Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase in knospenden Hefen unter in vivo-Bedingungen durch den strangspezifischen Transkriptionslauf beim Ansatz zu untersuchen. Diese Methode hilft bei der Beantwortung der Schlüsselfrage, ob die transkriptionell aktive Polymerase, die über die drei Primzahlen des Gens hinaus nachgewiesen wird, diejenige ist, die aus der Promotorregion initiiert wurde. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine MRNA-transkribierende Polymerase von einer pervasiv transkribierenden Polymerase unterscheiden kann, die Transkriptionen initiiert hat und sich am drei primierenden Ende des Gens befindet.

Diese Technik kann erweitert werden, um die Beendigung der Transkription durch andere RNA-Polymerasen und Hefen zu untersuchen, da die Terminierung durch verschiedene Polymerasen konserviert ist. Obwohl diese Methode einen Einblick in die genaue Rolle von Terminationsfaktoren im Hefetranskriptionszyklus geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung der Terminierung in höheren Eukaryoten ausgeweitet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Zellpermeabilisierung und der Transkription, die auf Stopps ausgeführt wird, da sie eine sorgfältige Ausführung erfordern und naszierende Transkripte auch schwer zu reinigen sein können.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir ursprünglich aus dem GRO-Seek-Ansatz, der eine genomweite Momentaufnahme der Position transkriptionell aktiver Polymerasen auf strangspezifische Weise liefert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Transkriptionslauf und die RNA-Aufreinigung aufgrund der geringen Menge und der instabilen Natur der entstehenden Transkripte schwierig durchzuführen sind. Bevor die Transkription gestartet wird, führen Sie die Reaktion, das Wachstum, die Ernte und die Permeabilisierung exponentiell wachsender Hefezellen durch, um eine permeabilisierte Zellpalette zu erhalten.

Um die Reaktion zu starten, fügen Sie der permeabilisierten Zellpalette 150 Mikroliter Transkription auf Puffer hinzu. Mit einer abgeschnittenen P-200-Spitze vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Lege die Probe auf Eis.

Nachdem alle Proben im Transkriptionslauf auf Puffer resuspendiert wurden, inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem Wasserbad. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe 500 Mikroliter kaltes, gebrauchsfertiges RNA-Isolationsreagenz hinzufügen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Beginnen Sie das RNA-Extraktionsverfahren, indem Sie 200 Mikroliter säuregewaschene Glasperlen zu jeder Zellsuspension hinzufügen und 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius in einem Wirbelmischer kräftig schütteln. Verwenden Sie nach 20 Minuten eine heiße 22-Gauge-Nadel, um den Boden jedes Mikrozentrifugenröhrchens zu durchstechen, und platzieren Sie das Röhrchen auf einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 300-fachem G und überführen Sie das Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie 500 Mikroliter kaltes RNA-Isolationsreagenz und 200 Mikroliter Chloroform zum Zelllysat. Mischen Sie den Inhalt auf dem Vortex-Mischer und zentrifugieren Sie dann bei 16, 168 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie die gleiche Menge kalten Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu. Auf dem Vortex-Mischer kräftig schütteln und dann bei 16, 168 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Eine gleiche Menge kalten Phenolchloroform-Isoamylalkohol zugeben, vortexen und erneut zentrifugieren. Zu der endgültigen RNA, die wässrige Phase enthält, wird ein geeignetes Volumen eines fünf molaren Natriumchloridbestands hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3 molaren zu erhalten. Fügen Sie das dreifache Volumen an kaltem Ethanol hinzu, um die RNA auszufällen.

Inkubieren Sie eine Stunde lang oder über Nacht bei 20 Grad Celsius. Wenn die RNA-Fällung abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie bei 16, 168 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die RNA-Palette in 100 Mikrolitern DEPC-Wasser.

Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um die RNA von den nicht eingebauten Bromouridintriphosphat-Nukleotiden zu trennen, und eluieren Sie die RNA aus der Säule mit 100 Mikrolitern RNAse freiem Wasser. Inkubieren Sie die RNA fünf Minuten lang in einem 65 Grad heißen Wasserbad. Und dann mindestens zwei Minuten lang auf Eis legen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Anti-Brom-DU-Kügelchen vorbereiten, während die RNA ausgefällt wird. Für jede Probe werden 500 Mikroliter 0,25 x Natriumkochsalzphosphat EDTA-Bindungspuffer zu 25 Mikrolitern abgesetzten Kügelchen hinzugefügt. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius bei 200 mal G und entfernen Sie den Überstand.

Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit dem Bindepuffer. Nachdem Sie den Überstand aus der dritten Wäsche entfernt haben, geben Sie 500 Mikroliter Blocking-Puffer zu den Kügelchen und schütteln Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Plattformschüttler. Waschen Sie die Kügelchen noch zwei Mal mit 500 Mikrolitern Bindepuffer

Entfernen Sie den Überstand aus der zweiten Wäsche und geben Sie 400 Mikroliter Bindepuffer zu den Kügelchen. Übertragen Sie 100 Mikroliter RNA direkt auf die Kügelchen. Inkubieren Sie unter sanftem Schütteln für ein bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Plattformschüttler.

30 Sekunden lang bei vier Grad Celsius mit dem 200-fachen G drehen und dann den Überstand entfernen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Bindepuffer zu den Kügelchen. Bei 200 mal G für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius drehen und den Überstand entfernen.

Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise nacheinander mit Bindepuffer, Puffer mit niedrigem Salzgehalt, Puffer mit hohem Salzgehalt und zweimal mit TET-Puffer. Um die mit Bromouridintriphosphat markierte RNA aus den Kügelchen zu eluieren, fügen Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie vier Minuten lang bei 42 Grad Celsius in einem Wasserbad. Schleudere kurz nach unten und sammle den Überstand ein.

Auf diese Weise wird zweimal nacheinander mit 150 Mikrolitern und einmal mit 200 Mikrolitern Elutionspuffer eluiert. Aus jeder Probe sollten etwa 500 Mikroliter affinitätsgereinigte, mit Bromouridintriphosphat markierte RNA gewonnen werden. Um die affinitätsgereinigte, mit Bromouridintriphosphat markierte RNA auszufällen, fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter kaltes Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu.

Vortexen und zentrifugieren bei 16, 168 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie das entsprechende Volumen eines fünfmolaren Natriumchloridstocks hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 molar zu erhalten.

Fügen Sie dann das dreifache Volumen an kaltem Ethanol hinzu. Über Nacht bei 20 Grad Celsius inkubieren, um die RNA auszufällen. Am folgenden Tag wird die gefällte RNA durch Zentrifugation bei 16, 168 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius gesammelt.

Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Palette 10 Minuten an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie die RNA-Palette in 26 Mikrolitern DEPC-Wasser. Bestimmen Sie die endgültige RNA-Konzentration, indem Sie die Extinktion bei 260 Nanometern mit einem Spektralphotometer messen.

Lagern Sie die RNA-Proben und Aliquots bei 80 Grad Celsius, bis sie für die cDNA-Synthese benötigt werden. Der Bromouridintriphosphat-Strang-spezifische Transkriptionslauf beim Ansatz wurde verwendet, um den Bedarf an RNA 14 für die Beendigung der Transkription des ASC1-Gens in knospenden Hefen zu testen. Bromouridintriphosphat-markierte RNA aus der RNA-14-1-Mutante und ihren isogenen Wildtyp-Zellen wurde aufgereinigt und mit den Primern C, D, E, F und G reverse-transkribiert. Die entsprechende cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primerpaare B und C, B und D, B und E, B und F sowie B und G amplifiziert und auf Agarosegelen fraktioniert.

Das Vorhandensein von PCR-amplifizierten Produkten aus den Primerpaaren B und E, B und F sowie B und G in der Mutante spiegelt einen Phänotyp des Terminations-Readthroughs wider. In den Wildtyp-Zellen war der Transkriptionslauf auf Signal jedoch bis zum Terminatorelement begrenzt, und es gab keine nachweisbare Transkription auf Signal außerhalb der Terminatorregion. Diese Grafik zeigt die Quantifizierung der Gele mit fünf S-RNAs als Normalisierungskontrolle.

Der Nachweis von Promotor-initiierten naszierenden Transkripten, die das Terminationssignal in der Mutante, aber nicht in den Wildtyp-Zellen durchlesen, bestätigt, dass RNA 14 ein Terminationsfaktor ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Transkriptionslauf bei der Reaktion entscheidend ist, um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. GRO seek, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die genomweite Rolle eines Faktors bei der Terminierung zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transkription, um die Terminierung durch andere RNA-Polymerasen in Hefe und höheren eukaryotischen Systemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Transkriptionen durchführen, Reaktionen ausführen und entstehende markierte Transkripte aufreinigen.

Vergessen Sie nicht, dass die RNA extrem instabil sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, das Halten der Temperatur um vier Grad Celsius und die Verwendung von RNAse freien Mitteln getroffen werden sollten.