- und Seitenstreuung mit Konidien ohne Farbe. Stellen Sie Zell-Gate auf Vorwärts- und Seitenstreuung durch das freie Konidien Tor auszuschließen. </li><li> Analysieren Probenröhrchen von 10.000 Ereignisse aufgezeichnet werden. Hinweis: Zellen mit Live-Konidien zugeordnet werden + und AF633 + dsRed werden. Zellen mit toten Konidien verbunden sind, werden nur AF633 + sein. Bystander-Zellen, die Sporen nicht beschäftigt haben, werden dsRed- und AF633- sein. Die Konidien-Eingriff-Zellpopulationen sind weiter für Calcofluorwhite Färbung auf dem Pacific Blue Kanal analysiert. Konidien, die außerhalb der Zellen bleiben Calcofluorwhite + und Konidien, die verinnerlicht haben wirdCalcofluor White-. </li></ol></li></ol> 5. Live Cell Videomikroskopie Anmerkung: Die Wahl des Mikroskops auf hängt, was lokal verfügbar ist, aber der Mikroskopaufbau benötigt eine invertierte Phase umfassen, eine Klimakammer erhitzt auf 37 ° C und eine geeigneten Anregungs- / Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 (633 nm). FLARE Konidien arbeiten nicht mit dem 488-nm-Laser anstelle des 532/561-nm-Laser für dsRed. Wenn sie für dieses erste Mal dieses Experiment durchzuführen, verwenden Sie die Steuer Konidien ohne Farbe und einfarbigen für Hintergrundfluoreszenz zu testen und Durchbluten zwischen den dsRed und AF633 Kanälen. <ol><li> Einschalten des Mikroskops Erhitzer vor dem Experiment und ausreichend Zeit für die Umgebungssteuerkammer auf 37 ° C zu erwärmen. Die Zeit für die Kammertemperatur zu stabilisieren genommen werden für die verschiedenen Mikroskopaufbauten variieren. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und loAnzeige der Bildbearbeitungssoftware. Montieren Sie die Imaging-Schale auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus der menschlichen Neutrophilen oder Monozyten zu finden. </li><li> Für dsRed und AF633, stellte die Laserleistung auf 10% und die Belichtungszeit auf 1 s in den Erfassungseinstellungen. </li><li> Entfernen des Abbildungsschiebers und mit 100 ul 3 x 10 6 / ml FLARE Konidiensuspension in den entsprechenden Vertiefungen (Gesamtvolumen 300 &amp; mgr; l / Well). Notieren Sie sich die Zeit, die Konidien FLARE werden in die Schale gegeben. </li><li> Bringen Sie den Schieber auf die Bühne und stellen Sie die Empfindlichkeit der Kamera für dsRed und AF633 zu deutlich die Konidien zu sehen, aber nicht das Bild überbelichten. Legen Sie eine Stufe Punkteliste, wenn Mehrpunkterfassung erforderlich ist. </li><li> Abbilden beginnen, wenn alle Punkte im Fokus sind, werden die Kanäle optimiert und die Zykluszeit und Dauer eingestellt. Zykluszeit und Dauer der Bildgebung hängt von der experimentellen Frage. Das Ziel ist es, die Zykluszeit so kurz wie möglich (≤2 min) zu halten, mit 1 min so dass für eingehende Analyse von UPTake Dynamik. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Methode beschreibt ein innovatives Verfahren in vitro die antimykotische Aktivität von humanen primären Phagozyten gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Konidien, lebender Zellen und Durchflusszytometrie zu studieren. Frühere Studien haben den zusätzlichen Nutzen der Verwendung von FLARE Konidien sowohl in vivo in murine experimentelle Pilzinfektion und in vitro - Bewertung der antifungalen Immunität 6, 7 gezeigt. FLARE Konidien mit dieser nächsten Generation lebenden Zellen Bildgebungstechnik der Kombination ermöglicht ein Setup - Lebensfähigkeit einzelner Konidien während der dynamischen Interaktionen in vitro zu messen. Das beschriebene Verfahren hat das Potential, die spezifischen Aufgaben und Bedeutung bestimmter zellulärer Prozesse der Immunzellen auf ihren Anti-Pilz-Reaktionen zu untersuchen. Darüber hinaus Anti-Pilz-Antworten von Phagozyten von bestimmten Patienten, die andefiniert einzelne Komponentenfehler in ihrem Immunsystem genauer beurteilt werden. Schon sehr früh und erste Anti-Pilz-Antworten können sehr detailliert über 6 h der kontinuierlichen Bildgebung untersucht werden. Dies ermöglicht