Name: Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Lernen Sie die Analyse der Transkriptionsterminierung bei RNA-Polymerase II in vivo mit dem strangspezifischen Transkription Run-on-Ansatz (TRO) und BrUTP in Hefe. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen mRNA-transkribierenden und pervasiv transkribierenden Polymerasen.

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Die Forschung im Labor von Ansari wurde durch das Forschungsstipendium unterstützt (Nr. MCB 1020911) der National Science Foundation.

Hinweis: Diese Methode wurde in der Forschung Artikel berichtet in Medler, S und Ansari, A. 2 verwendet. 1. Die Anzucht und Ernte der Zellen <ol><li> Starten einer 5 ml - Kultur von Zellen in YPD - Medium (10 g / L Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 2% Dextrose) von einer frisch ausgestrichenen Platte Saccharomyces cerevisiae. </li><li> Wachsen die Zellen über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 ° C und 250 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Verdünnen Sie die über Nacht gewachsenen Kultur 100-mal auf ein endgültiges Volumen von 100 ml in YPD-Medium in einem 250 ml Schikanekolben. HINWEIS: Es wurden insgesamt 100 ml Kultur pro TRO Reaktion benötigt; Wenn mehrere Reaktionen benötigt werden, muss ein größeres Volumen der Kultur verwendet werden. </li><li> Wachsen die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,8-1,0 bei 600 nm (A 600 ~ 0,8-1,0). </li><li> Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 820 xg für 5 min bei 4 ° C in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml eiskaltem TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl) gegeben und 5 min auf Eis inkubieren. </li><li> Zentrifuge bei 820 × g für 5 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. </li></ol> 2. permeabilisierend und Vorbereitung Zellen für die Run-on-Test <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml 0,6% Sarkosyl Lösung durch Auf- und Abpipettieren sanft ein verkürztes P 1000 Spitze verwenden. Übertragen die Zellsuspension auf eine gekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Schütteln, um die Zellen vorsichtig bei 4 ° C für 25 min auf einem Plattformschüttler. HINWEIS: Reaktionsgefäße sollten mit Eis in einem 50 ml konischen Röhrchen verpackt werden, um eine kalte Temperatur zu halten, was die Möglichkeit einer neuen Einleitung Ereignisse zu vermeiden an den Promotor in diesem Stadium auftreten. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 1200 × g für 6 Minuten bei 4 ° C einer Tischkühlzentrifuge verwendet wird. </li><li> Den Überstand vorsichtig absaugen überschüssige Flüssigkeit aus dem pro entfernenmeabilized Zellpellet. </li></ol> 3. Die Transkription Run-on-Reaktion <ol><li> Zugabe von 150 &amp; mgr; l Transkriptions run-on - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM DTT (Dithiothreit), 0,75 mM jeweils von ATP, CTP, GTP und BrUTP, 200 U RNase Inhibitor) auf die permeabilisierten Zellpellet. </li><li> Vorsichtig mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein verkürztes P 200 Spitze mit. HINWEIS: Wenn mehrere Proben verarbeiten, alles auf Eis zu halten, bis alle Proben fertig sind und dann mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Inkubieren für 5 min bei 30 ° C in einem Wasserbad. HINWEIS: Stellen Sie die Zeit der Inkubation zwischen 1 bis 5 min optimale Einbindung von BrUTP in die im Entstehen begriffenen RNA zu gewährleisten. </li><li> Die Reaktion durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l kaltem ready-to-use-RNA-Isolierung Reagenz. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur. </li></ol> 4. RNA-Extraktion <ol><li> In 200 ul Säure gewaschenen Glasperlen in die Zelle Schutzsperreauf (3.4 Schritt), und in einem Vortex-Mischer bei 4 ° C für 20 min kräftig schütteln. </li><li> Stechen Sie den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen eine heiße 22 G-Nadel und legen Sie es auf der Spitze eines 15-ml sterilen konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 1 min bei 4 ° C, um das Zelllysat zu sammeln. Übertragen das Zelllysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen 500 ul kaltem RNA Isolation Reagenz und 200 &amp; mgr; l