auch feine Unterschiede 12 erfasst wird , wie beispielsweise die Geschwindigkeit von Phagozyten Migration in Richtung des Pilzes, Internalisierung Raten, Dynamik von fungiziden Ereignisse werden, die ununterscheidbar mit Verfahren herkömmlicher Phagozytose wäre. Jeder Zelltyp kann mit diesem Verfahren verwendet werden; die Zelltypen hier verwendet wurden ausgewählt , weil diese Phagozyten die erste und die zweite Linie der Verteidigung in den menschlichen Atemwege gegen A. fumigatus 13 bilden. Interessanterweise sehr deutliche Unterschiede zwischen, wie Monozyten und Neutrophilen Eingriff mit Rast- und geschwollen Konidien und Hyphen beobachtet werden. Monozyten wandern kaum zu Konidien, während Neutrophilen viel mehr wandernde Aktivität. Zusätzliche Fluoreszenz markers wie auf Immunzellen Live-dead - Marker können in dem Test aufgenommen werden Einblicke in die Phagozyten Überleben mit Aspergillus folgenden Wechselwirkungen zu liefern. Interessante mögliche zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind die Co-Kultur von verschiedenen Wirtszelltypen, die Folgen für die Anti - Pilz - Reaktionen (zB Makrophagen auf einer epithelialen einschichtige, Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen zusammen mit neutrophilen Granulozyten) und der Echtzeit - Messung von reaktiven Sauerstoffspezies Produktion oder neutrophil extrazellulärem trap Bildung mit Aspergillus nach Stimulation. Einige Punkte sind zu beachten, um dieses Protokoll zu verwenden, in erster Linie den Laboraufbau benötigt: ein Mikroskop mit einer invertierten Phase, eine Klimakammer stabil bei 37 ° C, und den Anregungs- / Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 ( 633 nm). Die Fähigkeit des Mikroskops der Zellen im Fokus zu halten und das Eintauchen in Öl (besonders relevant bei m behaltenulti Punkterfassung) sollte in regelmäßigen Abständen aufgrund der langen Dauer der Bildgebung überwacht werden. Zur Quantifizierung der fungiziden Wirkung Durchflusszytometrie Einrichtungen erforderlich sind. Außerdem müssen geeignete institutionelle und ethische Genehmigungen vorhanden sein, mit gesunden Spendern und Patienten abgeleitet Blutproben und genetisch manipulierten Pilzen zu arbeiten. Es wird dringend die Verwendung frischer Blutproben (Verwendung am selben Tag) zu erhöhen, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Erhaltung Funktionalität empfohlen. Im Idealfall ist die Isolierung von Zellen durchgeführt, unmittelbar nachdem die Blutproben Zeichnung und Neutrophile werden unmittelbar nach der Isolierung abgebildet. Abschließend wird eine nächste Generation Lebendzellabbildungstechnik in großer Detail Phagozyten antimykotische Aktivität zu beurteilen , gegen A. fumigatus beschrieben. Diese Technologie kann einen einzigartigen Einblick in einzelne Zell-Pilz-Interaktionen in der frühen angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus bereitzustellen.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilzpathogens und die häufigste Pilz Ursache für invasive Lungeninfektionen bei immungeschwächten Wirt 1, 2. Zu verstehen , wie Host - Immunzellen erkennen und beseitigen Aspergillus ein wichtiger Bereich der Pilzforschung hat jedoch das derzeit verfügbare fungizide Assays erhebliche Einschränkungen. Colorimetrischen Assays und die Bestimmung der koloniebildenden Einheiten 3, 4 üblicherweise verwendete Methoden umfassen fungizide Aktivität zu messen. Allerdings bieten solche Methoden Informationen über Pilz-Lebensfähigkeit an einem einzigen Zeitpunkt, anstatt die dynamische Interaktion zwischen Wirt und Pathogen sehen. Dementsprechend können diese Verfahren nicht berücksichtigt, ob ein Pilz getötet wurde oder einfach (vorübergehend) beschränkt in Wachstum oder metabolische Aktivität. Wir haben ein Verfahren in der Lage zu beobachten fungici entwickeltdal-Aktivität direkt und gleichzeitig detaillierte Informationen in Bezug auf die Phagozytose, Phagozyten Migration und Hemmung des Pilzwachstums zu erfassen. Zuvor wurde ein