Chloroform zu dem Zelllysat. Mischen Sie den Inhalt auf einem Vortex-Mixer und Zentrifuge bei 16.168 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Ein gleiches Volumen von kaltem Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5. Kräftig schütteln auf einem Vortex-Mischer und Zentrifuge bei 16.168 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase, die RNA auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 4.6 zwei weitere Male. </li><li> Um die endgültige RNA-haltige wässrige Phase, fügen 5 M NaCl stock eine Endkonzentration von 0,3 M zu erhalten, das Volumen von kaltem Ethanol In 3 mal die RNA auszufällen. <ol><li> Inkubieren für 1 h oder über Nacht bei -20 ° C. HINWEIS: Führen Sie die Schritte 4,9-4,11, während die Anti-BrdU-Perlen zum Blockieren inkubiert werden (siehe Schritt 5.3). </li></ol></li><li> Zentrifuge bei 16.168 xg für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren RNA-Pellet in 100 ul DEPC (Diethylpyrocarbonat) Wasser. </li><li> Verwenden Sie eine RNA-Isolierung Mini-Kit, um die RNA aus den unincorporated BrUTP Nukleotide zu trennen. Eluieren der RNA von der Säule mit 100 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. </li><li> Inkubieren Sie die RNA in einem 65 ° C Wasserbad für 5 min und dann übertragen auf Eis für mindestens 2 min. </li></ol> 5. Affinitätsreinigung von BrUTP-markierten RNA <ol><li> Bis 25 &amp; mgr; l Anti-BrdU besiedelt beads, 500 &amp; mgr; l 0,25x SSPE (Natrium Saline Phosphate EDTA) Bindungspuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH 2 PO 4 </sub&gt;, 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Zentrifuge bei 200 × g für 30 s bei 4 ° C und entfernt den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.1 dreimal. </li><li> In 500 l Blocking-Puffer (1x Bindungspuffer, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrareinem Rinderserumalbumin (BSA)) zu den Perlen und leicht schütteln mit 1 - 2 h bei 4 ° C auf einem Plattformschüttler. </li><li> Waschen der Kügelchen zweimal mit 500 ul Bindungspuffer, wie in Schritt 5.1 beschrieben. </li><li> In 400 &amp; mgr; l Bindungspuffer an die Kügelchen. </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l RNA (aus Schritt 4.11) direkt an die Kügelchen. Inkubiere unter leichtem Schütteln für 1 - bei 4 ° C 2 h auf einem Plattformschüttler. </li><li> Waschen der Kügelchen nacheinander mit 500 ul Bindungspuffer, 500 &amp; mgr; l Puffer mit niedrigem Salz (0,2X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul Hochsalzpuffer (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl) und zweimal mit 500 ul TET-Puffer (1x TE, 0,05% Tween), Verspinnen bei200 xg für 30 s bei 4 ° C zwischen jedem Waschen. </li><li> Eluieren die BrUTP-markierte RNA aus Perlen nacheinander zweimal mit 150 &amp; mgr; l und einmal mit 200 &amp; mgr; l Elutionspuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), durch Inkubieren für 4 min bei 42 ° C in einem Wasserbad mit einer kurzen Spin gefolgt Perlen von dem Überstand zu trennen. </li></ol> 6. Fällung von BrUTP Beschriftete RNA <ol><li> Fügen 500 ul kaltem Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4 - 5 an den affinitätsgereinigten BrUTP markierte RNA. Mit Hilfe eines Vortex-Mixer und Zentrifuge bei 16.168 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zugabe von 5 M NaCl Lager um eine Endkonzentration von 0,3 M und 3-fachen Volumen von kaltem Ethanol zu erhalten, die RNA auszufällen. </li><li> Inkubieren bei -20 ° C über Nacht. </li><li> Sammeln des ausgefällten RNA durch Zentrifugation bei 16.168 xg für 30 min bei 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen für 10 min. </li><li> Resuspendieren RNA-Pellet in 26 &amp; mgr; l DEPC-Wasser. </li><li> Bestimmen die endgültige RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen wird. Außerdem bestimmen die 260/280 Verhältnis. Ein Verhältnis ~ 2 ist kennzeichnend für eine reine RNA Probe. </li><li> Speichern die RNA-Proben in Aliquots bei -80 ° C bis zur cDNA-Synthese benötigt wird. </li></ol> 7. reverse Transkription von BrUTP markierte RNA <ol><li> Stellen Sie die RNA-Konzentration auf 100 ng / &amp; mgr; l mit DEPC Wasser. Verwenden Sie 0,5 ug RNA für jede cDNA-Synthesereaktion. HINWEIS: Die Konzentration der RNA-Matrize 0,5 bis 1,0 &amp; mgr; g variieren kann optimal cDNA-Synthese zu erreichen. </li><li> Reverse Transkription der RNA unter Verwendung von mehreren Rückwärtsprimer konstruiert stromabwärts des Poly (A) -Stelle (Terminationsstelle) , wie in 3A gezeigt. </li><li> Zu jeder reverse Transkriptionsreaktion, fügen Sie 5 ul RNA template (0,5 ug), 1 ul dNTP - Mix (jeweils 10 mM), 2 &amp; mgr; l reverse Primer C, D, E, F oder G (50 &amp; mgr; M jeweils) und nukleasefreiem Wasser (siehe 3A). Das endgültige Reaktionsvolumen in jedem Röhrchen 13 &amp; mgr; l. HINWEIS: Die Anzahl der reversen Transkriptionsreaktionen werden für die cDNA-Synthese verwendet, von der Anzahl der Rückwärtsprimer abhängen. Zum Beispiel für ASC1 fünf Reverse - Primer verwendet wurden und daher fünf Reverse Transkriptionsreaktionen wurden eingerichtet. Beschriften der Rohre als C, D, E, F und G auf der Basis der Reverse-Primer für die cDNA-Synthese verwendet. </li><li> Inkubieren der Röhrchen RNA-Matrize, dNTP-Mix und Primern in einem Thermocycler bei 65 ° C für 5 min mit einer beliebigen sekundären strukturellen Konformation zu entfernen, und dann Abkühlen auf 4 ° C für mindestens 2 min. </li><li> 1 ul reverse Transkriptase (200 U / &amp; mgr; l), 4 &amp; mgr; l Puffer und 2 ul 0,1 M DTT in jedes Röhrchen, enthaltend die RNA-Matrize und Primer (Schritt 7.4). Mix von sanft bis Pipettieren und ab. </li><li> Führen der reversen Transkription, indem die Reaktionsmischung in einem Thermocycler bei 42 ° C inkubiert für 60 min. </li><li> Inaktivierung der reversen Transkriptase bei 65 ° C für 20 min. </li><li> Lagern Sie die cDNA bei -20 ° C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt. </li></ol> 8. Amplification of cDNA <ol><li> Führen Sie die PCR - Reaktion zur Amplifikation von jeder cDNA - Präparation ( mit der Bezeichnung C, D, E, F und G für ASC1) aus Schritt 7.8 wie folgt: 3,0 &amp; mgr; l cDNA - Matrize aus Schritt 7.8 und 1.0 &amp; mgr; l Vorwärts - Primer B (10 &amp; mgr; M), 1,0 &amp; mgr; l Rückwärtsprimer C oder D oder E oder F oder G (10 uM), 2,5 ul 10x - Polymerase PCR - Puffer, 0,5 ul dNTP - Mix (jeweils 10 mM), 1,0 &amp; mgr; l MgCl 2 (2,5 mM) 15,5 &amp; mgr; l PCR-Wasser, und 0,5 ul thermostabile Polymerase-Enzym. HINWEIS: Verschiedene Verdünnungen von cDNA-Matrize im Bereich von 1: 5 bis 1: 100 getestet werden sollte, die PCR Produktausbeute zu optimieren. Ein einzelner Promotor-proximalen Vorwärts-Primer werden verwendet, um cDNA zu verstärkenmit verschiedenen Reverse-Primer erhalten. So wurde beispielsweise für ASC1 in Kombination mit fünf Rückwärtsprimer von C bis G ein einziger Vorwärtsprimer B in der Nähe des Promotors verwendet. BC, BD, BE, BF und BG in Rohren als C, D, E, F und G jeweils gekennzeichnet sind, verwendet wurden , wie in 3A gezeigt. </li><li> Führen Sie die PCR die folgenden thermischen Zyklus Parametern: 1 Zyklus 95 ° C für 2 min (Hot-Start für die Aktivierung der Polymerase), 30 - 40 Zyklen 95 ° C für 30 s (Denaturierung), 54 ° C für 15 s (Annealing) , 68 ° C für 1 min (Verlängerung) und 1 Zyklus 68 ° C für 5 min (final Extension). HINWEIS: Die Glühtemperatur auf den spezifischen Primern variieren je verwendet wird und die Verlängerungszeit in Abhängigkeit von der erwarteten Produktgröße variieren. </li><li> Trenne die PCR-Produkts durch Elektrophorese auf 0,8%, 1,5% bzw. 2% Agarose-Gelen auf der erwarteten Größe des Produkts abhängig. </li><li> Quantifizierung der PCR - Produkt wie in El Kaderi et al. 2012 11. HINWEIS: Alternativ können Sie Echtzeit-RT-qPCR-Strategie die Menge der im Entstehen begriffenen Transkripte zu quantifizieren. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die strangspezifischen TRO hier verwendete Protokoll wurde aus dem Protokoll für GRO-Seq (Global Run On-Sequenzierung) Analyse in Säugetierzellen 12 verwendet angepasst. Wir modifizierten erfolgreich das Protokoll in Bäckerhefe im Entstehen begriffenen Transkription zu studieren. Um insbesondere die Transkriptionsterminierungs Defekt zu analysieren, passten wir das Protokoll weiter, indem sie von der RNA-Hydrolyse Schritt befreien. Dies ermöglichte es uns, um speziell die volle Länge im Entstehen...