Protokoll Echtzeit - Bildgebung als Mittel unter Verwendung veröffentlichten 5 Phagozytose von Candida albicans durch eine Maus - Makrophagen - Zelllinie zu messen. Dieses Konzept wurde nun weiterentwickelt , die Wissenslücke in unserem Verständnis von Aspergillus Interaktionen mit Immunzellen zu adressieren , indem fluoreszierenden Aspergillus reporter (FLARE) Konidien 6, 7, 8 verwendet. Diese Konidien exprimieren einen roten Fluorophor (dsRed) und mit einem zweiten Fluorophor (Alexa Fluor 633) markiert. Sobald ein FLARE Konidie getötet wird, stoppt es produziert dsRed und die restlichen dsRed schwindet, während die AF633 an die Konidien Leuchtstoff- und gebunden bleibt. Dadurch entsteht eine klare Unterscheidung zwischen lebenden und toten fungal Zellen während der Live Cell Imaging und Durchflusszytometrie und ermöglicht Verfolgung des Schicksals der einzelnen Konidien nach ihrer Wechselwirkung mit Immunzellen. Die beschriebenen Assays stellen ein effektives Verfahren der Interaktion zwischen Wirt und Immunzellen Aspergillus Visualisierung und wird in entwirren die zelluläre Signalwege , die für antimykotische Effektormechanismen in angeborenen Immunzellen von beträchtlichem Wert sein. Andere Anwendungen umfassen die Visualisierung , wie Veränderungen in Aspergillus Wachstum, wie zum Beispiel der Umstellung von geschwollenen Konidien ruhen oder von geschwollenen Konidien zu Hyphen, Phagozyten Anerkennung und Funktion beeinflussen. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert, wie menschliche Monozyten und Neutrophilen zu erhalten; wie die FLARE Konidien vorzubereiten; und wie ihre Antworten mit Videomikroskopie zu erfassen und Durchflusszytometrie. Obwohl die Verwendung von menschlichen Immun aus Spenderblut isolierten Zellen wird hier beschrieben, dieseTechnik hat sich ebenso bewährt eine Vielzahl von Maus-Zellpopulationen verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 175</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>10592955</td><td>https://nl.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>40 &micro; m Filter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>MilliQ</td><td>Millipore</td><td>QGARD00R1</td><td>Nanopure Wasser funktioniert ähnlich. http://www.merckmillipore.com/</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Molekularsonden</td><td>B-6352</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Streptavidin-AF633</td><td>Molekulare Sonden&nbsp;</td><td>S-21375</td><td>AF633 ist das bisher einzige getestete Fluorophor, das in Phagosomen sichtbar bleibt. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>EDTA Blutröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455036</td><td>Alle Blutröhrchen mit einem Antikoagulationsmittel sollten wirken. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>http://www3.gehealthcare.com/</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/ HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>CD14 Mikrokügelchen</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>Andere Monozyten-Isolationsmethoden können ebenfalls verwendet werden, wir bevorzugen diese Methode, da sie eine gleichbleibend hohe Reinheit der Monozyten ermöglicht, ohne arbeitsintensiv zu sein. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>MS Säulen</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Siehe Kommentar bei CD14 Mikrokügelchen. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>72400-021</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>CO2 unabhängiges Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific 18045054</td><td></td><td>Notwendig, wenn während der Bildgebung nicht genügend CO2 ausgetauscht wird. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td></tr><tr><td>&micro;-Objektträger 8 Well Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Dies ist die Bildgebungsschüssel, die wir verwenden, aber jede Glasschüssel in der richtigen Größe sollte funktionieren. http://ibidi.com/</td></tr> <tr><td>UltraVIEW VoX 3D-Bildgebungssystem für lebende Zellen</td><td>Perkin Elmer</td><td>L7267000</td><td>Enthält Volocity-Software für die Erfassung und Analyse. http://www.perkinelmer.com/</td></tr> <tr><td>Calcofluor weiß</td><td>Sigma</td><td>18909</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Voriconazol</td><td>Sigma</td><td>PZ0005</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>BD LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Verwendetes Durchflusszytometer. https://www.bdbiosciences.com/</td></tr></tbody></table>

live-imaging von anti-pilz-aktivität von human primary neutrophilen und monozyten in reaktion auf<em&gt; a. fumigatus</em

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilz Erreger invasive Infektionen bei immunsupprimierten Patienten mit einer hohen Letalität. Forschung untersucht immunologische Reaktionen gegen A. fumigatus wird durch den Mangel an einheitlichen und zuverlässigen Tests zur Messung der Anti - Pilz - Aktivität von Immunzellen in vitro beschränkt. Ein neues Verfahren wird beschrieben , um die antimykotische Aktivität von primären Monozyten und Neutrophilen von menschlichen Spendern gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Conidien zu beurteilen. Diese Konidien enthalten eine genetisch dsRed Reportergen codiert wird , die konstitutiv von lebenden FLARE Konidien exprimiert wird, und extern mit Alexa Fluor 633 markiert ist, die zu einer Verschlechterung im Phagolysosom resistent ist, so dass eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten A. fumigatus Konidien ermöglicht. Video-Mikroskopie und Zytometrie werden fließen anschließend verwendet, um die interact zu visualisierenion zwischen Konidien und angeborenen Immunzellen, der Beurteilung fungizide Aktivität, während auch eine Fülle von Informationen über Phagozyten Migration, Phagozytose und die Hemmung des Pilzwachstums bereitstellt. Diese neue Technik hat bereits spannende neue Einblicke in die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zur Verfügung gestellt. Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, die notwendige Mikroskopie einschließlich und Durchflusszytometrie-Einrichtungen und die Fähigkeit, mit menschlichem Spenderblut zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilzen. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren. Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, einschließlich der notwendigen Mikroskopie und Durchflusszytometrie finrichtungen, und die Fähigkeit, die menschlichen Spenderblutes zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilze. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen - Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren.

Repräsentative Ergebnisse sind nach dem beschriebenen Protokoll gezeigt. 1 stellt ein repräsentatives 6 h Lebendzell - Video mit menschlichen Neutrophilen und FLARE Konidien. dsRed (rot) wird durch die Konidien selbst ausgedrückt, während sie mit AF633 (Magenta) markiert wurden. 2 ist ein Bild von einem einzigen Zeitpunkt aus einem ähnlichen Film , wie in Abbildung 1 dargestellt ist , welche die Differenz zwischen lebenden und toten FLARE Konidien. Tote Konidien sind aus lebenden Konidien unterscheiden sich durch ihre dsRed (rot) Signal zu verlieren, während eine helle AF633 (magenta) Fluoreszenz beibehalten wird. A. fumigatus Konidien überleben oft innerhalb von Phagozyten für mehr als 6 Stunden. Daher zu quantifizieren wirksam töten, Durchflusszytometrie Plots für ein 16 h Inkubationsdauer in Abbildung 3 dargestellt ist. Diese Daten wurden mit einem Alveolarmakrophage ce erhaltenll Linie als Beispiel, sondern kann mit einem beliebigen Zelltyp durchgeführt werden. In Abbildung 4 ist die Migration in der ersten Stunde der Stimulation für die menschlichen Neutrophilen sowie deren Geschwindigkeit und die Richtungsbewegung gezeigt. Abbildung 5 zeigt den Prozentsatz der Neutrophilen und Monozyten , die mit 1 eingenommen haben, 2, 3 oder mehr Konidien während Abbildung 6 zeigt die Anzahl der Konidien , Hyphen, die in keimen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> Abbildung 1: Live Zelle Videomikroskopie Film von menschlichen Neutrophilen und FLARE Konidien. 