Die eukaryotischen Transkription Zyklus besteht aus drei Hauptschritten; Initiation, Elongation und Termination. Die Beendigung der Transkription durch RNA - Polymerase II besteht aus zwei verschiedenen, voneinander abhängigen Schritten 3. Der erste Schritt beinhaltet die Spaltung, die Polyadenylierung und die Freisetzung von mRNA aus der Vorlage, und wird sofort durch den zweiten Schritt, gekennzeichnet durch Ausrücken der Polymerase aus der Vorlage. Ordnungsgemäße Beendigung ist entscheidend für die Wiederverwertung der Polymerase während der Initiierung / Reinitiierung der Transkription, für eine Interferenz mit der Transkription der nachgeschalteten Gene zu verhindern, und für aberrant Transkription unter Kontrolle zu halten , indem die Transkription des Begrenzens pervasive nicht-codierende RNA 4, 5. Trotz der jüngsten Fortschritte ist Kündigung bei weitem am wenigsten verstandenen Schritt der RNA-Polymerase II Transkriptionszyklus. Eine zuverlässige Abschlusstest ist von wesentlicher Bedeutung für die Untersuchung des Mechanismus Sekundärmarkg Termination der Transkription durch RNA - Polymerase II in vivo. Eine Reihe von experimentellen Ansätze werden verwendet, um die Beendigung Defekt in einem aktiv transkribierten Gen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. Dazu zählen Northern Blot, Terminationsfaktor ChIP (Chromatin Immunopräzipitation) und die traditionelle TRO-Test. Jede dieser Techniken haben einige Vorteile und Nachteile. Die traditionelle TRO - Assay verwendet werden , um verlässliche und sensibles Vorgehen zum Nachweis eines Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo 1. Dieser Assay lokalisiert die transkriptionell aktive Polymerase-Moleküle auf den verschiedenen Regionen eines Gens in der Zelle. Unter normalen Bedingungen zeigt der Assay transkriptionell Eingriff Polymerasemoleküle streng zwischen dem Promotor und Terminator - Region des Gens (1A) verteilt. Nach Beendigung defekte, jedoch ist die Polymerase nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen,und in dem Bereich stromabwärts des 3&#39; - Endes des Gens (1B) detektiert. Eine Transkriptions - Terminationssequenz Defekt in Gegenwart eines Sinnes Transkribieren Polymerase manifestiert , die aus der Promotor-proximalen Bereich eingeleitet, und nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen, setzt die Region stromabwärts von dem 3&#39; - Ende eines Gens transkribiert , wie in Abbildung gezeigt 2A. Mit der Erkenntnis , dass die eukaryotische Genom es überwältigend Pervasive Transkription in Sinn sowie Antisense - Richtungen in und um ein Gen , 6, 7, 8, 9, 10, wurde bald klar zeigt , dass die traditionelle TRO - Test nicht , wenn die Polymerase - Signal erkennen kann stromabwärts eines Gens stellt einen Promotor initiierte Transkript (2A) oder eine anomale RNA , die som initiiertewhere in der Mitte des Gens , oder stromabwärts des Terminators Element (2B) oder der Polymerase - Transkription in der anti-sense - Richtung vom 3&#39; - Ende des Gens (Figur 2C). Die strangspezifischen TRO-Assay unter Verwendung BrUTP hier beschriebenen unterscheiden, wenn die beobachtete Überlesen Polymerase Signal Promotor initiierte erweiterten Sinne mRNA oder ein Antisense-Transkript darstellt, die stromabwärts des Gens unter Prüfung eingeleitet. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich verwendet in Bäckerhefe 2 die Rolle der Kin28 Kinase in Termination der Transkription zu demonstrieren. Der Einsatz der Ansatz hier zeigen wir , dass Rna14 für die Beendigung der Transkription von ASC1 in Bäckerhefe erforderlich ist.