3 ist: Neutrophile wurden aus menschlichem Blut und besät mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1 isoliert. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 h erfasst. Maßstabsbalken = 10 um.A in Video gezoomt wird mit den Kanälen gezeigt getrennt, um die Rolle des FLARE Konidien mit DIC in der oberen linken zu klären, dsRed (rot) in der oberen rechten, AF633 (grün) in der unteren linken und der fusionierten Video in der unteren rechten . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">Bitte klicken Sie hier das Video zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> Abbildung 2: Einzelzeitpunkt Bild den Unterschied zwischen lebenden und toten FLARE Konidien demonstriert. Humane Neutrophile wurden mit Konidien FLARE stimuliert und mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop abgebildet wird. Ein Bild wurde aus den erzeugten Filmen genommen. Tote Konidien aus Hyphen zeichnen sich durch ihre dsRed (rot: rechts oben) verloren Signal, während ihre AF633 Fluoreszenz (grün: unten links) beibehalten wird. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">um</a> die<html> sieht eine größere Version dieser Figur. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> Abbildung 3: Quantifizierung und Validierung von Phagozytose und Abtötung von A. fumigatus Konidien. für 16 h in Gegenwart von Voriconazol: 1-Verhältnis Maus Alveolarmakrophagenzellen (MH-S) wurde mit Konidien FLARE bei einem 1 inkubiert. MH-S-Zellen, die mit lebenden Konidien werden in dem roten Tor (dsRed + AF633 +) gezeigt. MH-S-Zellen, die mit toten Konidien sind in dem blauen Tor (dsRed-AF633 +) gezeigt. Bystander MH-S-Zellen sind in dem Gold-Gate gezeigt. Calcofluor White, ein zellundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff, der an die Pilzzellwand bindet, verwendet wird extrazellulärem Konidien (Calcofluor White +) aus intrazellulären Konidien (Calcofluor White-) zu unterscheiden. Als eine zusätzliche Validierung der Methode ist es, dass die Behandlung mit 2 uM Cytochalasin D hemmt Konidien Aufnahme durch MH-S-Zellen gezeigt.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> Abbildung 4: Migration von menschlichen Neutrophilen und Monozyten gegen A. fumigatus Konidien. 3 ist: Neutrophile wurden aus menschlichem Blut und besät mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1 isoliert. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 Stunden eingefangen. Migration aller einzelnen humanen Neutrophilen pro Feld Tracked wurde mit manuell Tracking - Software gegen ruhende (A) und geschwollene (B) Konidien für 1 h. Daten für 1-Rahmen von Zellen für jede Bedingung des gleichen Spenders. Der mäandernde Faktor (C), ein Maß für directional - Bewegung, und der Geschwindigkeit (D) wurden dann quantifiziert die gleiche Software. Mittelwert ± SEM für 3 Spender mit 30 Zellen pro Spender über 2 unabhängige Experimente dargestellt sind. *: P &lt;0,05 (Welcher korrigiert t-Test). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> Abbildung 5: Die Phagozytose von A. fumigatus Konidien durch menschliche Neutrophile und Monozyten. Neutrophile und Monozyten wurden aus menschlichem Blut isoliert und ausgesät zusammen mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1: 3. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 h erfasst. Die Phagozytose wurde als die Menge von Zellen enthalten, gemessening FLARE Konidien nach 4 h Stimulation. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 Spendern präsentiert und 3 Frames pro Spender über 2 unabhängige Experimente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> Abbildung 6: Hemmung der Keimung von A. fumigatus Konidien von Neutrophilen und Monozyten. Neutrophile und Monozyten wurden aus menschlichem Blut isoliert und ausgesät zusammen mit FLARE Konidien in CO 2 unabhängiges Medium bei einem Verhältnis von 1: 3. Imaging wurde direkt mit einem drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop bei 37 ° C initiiert. Bilder wurden nach 1 min und 55 s-Intervallen über einen Zeitraum von 6 Stunden eingefangen. Die Hemmung der Pilz Keimung wurde durch Messung der Prozentsatz der Konidien untersucht, die Keim hatteinated nach 2, 4 und 6 h der Co-Kultur. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 Spendern präsentiert und 3 Frames pro Spender über 2 unabhängige Experimente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die antifungale Aktivität primärer humaner Immunzellen in Echtzeit mithilfe fluoreszierender Aspergillus-Reporter-Konidien und der Live-Cell-Videomikroskopie zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den Immunantworten gegen Pilzinfektionen in bestimmten Patientengruppen zu beantworten, insbesondere zur angeborenen Immunantwort, die frühzeitig nach der Exposition gegenüber Pilzen auftritt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Identifizierung spezifischer Defekte in der angeborenen und antifungalen Immunität genutzt werden kann, wie beispielsweise Phagozytose, Zellmigration, Abtötung oder Hemmung des Pilzwachstums.Zunächst wird der Aspergillus fumigatus-Stamm AF293, der das fluoreszierende dsRed-Reportergen trägt, auf Agar in zwei T75-Flaschen ausgestrichen. Die Kulturen werden sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert, um etwa 109 Konidien zu erhalten. Nach der Inkubation werden die Kulturen in 20 Milliliter PBS mit 0,05 % Tween 80 aufgenommen und die A. fumigatus-Konidien gesammelt.Anschließend die resultierenden Suspensionen mithilfe eines 40-Mikrometer-Zellsiebs in ein 50-Milliliter-Röhrchen filtrieren, um hyphale Fragmente zu entfernen. Nach dem Filtrieren die Suspensionen 10 Minuten bei 805 × g zentrifugieren. Danach die Überstände verwerfen und die Pellets in 20 Milliliter sterilem PBS resuspendieren.Schließlich die Proben vereinen und die resultierende Suspension ein letztes Mal zentrifugieren. Den Pellet in fünf Milliliter PBS resuspendieren und je ein Milliliter-Aliquot der erhaltenen Konidien-Suspension in Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Die Aliquots bei Raumtemperatur 10 Minuten lang mit 9.300 × g zentrifugieren.Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Konidien-Pellet in einem Milliliter 0,05-molarer Natriumbicarbonatlösung mit einem pH-Wert von 8,3. Um die Konidien zu markieren, geben Sie 10 Mikroliter der Biotin-Stammlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen, bedecken Sie die Probe mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang auf einem Rüttler bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation der biotinmarkierten Probe für 10 Minuten bei 9.300 × g entfernen Sie vorsichtig den Überstand.Suspension des Konidienpellets anschließend in einem Milliliter einer 100-Mikromolar-Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 8,0. Inkubieren Sie diese Suspension eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter sanfter Agitation, um das nicht gebundene Biotin zu deaktivieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 9.300 × g für 10 Minuten.Entfernen Sie vorsichtig das resultierende Überstand, waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter steriler PBS und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS. Geben Sie dann 10 Mikroliter einer Streptavidin-AF633-Stammlösung zu einem Milliliter der Konidialsuspension hinzu. Inkubieren Sie diese Suspension, abgedeckt mit Aluminiumfolie, 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.Zentrifugieren Sie die Probe bei 9.300 ×g für 10 Minuten. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Konidien-Pellet in einem Milliliter PBS. Zählen Sie die Konidien mit einem Hämozytometer bei einer Verdünnung von 1 zu 1.000 und stellen Sie die Konidienkonzentration dann mit CO2-unabhängigem Medium auf 3,6 × 10⁶ Konidien pro Milliliter ein.Schließlich die Suspension in Folie einwickeln und bei vier Grad Celsius lagern. Sammeln Sie eine Probe menschlichen Blutes und verdünnen Sie sie mit PBS. Anschließend verwenden Sie eine Spritze mit einer Stahlnadel, um die Blutprobe mit 15 Milliliter eines Mediums zur Isolierung mononukleärer Zellen zu unterlegen.Zentrifugieren Sie die Probe 20 Minuten lang mit 630 ×g ohne Bremse und mit niedriger Beschleunigung. Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette die mittlere PBMC-Schicht, die sich zwischen der gelben Serum-Schicht und der klaren Lymphozyten-Isolationslösungsschicht befindet. Überführen Sie die gewonnene Suspension anschließend in ein neues 50-Milliliter-Gefäß.Verdünnen Sie die PBMCs mit PBS, um 50 Milliliter Suspension zu erhalten, und waschen Sie die Zellen. Nach dem Waschen mischen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 160 Mikrolitern PBS und 20 Mikrolitern Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Nach der Zählung stellen Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf eine geeignete Konzentration ein, zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 515 × g und resuspendieren Sie sie anschließend mit 40 Mikrolitern Pufferlösung pro 1 × 107 Zellen.Geben Sie 10 Mikroliter CD14 MicroBeads pro 1 × 10⁷ Zellen hinzu und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, wobei Sie die Röhre alle fünf Minuten vorsichtig mischen. Nach der Konjugation waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Pufferlösung pro 1 × 10⁷ Zellen und zentrifugieren die Suspension bei 515 × g für 10 Minuten.Dann bis zu 1 × 10⁸ Zellen in 500 µl Pufferlösung resuspendieren. Eine Säule, die mit einer einzelnen Probe verwendet wird, gemäß Herstelleranweisungen auf einem Magnetseparator befestigen und die Säule einmal mit 500 µl Pufferlösung waschen. 500 µl der Zellsuspension auf die Säule auftragen.Wenn es trocken ist, waschen Sie die Säule dreimal mit Pufferlösung. Setzen Sie ein neues 15-Milliliter-Röhrchen unter die Säule und trennen Sie die Säule vom Magneten. Anschließend eluieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Pufferlösung aus der Säule in das Röhrchen.Die eluierten Zellen waschen und in RPMI-Medium resuspendieren. Nach Einstellung der Zelldichte auf sechs mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter 200 Mikroliter der Suspension in eine 35 Millimeter große Glas-Basiskulturschale geben. Die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 inkubieren.Um Neutrophile zu isolieren, entfernen Sie das gesamte Serum und den größten Teil der Lymphozyten-Isolationslösung aus der Blutprobe, die nach der PBMC-Gewinnung verblieben ist. Achten Sie darauf, den dünnen weißen Belag auf der Oberseite des roten Pellets nicht zu entfernen. Unter Beibehaltung der Zellen auf Eis lysieren Sie anschließend die roten Blutkörperchen und zentrifugieren die verbleibenden Neutrophilen bei 394 × g. Waschen Sie die Zellen danach zweimal mit kaltem PBS und resuspendieren Sie sie anschließend in einem Milliliter eines CO2-unabhängigen Mediums.Für eine Durchflusszytometrie stellen Sie die Zelldichte auf sechs mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter ein und geben 400 Mikroliter der Zellsuspension in eine 24-Well-Platte. Geben Sie 200 Mikroliter der gleichen Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Glas-Boden-Abbildungs-Schale zur mikroskopischen Untersuchung. Um dsRed und Alexa Fluor 633 während der Mikroskopie sichtbar zu machen, heizen Sie den Mikroskop-Heizer vor und schalten Sie das Mikroskop sowie den Computer ein.Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter einer dreimal 10 hoch 6 pro Milliliter enthaltenden FLARE-Konidialsuspension in die entsprechenden Vertiefungen der Imaging-Schale ein. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die FLARE-Konidien hinzugefügt wurden. Befestigen Sie die Imaging-Schale auf dem Mikroskopständer und stellen Sie dann in den Aufnahmeeinstellungen die Laserleistung auf 10 % und die Belichtungszeit auf eine Sekunde ein.Und stellen Sie die Kamerempfindlichkeit so ein, dass ein klares, aber nicht überbelichtetes Bild von dsRed und AF633 entsteht, und legen Sie eine Liste von Objekttischaufnahmepunkten fest. Starten Sie die Bildaufnahme, sobald alle Punkte im Fokus sind, die fluoreszierenden Kanäle optimiert sind und Zyklusdauer sowie Aufnahmedauer eingestellt wurden. Dargestellt sind hier Bilder, die während einer simultanen Kultur von Neutrophilen und FLARE-Konidien aufgenommen wurden.Das grüne fluoreszierende Signal, das der AF633-Färbung entspricht, ist sowohl in lebenden als auch in toten Konidien sichtbar. Dagegen kann die dsRed-Fluoreszenz ausschließlich in lebenden Konidien beobachtet werden. Daher sind unter allen detektierten Konidien nur diejenigen, die gleichzeitig mit beiden Farbstoffen gefärbt sind und als magenta gefärbte Punkte sichtbar werden, lebendig.Die Phagozytose und Abtötung von mit Maus-Alveolarmakrophagen kultivierten A fumigatus-Konidien wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. In der Analyse sind die bystander-Makrophagen mit einem orangefarbenen Gate markiert, während Makrophagen, die mit toten Konidien assoziiert sind und nur für die AF633-Färbung positiv sind, innerhalb des blauen Gates dargestellt werden. Zusätzlich zeigen die toten Konidien keine Calcofluor-White-Färbung, was auf ihre intrazelluläre Lokalisation hinweist.Lebende Konidien, die mit dsRed und AF633 gefärbt wurden, werden durch ein rotes Tor markiert; diese Konidien sind ebenfalls in Makrophagenzellen internalisiert, wie durch die verringerte Calcofluor-Weiß-Färbung belegt wird. Schließlich wurde der Einfluss von A. fumigatus auf die Migration menschlicher Neutrophilen untersucht, wobei eine erhöhte Bewegung und Geschwindigkeit der Immunzellen als Reaktion auf geschwollene Konidien im Vergleich zu ruhenden Konidien sichtbar wurde. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von acht Stunden für eine einzelne Zellpopulation durchgeführt werden.Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung reaktiver Sauerstoffspezies oder die Zytokinese durchgeführt werden, um weitere Informationen zur angeborenen antifungalen Immunantwort in derselben Zellpopulation zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Forschern im Bereich der Pilzimmunologie den Weg, Phagozytose und antifungale Abtötung unter Verwendung von Pilzpathogenen in primären Immunzellen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man innate antifungale Immunantworten primärer menschlicher Immunzellen in Echtzeit mithilfe fluoreszenzmarkierter Aspergillus-Reporter-Konidien und der Live-Cell-Videomikroskopie bewerten kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut gefährlich sein kann und stets geeignete PSA-Maßnahmen getroffen werden sollten, um die Übertragung von Infektionen zu verhindern.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video zeigt die Bildgebung lebender Zellen zur Analyse der antimykotischen Aktivität in menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von fluoreszierenden Aspergillus-Reporterkonidien. Zunächst werden sowohl rote als auch magentafarbene Fluoreszenz in Neutrophilen nachgewiesen, während die rote Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt, was auf den Abbau von Konidien hinweist und die antimykotische Aktivität von Neutrophilen bestätigt.

Echtzeit-Bewertung der antimykotischen Aktivität primärer humaner Immunzellen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.

Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.

Überwachung der NeutrophilenElastase- und Cathepsin-G-Aktivität in menschlichen Sputumproben

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

Lernen Sie die Live-Imaging-Methode zur Untersuchung antifungaler Aktivität humaner primärer Neutrophiler und Monozyten gegenüber Aspergillus fumigatus. Dieses Protokoll ermöglicht Echtzeit-Analysen von Phagozytose und Immunantwort.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf

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