<table><tbody><tr><td>Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor, menschliche Plazenta</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU-Kügelchen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>oder ein gleichwertiges</td></tr><tr><td>Enzym Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>oder ein gleichwertiges Enzym</td></tr><tr><td>5-Bromouridin 5' Triphosphat Natriumsalz</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s rückwärts</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s rückwärts</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

die analyse der beendigung der transkription unter verwendung von brutp strangspezifische transkription run-on (tro) ansatz

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo zu erkennen. Die strangspezifischen TRO-Protokoll BrUTP hier beschrieben ist eine leistungsfähige experimentelle Ansatz für die Transkriptionsterminierungs Defekt unter physiologischen Bedingungen zu analysieren. Wie das traditionelle TRO - Assay beruht auf der Gegenwart einer transkriptionell aktiven Polymerase über das 3&#39; - Ende des Gens als ein Indikator für eine Transkriptions - Terminationssequenz Defekt 1. Es überwindet zwei große Probleme mit dem traditionellen TRO-Test festgestellt. Erstens kann sie erkennen, ob der Polymerase durch das Endsignal liest die ist, die Transkription von dem Promotor-proximalen initiiert Region oder wenn es einfach ist, die eine pervasively Transkribieren Polymerase, die unspezifisch von irgendwo in dem Körper eingeleitet bzw. das 3&#39; Ende des Gens. Zweitens kann es zu unterscheiden, ob die transcriptionsaktive Polymerase-Signal über dieTerminatorregion ist wirklich die Readthrough Sense-mRNA transkribiert Polymerase oder ein Terminator-initiierte nicht-codierende anti-sense RNA-Signal. Kurz gesagt umfasst das Protokoll die exponentiell wachsenden Hefezellen durchdringbar, so dass die Transkripte , die in Gegenwart des BrUTP Nukleotid zu verlängern in vivo initiierten BrUTP-markierte RNA durch die Affinität Ansatz Reinigung in umgekehrter gereinigter naszierende RNA und Amplifizieren der cDNA unter Verwendung Transkribieren strangspezifischen Primern den Promotor und die Terminator - Regionen des 2 - Gens flankieren.

Um die Anwendbarkeit des BrUTP strangspezifische TRO Verfahren bei der Erkennung eines Transkriptionsterminierungs Defekt zeigen, haben wir eine Beendigung-defekt, temperaturempfindliche Mutante von RNA14 rna14-1 genannt. Die Rolle der Rna14 in Beendigung der Transkription durch RNA - Polymerase II wurde mit der traditionellen TRO - Test gezeigt , dass RNA in der Terminator-proximalen Bereich ausgewählter Gene 1 nachgewiesen. Der Nachweis von RNA...

Wir beschreiben einen grundlegenden experimentellen Ansatz zur Analyse der Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase II in vivo unter Verwendung von BrUTP durch den strangspezifischen Transkriptions-Run-on-Ansatz (TRO) in knospenden Hefen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Transkriptionsbeendigung durch andere RNA-Polymerasen sowohl in Hefe als auch in höheren Eukaryoten zu untersuchen.

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase in knospenden Hefen unter in vivo-Bedingungen durch den strangspezifischen Transkriptionslauf beim Ansatz zu untersuchen. Diese Methode hilft bei der Beantwortung der Schlüsselfrage, ob die transkriptionell aktive Polymerase, die über die drei Primzahlen des Gens hinaus nachgewiesen wird, diejenige ist, die aus der Promotorregion initiiert wurde. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine MRNA-transkribierende Polymerase von einer pervasiv transkribierenden Polymerase unterscheiden kann, die Transkriptionen initiiert hat und sich am drei primierenden Ende des Gens befindet.Diese Technik kann erweitert werden, um die Beendigung der Transkription durch andere RNA-Polymerasen und Hefen zu untersuchen, da die Terminierung durch verschiedene Polymerasen konserviert ist. Obwohl diese Methode einen Einblick in die genaue Rolle von Terminationsfaktoren im Hefetranskriptionszyklus geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung der Terminierung in höheren Eukaryoten ausgeweitet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Zellpermeabilisierung und der Transkription, die auf Stopps ausgeführt wird, da sie eine sorgfältige Ausführung erfordern und naszierende Transkripte auch schwer zu reinigen sein können.Die Idee zu dieser Methode hatten wir ursprünglich aus dem GRO-Seek-Ansatz, der eine genomweite Momentaufnahme der Position transkriptionell aktiver Polymerasen auf strangspezifische Weise liefert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Transkriptionslauf und die RNA-Aufreinigung aufgrund der geringen Menge und der instabilen Natur der entstehenden Transkripte schwierig durchzuführen sind. Bevor die Transkription gestartet wird, führen Sie die Reaktion, das Wachstum, die Ernte und die Permeabilisierung exponentiell wachsender Hefezellen durch, um eine permeabilisierte Zellpalette zu erhalten.Um die Reaktion zu starten, fügen Sie der permeabilisierten Zellpalette 150 Mikroliter Transkription auf Puffer hinzu. Mit einer abgeschnittenen P-200-Spitze vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Lege die Probe auf Eis.Nachdem alle Proben im Transkriptionslauf auf Puffer resuspendiert wurden, inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem Wasserbad. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe 500 Mikroliter kaltes, gebrauchsfertiges RNA-Isolationsreagenz hinzufügen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Beginnen Sie das RNA-Extraktionsverfahren, indem Sie 200 Mikroliter säuregewaschene Glasperlen zu jeder Zellsuspension hinzufügen und 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius in einem Wirbelmischer kräftig schütteln. Verwenden Sie nach 20 Minuten eine heiße 22-Gauge-Nadel, um den Boden jedes Mikrozentrifugenröhrchens zu durchstechen, und platzieren Sie das Röhrchen auf einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 300-fachem G und überführen Sie das Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Geben Sie 500 Mikroliter kaltes RNA-Isolationsreagenz und 200 Mikroliter Chloroform zum Zelllysat. Mischen Sie den Inhalt auf dem Vortex-Mischer und zentrifugieren Sie dann bei 16, 168 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie die gleiche Menge kalten Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu. Auf dem Vortex-Mischer kräftig schütteln und dann bei 16, 168 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Eine gleiche Menge kalten Phenolchloroform-Isoamylalkohol zugeben, vortexen und erneut zentrifugieren. Zu der endgültigen RNA, die wässrige Phase enthält, wird ein geeignetes Volumen eines fünf molaren Natriumchloridbestands hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3 molaren zu erhalten. Fügen Sie das dreifache Volumen an kaltem Ethanol hinzu, um die RNA auszufällen.Inkubieren Sie eine Stunde lang oder über Nacht bei 20 Grad Celsius. Wenn die RNA-Fällung abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie bei 16, 168 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die RNA-Palette in 100 Mikrolitern DEPC-Wasser.Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um die RNA von den nicht eingebauten Bromouridintriphosphat-Nukleotiden zu trennen, und eluieren Sie die RNA aus der Säule mit 100 Mikrolitern RNAse freiem Wasser. Inkubieren Sie die RNA fünf Minuten lang in einem 65 Grad heißen Wasserbad. Und dann mindestens zwei Minuten lang auf Eis legen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Anti-Brom-DU-Kügelchen vorbereiten, während die RNA ausgefällt wird. Für jede Probe werden 500 Mikroliter 0,25 x Natriumkochsalzphosphat EDTA-Bindungspuffer zu 25 Mikrolitern abgesetzten Kügelchen hinzugefügt. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius bei 200 mal G und entfernen Sie den Überstand.Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit dem Bindepuffer. Nachdem Sie den Überstand aus der dritten Wäsche entfernt haben, geben Sie 500 Mikroliter Blocking-Puffer zu den Kügelchen und schütteln Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Plattformschüttler. Waschen Sie die Kügelchen noch zwei Mal mit 500 Mikrolitern Bindepuffer.Entfernen Sie den Überstand aus der zweiten Wäsche und geben Sie 400 Mikroliter Bindepuffer zu den Kügelchen. Übertragen Sie 100 Mikroliter RNA direkt auf die Kügelchen. Inkubieren Sie unter sanftem Schütteln für ein bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Plattformschüttler.30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius mit dem 200-fachen G drehen und dann den Überstand entfernen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Bindepuffer zu den Kügelchen. Bei 200 mal G für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius drehen und den Überstand entfernen.Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise nacheinander mit Bindepuffer, Puffer mit niedrigem Salzgehalt, Puffer mit hohem Salzgehalt und zweimal mit TET-Puffer. Um die mit Bromouridintriphosphat markierte RNA aus den Kügelchen zu eluieren, fügen Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie vier Minuten lang bei 42 Grad Celsius in einem Wasserbad. Schleudere kurz nach unten und sammle den Überstand ein.Auf diese Weise wird zweimal nacheinander mit 150 Mikrolitern und einmal mit 200 Mikrolitern Elutionspuffer eluiert. Aus jeder Probe sollten etwa 500 Mikroliter affinitätsgereinigte, mit Bromouridintriphosphat markierte RNA gewonnen werden. Um die affinitätsgereinigte, mit Bromouridintriphosphat markierte RNA auszufällen, fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter kaltes Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu.Vortexen und zentrifugieren bei 16, 168 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie das entsprechende Volumen eines fünfmolaren Natriumchloridstocks hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 molar zu erhalten.Fügen Sie dann das dreifache Volumen an kaltem Ethanol hinzu. Über Nacht bei 20 Grad Celsius inkubieren, um die RNA auszufällen. Am folgenden Tag wird die gefällte RNA durch Zentrifugation bei 16, 168 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius gesammelt.Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Palette 10 Minuten an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie die RNA-Palette in 26 Mikrolitern DEPC-Wasser. Bestimmen Sie die endgültige RNA-Konzentration, indem Sie die Extinktion bei 260 Nanometern mit einem Spektralphotometer messen.Lagern Sie die RNA-Proben und Aliquots bei 80 Grad Celsius, bis sie für die cDNA-Synthese benötigt werden. Der Bromouridintriphosphat-Strang-spezifische Transkriptionslauf beim Ansatz wurde verwendet, um den Bedarf an RNA 14 für die Beendigung der Transkription des ASC1-Gens in knospenden Hefen zu testen. Bromouridintriphosphat-markierte RNA aus der RNA-14-1-Mutante und ihren isogenen Wildtyp-Zellen wurde aufgereinigt und mit den Primern C, D, E, F und G reverse-transkribiert. Die entsprechende cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primerpaare B und C, B und D, B und E, B und F sowie B und G amplifiziert und auf Agarosegelen fraktioniert.Das Vorhandensein von PCR-amplifizierten Produkten aus den Primerpaaren B und E, B und F sowie B und G in der Mutante spiegelt einen Phänotyp des Terminations-Readthroughs wider. In den Wildtyp-Zellen war der Transkriptionslauf auf Signal jedoch bis zum Terminatorelement begrenzt, und es gab keine nachweisbare Transkription auf Signal außerhalb der Terminatorregion. Diese Grafik zeigt die Quantifizierung der Gele mit fünf S-RNAs als Normalisierungskontrolle.Der Nachweis von Promotor-initiierten naszierenden Transkripten, die das Terminationssignal in der Mutante, aber nicht in den Wildtyp-Zellen durchlesen, bestätigt, dass RNA 14 ein Terminationsfaktor ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Transkriptionslauf bei der Reaktion entscheidend ist, um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. GRO seek, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die genomweite Rolle eines Faktors bei der Terminierung zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transkription, um die Terminierung durch andere RNA-Polymerasen in Hefe und höheren eukaryotischen Systemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Transkriptionen durchführen, Reaktionen ausführen und entstehende markierte Transkripte aufreinigen.Vergessen Sie nicht, dass die RNA extrem instabil sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, das Halten der Temperatur um vier Grad Celsius und die Verwendung von RNAse freien Mitteln getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

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Genetics

Genetik

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